Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica

70 332 0
  • Loading ...
1/70 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 31/03/2015, 16:09

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, CHUYỂN HÓA SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia lipolytica LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, CHUYỂN HÓA SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia lipolytica Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ HOÀI TRÂM PGS.TS. NGÔ TỰ THÀNH Hà Nội - 2014 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm và PGS.TS Ngô Tự Thành những người đã trực tiếp hướng dẫn về khoa học và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi nghiên cứu, hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ Bộ môn Công nghệ Enzim và Protein, Viện Công nghiệp Thực phẩm-Bộ Công thương đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và chia sẻ với tôi trong thời gian thực tập. Nhân dịp này, tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, và các thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học đã động viên, chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và tạo những điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Hà Nội tháng 6-2014. Học viên: Nguyễn Xuân Việt Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 MỤC LỤC 2 DANH MỤC HÌNH VẼ 5 DANH MỤC BẢNG 6 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7 MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Nấm men Yarrowia lipolytica 4 1.2. Chất thơm từ lipit 7 1.2.1. Vài nét về các chất thơm dùng trong công nghiệp thực phẩm 7 1.2.2. Chất thơm -decalactone 8 1.2.3. Các con đƣờng tạo thành chất thơm γ-decalactone ở vi sinh vật 10 1.3. Chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone bằng các chủng nấm men chuyển hóa chất béo 12 1.3.1. Nguồn cơ chất 12 1.3.2. Các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone 14 1.4. Ứng dụng của nấm men chuyển hóa chất béo 14 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone bằng nấm men 17 1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất - decalactone trong và ngoài nƣớc 18 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trƣờng nghiên cứu 21 2.1.1. Vi sinh vật 21 2.1.2. Hóa chất 21 2.1.3. Thiết bị 21 2.1.4. Môi trƣờng 23 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 2.2. Phƣơng pháp 23 2.2.1. Nhân giống và lên men trên máy lắc 23 2.2.2. Lên men theo mẻ trên nồi 5L 24 2.2.3. Lên men theo mẻ - có tiếp dần cơ chất, trên nồi 5L 24 2.2.4. Lên men theo mẻ trên nồi 50L 25 2.2.5. Lên men theo mẻ có - tiếp dần cơ chất, trên nồi 50L 25 2.2.6. Đếm số lƣợng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu 25 2.2.7. Lactone hóa dịch sau lên men 26 2.2.8. Chƣng cất dịch lên men đã đƣợc lactone hóa 26 2.2.9. Tách chiết -decalactone bằng dung môi 26 2.2.10. Loại bỏ dung môi khỏi dịch chiết 26 2.2.11 Làm sạch dịch chiết cô đặc 27 2.2.11.1 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng cách rửa kiềm 27 2.2.11.2 Làm sạch dịch chiết cô đặc bằng Na 2 SO 4 khan 27 2.2.12. Đánh giá cảm quan 27 2.2.13. Phân tích định lƣợng -decalactone bằng sắc ký khí 27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30 3.1. Lựa chọn điều kiện lên men trên máy lắc 30 3.1.1. Lựa chọn tốc độ lắc 30 3.1.2. Lựa chọn pH môi trƣờng lên men 30 3.1.3. Lựa chọn thời gian nhân giống 31 3.1.4. Lựa chọn tỷ lệ cấy giống 32 3.1.5. Lựa chọn thời gian lên men 33 3.1.6. Ứng dụng phƣơng pháp lên men tiếp dần cơ chất (fed-culture) 33 3.2. Nghiên cứu các phƣơng thức lên men ở quy mô 5L và 50L 35 3.2.1. Lên men ở quy mô 5L 35 3.2.2. Lên men ở quy mô pilot trên nồi dung tích 50 lít 40 3.2.3. So sánh tóm tắt các phƣơng thức lên men ở quy mô 5L và 50L 43 3.3. Lựa chọn điều kiện chiết rút và thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 44 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 3.3.1. Lựa chọn điều kiện chiết rút γ-decalactone 44 3.3.2. Lựa chọn điều kiện thu nhận và làm sạch γ-decalactone từ dịch lên men 49 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Tế bào Yarrowia lipolytica sinh trưởng trong môi trường chứa methy ricinoleate 6 Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế chuyển hóa axit ricinoleic thành chất thơm -decalactone 11 Hình 1.3: Một số hình ảnh về thầu dầu (Ricinus communis) 12 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của axit ricinoleic (12 hydroxy-9-octadecenoic acid) 13 Hình 3.1. Động học quá trình lên men theo phương thức batch culture, không khống chế pH và DO trên nồi lên men dung tích 5L 36 Hình 3.2. Động học quá trình lên men theo phương thức batch culture, không khống chế pH có khống chế DO (A), có khống chế pH và DO (B) quy mô 5L 38 Hình 3.3. Động học quá trình lên men theo phương thức Fed-batch culture, có khống chế pH và DO, ở quy mô 5L 39 Hình 3.4. Động học quá trình lên men ở quy mô 50L, theo phương thức Batch culture (A) và Fed-batch culture (B) 42 Hình 3.5. Sắc ký đồ γ-decalactone thu nhận từ dịch lên men chủng Y. lipolytica VTP 5 (A), sau khi làm sạch bằng phương pháp “Chiết rút-làm sạch” (B), bằng phương pháp “Chưng cất-chiết rút-làm sạch” (C), γ-decalactone cô đặc (D). 53 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần axít hữu cơ trong dầu thầu dầu 13 Bảng 1.2. Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm - decalactone 14 Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng. 21 Bảng 2.2 Thiết bị trong nghiên cứu 22 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hiệu suất lên men 30 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu suất lên men 31 Bảng 3.3. Sự biến đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống 32 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hiệu suất lên men trên máy lắc 32 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone của chủng Y. lipolytica VTP5 33 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng dầu thầu dầu sử dụng ban đầu đến hiệu suất tổng hợp γ-decalactone của chủng Y. lipolytica VTP5 34 Bảng 3.7. Tổng hợp kết quả lựa chọn điều kiện lên men sinh γ-decalactone nhờ Y. lipolytica VTP5 ở quy mô máy lắc 34 Bảng 3.8. So sánh kết quả lên men theo 4 phương thức, trên thiết bị dung tích 5L 39 Bảng 3.9 So sánh lượng γ-decalactone cực đại cùng thời gian đạt được, ở quy mô 5L và 50L 43 Bảng 3.10. Lựa chọn dung môi tách chiết -decalactone từ dịch lên men……… 45 Bảng 3.11. Lựa chọn điều kiện lactone hóa để thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 46 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thời gian chiết rút đến hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men 47 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết rút γ- decalactone từ dịch lên men 48 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của số lần chiết rút đến hiệu suất chiết rút γ-decalactone từ dịch lên men 48 Bảng 3.15. Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chiết rút - làm sạch” 50 Bảng 3.16. Hiệu suất thu nhận γ-decalactone từ dịch lên men theo phương pháp “chưng cất - chiết rút- làm sạch” 50 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Aox Acyl-coA oxydase ATP Adenosin triphosphat CoA Coenzyme A Cs Cộng sự FDA Food and drug administration GC Gas chromatography (Sắc ký khí) Mb Megabase POX Peroxisomal acyl-CoA oxidase v/p Vòng/phút Y- VTP5 Yarrowia lipolytica-VTP5 YM Yeast Maltose Y- MTLY36-2P Yarrowia lipolytica- MTLY36-2P DO Dessolved Oxygen (Hàm lượng ôxy hòa tan) YMA Yeast Maltose Agar S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae DE Diethyl ether U Unit L Lít Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Chuyên ngành Vi sinh vật học Khóa 2011-2013 1 MỞ ĐẦU Con người biết đến chất thơm và sử dụng chúng từ hàng nghìn năm nay. Nó làm tăng chất lượng của nhiều sản phẩm, đặc biệt là thực phẩm. Khi đời sống ngày càng phát triển, xã hội càng văn minh thì các chất thơm được sản xuất và sử dụng ngày càng đa dạng và phong phú về cả số lượng lẫn chất lượng. Hiện nay, ngành công nghiệp chế biến thực phẩm có nhu cầu rất lớn về các chất phụ gia tạo hương. Hương tạo nên giá trị cảm quan và hương vi đặc trưng cho thực phẩm. Trong quá trình chế biến thực phẩm, cấu tử hương trong nguyên liệu ban đầu sẽ dần mất đi, điều đó bắt buộc các nhà công nghệ phải nghĩ tới phương án thêm chất phụ gia tạo hương. Mặt khác, trong các sản phẩm thực phẩm pha chế (nước ngọt, rượu mùi, sữa chua ) luôn cần sự có mặt của các chất tạo hương. Ngoài công nghiệp thực phẩm ra, những ngành khác cũng có nhu cầu sử dụng các chất phụ gia tạo hương, đó là: công nghiệp mỹ phẩm, chất phụ gia để sản xuất nước hoa, phấn son, kem xoa; công nghiệp dược cần thêm các chất tạo hương vào thuốc, đặc biệt là các loại thuốc cho trẻ em để làm át đi hương vị khó chịu của thuốc và làm cho thuốc dễ uống hơn; việc sản xuất các hàng tiêu dùng như kem đánh răng, xà phòng thơm, nước gội đầu, vv cũng cần bổ xung chất phụ gia tạo hương. Trong số các cấu tử tạo hương như este, andehyde, lactone, alcohol thì lactone là hợp chất khá phổ biến và là cấu tử hương thơm chính trong một số loại hoa quả, thảo mộc như đào, mận, dừa, dâu tây Trong các lactone thì γ-decalactone (C 10 H 18 O 2 ) là có giá trị nhất, được nghiên cứu nhiều nhất. Chất này tồn tại trong tự nhiên ở mức độ vi lượng, song là thành phần chủ đạo tạo nên hương thơm cho nhiều loại quả. γ- decalacton có thể được tổng hợp bằng con đường sinh tổng hợp từ dầu thực vật nhờ quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu (castor oil), là một loại nguyên liệu phù hợp cho quá trình tổng hợp γ-decalactone. Quá trình thuỷ phân dầu thầu dầu sẽ tạo ra axit ricinoleic, đây là “cơ chất” để một số nấm men chuyển hóa thành chất thơm, nhờ quá trình β-oxi hóa. [...]... khoa học cũng như các nhà sản xuất Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta sẵn có, rẻ tiền nhưng việc sử dụng nó cho việc nghiên cứu sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều Vì những lẽ trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica Chuyên ngành Vi sinh. .. –decalactone bằng nấm men Yarrowia lipolytica VTP5, quy mô trên máy lắc 2 Lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình lên men đó trong các nồi lên men dung tích 5L và 50L 3 Tìm các điều kiện tách chiết và thu nhận chất thơm –decalactone từ dịch lên men Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm men Yarrowia lipolytica Nấm men Yarrowia. .. họa ở hình 1.3 a và b Dầu thầu dầu có tên thương phẩm tiếng Anh là castor oil (hình 1.3 c), được tách ra từ hạt cây thầu dầu (Ricinus communis) thu c họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), bộ Ba mảnh vỏ (Ephorbiales), bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly a.Cây thầu dầu b.Quả thầu dầu c .Dầu thầu dầu Hình 1.3 Một số hình ảnh về thầu dầu [5] Hạt thầu dầu chứa khoảng 50-60% dầu Dầu thầu dầu là một chất... khuẩn, nấm mốc và nấm men Tuy nhiên sản lượng và hiệu suất tổng hợp - decalactone của vi khuẩn và nấm mốc rất thấp, do đó các nghiên cứu ứng dụng chủ yếu tập trung vào nhóm nấm men chuyển hóa chất béo Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa chất béo được nêu trong bảng 1.2 Bảng 1.2 Một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm - decalactone Sản lƣợng γ-decalactone γ-decalactone/... sinh vật học 2 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Mục tiêu của đề tài Chứng minh dầu thầu dầu Việt Nam như một nguyên liệu tiềm năng trong việc sản xuất chất thơm –decalactone nhờ nấm men, cũng như nấm men Yarrowia lipolytica VTP5 như một chủng tiềm năng cho việc sản xuất này Nội dung nghiên cứu 1 Lựa chọn điều kiện thích hợp để lên men chuyển hóa sinh học dầu thầu dầu thành... hiệu suất chuyển hóa và tích lũy các hợp chất hương thơm lớn hơn 4 lần [24] Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu 2.1.1 Vi sinh vật Trong nghiên cứu này, chủng nấm men Yarrowia lipolytica VTP-5 được dùng để chuyển hóa dầu thầu dầu thành - decalactone... ngành Vi sinh vật học 16 Khóa 2011-2013 Luận văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt 1.5 Các yếu tố ảnh hƣởng đến chuyển hóa sinh học axit ricinoleic thành chất thơm γ- decalactone bằng nấm men Nồng độ dầu thầu dầu Trong sinh tổng hợp - decalactone, dầu thầu dầu được sử dụng làm nguồn cacbon duy nhất Axit ricinoleic, thành phần chủ yếu của dầu thầu dầu đóng vai trò là nguồn cacbon chính cho sinh tổng... văn thạc sĩ khoa học Nguyễn Xuân Việt Một số nấm men chuyển hóa chất béo (oleaginous yeasts) như Yarrowia lipolytica, Rhodotorula sp., Candida sp., Lipomyces sp., Trichosporon sp.,… có khả năng sử dụng, chuyển hóa axít béo và các hợp chất kị nước Trong số đó nấm men Yarrowia lipolytica là loài được nghiên cứu nhiều nhất Vấn đề nâng cao sự chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm đang thu hút sự quan... nguồn cacbon duy nhất để sinh trưởng, và chuyển hóa các chất theo những hướng khác nhau [16] Nhu cầu oxy Nấm men Yarrowia lipolytica sống hiếu khí bắt buộc, sự sinh trưởng và trao đổi chất của nó phụ thu c vào rất nhiều yếu tố, đặc biệt là lượng oxy trong môi trường nuôi cấy Trong quá trình nuôi cấy, nhu cầu oxy cho sự sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men này phụ thu c vào nồng độ ion sắt có trong... sinh học axit ricinoliec trong dầu thầu dầu thành chất thơm γ-decalactone Oxy hòa tan vào môi trường lỏng ở dạng bọt khí nhỏ làm kích thích sinh sản của nấm men và tạo điều kiện cho tế bào nấm men hô hấp Oxy trong môi trường nuôi cấy không chỉ có vai trò kích thích sinh trưởng mà còn thúc đẩy sự sinh sản các enzyme ngoại bào, thúc đẩy sản sinh lipaza [16] Để tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men . HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, CHUYỂN HÓA SINH HỌC VÀ THU NHẬN - DECALACTONE TỪ DẦU THẦU DẦU BẰNG NẤM MEN Yarrowia. quan tâm nghiên cứu nhiều. Vì những lẽ trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia. SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN XUÂN VIỆT NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY, CHUYỂN HÓA SINH HỌC VÀ THU NHẬN -
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica , Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica , Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, chuyển hóa sinh học và thu nhận γ-decalactone từ dầu thầu dầu bằng nấm men Yarrowia lipolytica

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay