Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5- T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin

Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5- T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ----------------///---------------- Phạm Ngọc Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ----------------///---------------- Phạm Ngọc Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nghiêm Ngọc Minh Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cảm ơn Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nghiêm Ngọc Minh. Trưởng Phòng Công nghệ sinh học Môi trường – Viện Công Nghệ sinh Học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Trong quá trình nghiên cứu vửa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, đặc biệt là Ths. Nguyên Bá Hữu, CN. Nguyễn Văn Bắc, KS. Cung Thị Ngọc Mai, những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án của mình. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Khoa sau đại học, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 1 tháng 10 năm 2009 Phạm Ngọc Long BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-Pentaclorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria - Bertani PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxins PCDFs Polychlorinated dibenzofurans PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN 3 1. Sự ô nhiễm của 2,4,5-T và 2,4-D 3 2. Đặc điểm và tính chất của 2,4,5-T và 2,4-D 5 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 5 2.2 Chất diệt cỏ 2,4-D 7 3. Ảnh hƣởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trƣờng và con ngƣời 8 3.1 Ảnh hưởng của 2,4,5-T và 2,4-D tới môi trường 8 3.2 Ảnh hưởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến con người 9 4. Một số phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học trong đó có 2,4,5-T và 2,4-D 9 4.1 Phương pháp xử lý chất độc hóa học bằng hóa học, lý học, cơ học 9 4.2 Phương pháp phân hủy sinh học 10 5. Khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của một số vi sinh vật 15 6. Phân loại vi sinh vật 21 6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển 21 6.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 22 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 1. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 25 1.1 Vật liệu 25 1.2 Hóa chất 25 1.3 Thiết bị, máy móc 25 2. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.1 Môi trường nuôi cấy 26 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l) 26 2.1.2 Môi trường SH1 thạch 26 2.1.3 Môi trường muối khoáng 26 2.1.4 Môi trường LB dịch 27 2.1.5 Môi trường LB thạch 27 2.1.6 Nước muối sinh lý 27 2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiếu khí 27 2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật 27 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 27 2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 28 2.3.1 Nhuộm Gram 28 2.3.2 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét 28 2.4 Phương pháp phân tích khả năng phân hủy 2,4,5-T 29 2.5 Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 29 2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật 29 2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR 30 2.5.3 Điện di kiểm tra trên gel agarose 31 2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA 31 2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli 31 2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) 32 2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit của hãng Fermentas 33 2.5.8 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA 34 2.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 34 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 1. Nuôi cấy, phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiểu khí 35 1.1 Nuôi cấy, làm giàu tập đoàn vi sinh vật 35 1.2 Phân lập chủng vi khuẩn 37 2. Đặc điểm phân loại của chủng HR5.1 38 2.1 Hình thái tế bào 38 2.2 Phân loại dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA 39 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 39 2.2.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng HR5.1 bằng kỹ thuật PCR 40 2.2.3 Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pBT 41 2.2.4 Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng HR5.1 43 3 Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng HR5.1 47 3.1 Khả năng phát triển của chủng HR5.1 trên PAH 47 3.2 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng HR5.1 49 3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có chứa 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 49 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 50 3.2.3 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng vi khuẩn HR5.1 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 MỞ ĐẦU Trong cuộc chiến tranh xâm lược của Mỹ tiến hành ở Việt Nam, hơn 100 triệu lít chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và 2,3,7,8 TCDD đã được rải xuống hơn 20% diện tích của miền Nam. Theo công bố của Stellman và cộng sự trên tạp chí Nature năm 2003 thì 20 chất diệt cỏ khác nhau đã được sử dụng. Chu kỳ bán hủy của dioxin và các chất tương tự dioxin rất dài, có khi đến vài chục năm hoặc hàng trăm năm [15],[42]. Qua các điều tra nghiên cứu của nhiều cơ quan khoa học và công nghệ ở Việt Nam và quốc tế cho thấy, đất của sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa độ tồn lưu của PCDD, PCDF, 2,4,5-T và 2,4-D vẫn còn cao. 2,4,5-T, 2,4-D có hàm lượng lên tới hàng vài trăm nghìn đến vài triệu µg/kg đất. Ngoài ra một lượng không nhỏ các chất DCP, TCP và PAH cũng đã được xác định trong các mẫu đất tại khu vực bị nhiễm độc. Nghiên cứu áp dụng phương pháp sinh học để khử độc tại “điểm nóng” ở Đà Nẵng thu được kết quả rất khả quan. Tuy nhiên để xử lý các điểm ô nhiễm cục bộ chất diệt cỏ/dioxin với thời gian ngắn cần có các công nghệ phân hủy sinh học phù hợp. Hiện nay, phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học đang tiến hành xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin bằng công nghệ tăng cường sinh học trong các bioreactor hiếu khí và kỵ khí. Trong quá trình xử lý, ngoài sự điều khiển về điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ thì vai trò của các vi sinh vật có trong bioreactor là rất quan trọng. Để tăng hiệu quả và hoàn thiện công nghệ cần tăng thêm hiểu biết về đặc điểm vi sinh vật có trong bioreactor, cũng như vai trò của các vi sinh vật phân hủy chất độc được bổ sung vào bioreactor. Nhằm đáp ứng yêu cầu của thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5-T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin“ đã được thực hiện. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 Luận án đã thực hiện đƣợc các nội dung nghiên cứu sau đây  Làm giầu vi sinh vật từ các mẫu đất trong bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.  Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên 2,4,5-T và 2,4-D.  Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng vi khuẩn phân lập được.  Phân loại định tên chủng vi khuẩn được chọn lựa.  Xác định khả năng sử dụng 2,4,5-T của chủng vi khuẩn nghiên cứu. Luận án này được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học và là một phần đề cấp Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam: “Nghiên cứu xử lý tẩy độc một số hợp chất hữu cơ chứa clo bằng các phương pháp hóa học và sinh học tiên tiến“ do PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ trì. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 PHẦN 1 TỔNG QUAN 1. Sự ô nhiễm của 2,4,5-T và 2,4-D Từ năm 1961 đến năm 1971 quân đội Mỹ đã rải hơn 100 triệu lít chất diệt cỏ xuống nhiều vùng ở miền Trung và Nam Việt Nam [42]. Các chất diệt cỏ đã được sử dụng bao gồm: chất da cam, chất trắng, chất xanh lục, chất xanh lam, chất tím, chất hồng, các chất này được gọi tên theo mầu đánh dấu trên các thùng phuy chứa chúng, mỗi thùng khoảng 250l [42]. Các chất diệt cỏ thường là hỗn hợp của hai chất 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) và 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) với tỷ lệ 50:50 (Bảng 1). Dioxin là tạp chất được sinh ra trong quá trình sản xuất 2,4,5-T. Hàm lượng dioxin trong các chất diệt cỏ rất khác nhau, ước tính số lượng dioxin chứa trong chất diệt cỏ mà Mỹ đã dùng trong chiến tranh Việt Nam từ 170 - 1000 kg [42], [15]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của các chất diệt cỏ quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh Việt Nam [42]. Tên chất Thành phần hoá chất Độ đậm đặc tƣơng đƣơng Sử dụng trong trong năm Số lƣợng ƣớc tính đã rải (lít) Chất hồng 60% - 40% n-Butyl: isobutylester của 2,4,5-T 961-1081 g/l acid tương đương 1961-1965 503.121; 413,852 Chất xanh lá cây n-Butylester của 2,4,5-T Giống như chất hồng Chưa rõ, rải cùng thời gian với chất hồng 31.026 Chất tím 50%n-Butylester 2,4,D 30% Butylester 1033 g/l acid tương đương 1962-1965 1.892.773 [...]... trong các bioreactor với quy mô 50 kg [3] Các chủng vi sinh v t có ho t tính phân hủy t t các ch t ô nhiễm chính được phân lập t i đ t nhiễm ch t di t cỏ/ dioxin t i chính sân bay Đà Nẵng và t p đoàn vi sinh v t nuôi cấy làm giàu trên môi trường dinh dưỡng chứa các thành phần ch t ô nhiễm trong phòng thí nghiệm được bổ sung trong quá trình xử lý Các ch t bổ sung trong quá trình xử lý được t nh toán và bổ... ch t, các thi t bị sử dụng trong nghiên cứu 1.1 V t liệu Mẫu đ t từ các bioreactor xử lý đ t nhiễm ch t độc hóa học ở sân bay Đà Nẵng thuộc đề t i Nghiên cứu xử lý t y độc m t số hợp ch t hữu cơ chứa clo bằng các phương pháp hóa học và sinh học tiên tiến” do PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà là chủ trì đã được sử dụng để nghiên cứu phân lập chủng vi sạch v t có khả năng sử dụng 2,4,5 -T và 2,4-D 1.2 Hóa ch t Các. .. trước, trong su t quá trình xử lý đã được theo dõi Các chủng nấm, vi khuẩn hiếu khí, kị khí, xạ khuẩn đã được sử dụng để nghiên cứu khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD Phương pháp nghiên cứu vi sinh v t truyền thống và kỹ thu t sinh học phân t điểm chỉ như DGGE và các kỹ thu t sinh học phân t khác đã được tiến hành để nghiên cứu t p đoàn vi sinh v t đồng thời phân lập các chủng vi sinh v t, định t n loài vi. .. khắp thế giới 3 Ảnh hƣởng của 2,4,5 -T, 2,4-D đến môi trƣờng và con ngƣời 3.1 Ảnh hƣởng của 2,4,5 -T và 2,4-D t i môi trƣờng Quân đội Mỹ đã rải ch t di t cỏ chứa 2,4,5 -T, 2,4-D và t p ch t dioxin lên khoảng 27% t ng diện t ch Vi t Nam Khoảng hơn 2 triệu ha rừng đã bị t c động của ch t di t cỏ [17] T c dụng t c thời của ch t di t cỏ là làm cho các loài cây rừng bị trụi h t lá, r t nhiều loài cây bị ch t, ... bị ô nhiễm ch t di t cỏ/ dioxin đến vài ha và ở độ sâu trung bình t m t đến hai m t Để đẩy nhanh t c độ phân hủy sinh học ch t di t cỏ/ dioxin, các nghiên cứu xử lý khử độc trong các bioreactor đã được nhóm nghiên cứu công nghệ xử lý POP, Vi n Công nghệ sinh học tiến hành Đây là phương pháp xử lý kiểu t ng cường sinh học (bioaugmentation) trong hệ thống có khả năng điều khiển các thông số quan trọng... tranh 2 Đặc điểm và t nh ch t của 2,4,5 -T và 2,4-D 2.1 Ch t di t cỏ 2,4,5 -T 2,4,5 -T là t n gọi t t của acid 2,4,5-trichlorophenoxyaxetic Công thức hóa học là C8H5O3Cl3, khối lượng phân t 255,49 g/mol Công thức cấu t o được thể hiện ở hình 1.1 Hình 1.1 Công thức cấu t o 2,4,5 -T 2,4,5 -T tinh khi t có dạng tinh thể rắn, không mùi, t không màu đến vàng nâu nh t, tan t trong nước, độ hòa tan trong nước ở... biến về m t di truyền bổ sung vào các địa điểm ô nhiễm Kích thích sinh học (Biostimulation) là quá trình thúc đẩy sự ph t triển và ho t động trao đổi ch t của t p đoàn vi sinh v t bản địa có khả năng sử dụng các ch t độc hại thông qua vi c thay đổi các yếu t môi trường như pH, độ ẩm, nồng độ O2, ch t dinh dưỡng, các cơ ch t, các ch t xúc t c v.v Vi c bổ sung vi sinh v t vào các địa điểm ô nhiễm đòi hỏi... số vi sinh v t 2,4-D và 2,4,5 -T là hai thành phần chủ yếu của các ch t di t cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh Vi t Nam [42] Hiện t i đ t tại các khu nhiễm ch t độc hóa học ở các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở miền Trung và Nam Vi t Nam hai hợp ch t trên vẫn ở nồng độ cao Trên thế giới do 2,4-D và 2,4,5 -T đã được sử dụng t r t lâu nên có nhiều công bố về khả năng phân hủy sinh học hai hợp ch t. .. ô nhiễm khác nhau như đ t nông nghiệp, trầm t ch, khu vực xử lý rác thải và đ t nguyên thủy Các vi khuẩn phân hủy 2,4-D được xếp thành 3 nhóm dựa vào enzyme phân hủy và các đặc t nh lý hóa của chúng Nhóm thứ nh t nằm trong lớp β và γProteobacteria như Achromobacter, Burkholderia, Delftia, Halomonas, Pseudomonas Những vi khuẩn này có chứa gen tfd thường nằm ở các plasmid và có thể chuyển được t cơ thể... sánh với trình t gen TfdK của chủng Ralstonia eutropha JMP134, k t quả cho thấy 2 gen này có độ t ơng đồng 60% [33] Trong m t nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự trên mẫu đ t nhiễm độc ch t di t cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng, nhóm t c giả đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn phân hủy 2,4-D đều thuộc chi Athrobacter có t n lần lư t là Athrobacter sp DNB19, Athrobacter sp DNB20 và Athrobacter sp DNB21 . NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5 -T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP T CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ Đ T NHIỄM CH T DI T CỎ /DIOXIN . NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5 -T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP T CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ Đ T NHIỄM CH T DI T CỎ /DIOXIN Chuyên