Áp dụng phương pháp VNTR – Miru định kiểu Gene các chủng Mycobacterium Tuberculosis phân lập tại Việt Nam

LỜI MỞ ĐẦU Y văn nhân loại đã ghi nhận sự tồn tại của bệnh lao từ thời cổ đại, lịch sử bệnh lao là lịch sử ghi lại những thách thức trong khoa học và y khoa. Bệnh lao vẫn đang là vấn đề nhức nhối cho sức khoẻ từng cá nhân và cộng đồng. Theo thống kê của WHO, hằng năm trên thế giới trung bình 8 triệu người bệnh lao mới đượ c phát hiện, trong số đó 2 đến 3 triệu người chết vì lao. Năm 1993, WHO tuyên bố lao là vấn đề cấp bách trên toàn cầu. Cùng với HIV và sốt rét, lao là một trong những nguồn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất. Lao thật sự là gánh nặng y tế ở những nước đang phát triển, nhất là trong tình hình các chủng mycobacteria kháng thuốc trị lao ngày càng nhiều. Nhiều bệnh nhân lao mắc thêm HIV và nhiều bệnh nhân HIV nhiễm thêm bệnh cơ hội như lao; khi số lượng tế bào CD4 giảm từ 500 đến 250/mm 3 , nguy cơ nhiễm lao tăng từ 10 đến 30 lần (23). Chính tình hình cấp bách này đòi hỏi cộng đồng thế giới tìm ra chiến lược phòng chống lao đồng bộ và hiệu quả hơn. Bệnh lao là do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra. Từ sự phổ biến của một chủng lao ở Bắc Kinh (Trung Quốc), chủng lao ở New York có liên hệ mật thiết với kháng đa thuốc, vi khuẩn lao kiểu gene Beijing đã thu hút sự chú ý trong giới nghiên c ứu khoa học cận lâm sàng. Số liệu thống kê cho thấy kiểu gene Beijing (chiếm 37% trong tổng số mẫu vi khuẩn phân lập tại Việt Nam) có thể có liên hệ với tính kháng thuốc (14), có thể là nhân tố góp phần vào tỉ lệ kháng thuốc cao trong thời gian dài, mặc dù Chương trình chống lao Quốc gia của Việt Nam đã được thiết lập và đưa vào hoạt động tốt từ vài thập kỉ qua. Kiểu gene Việt Nam, một kiểu gene trong nhóm Indo-Oceanic, chi ếm khoảng 20% tổng số mẫu, không thể được phân biệt rạch ròi bằng các kỹ thuật định kiểu gene đang được áp dụng ở Việt Nam hiện nay. Kĩ thuật IS6110 – RFLP được sử dụng như kĩ thuật chuẩn định kiểu gene M.tuberculosis, nhưng không thể phân biệt các kiểu gene trong dòng Indo-Oceanic do bản chất những M.tb kiểu gene này có ít các bản sao IS6110. Spoligotyping là kĩ thuật định kiểu gene nhanh, đơn giản nhưng không thể phân biệt các chủng trong họ Beijing. Như vậy cần có sự tìm tòi, áp dụng và phát triển một kĩ thuật có khả năng phân giải tốt để phân biệt các chủng vi khuẩn lao có nguồn gốc châu Á này. Kĩ thuật VNTR áp dụng trên 31 loci cho thấy một số dấu ấn sinh học có mức độ đa hình cao trên quần thể Nhật Bản (tổng số mẫu trong quần thể là 235 chủng, trong đó có 185 chủng là kiểu gene Beijing) (17), cho thấy khả năng áp dụng như kĩ thuật để phân tách kiểu gene trong tập hợp chủ yếu gồm họ Beijing và kiểu gene địa phương Việt Nam. Chiến lược lâu dài cho sự áp dụng và phát triển các kĩ thuật định kiểu gene phân tách chủng vi khuẩn lao có nguồn gốc châu Á: Trên 450 mẫu lâm sàng đã thu nhận được tại Tp Hồ Chí Minh, kĩ thuật VNTR – MIRU trên 31 loci được tối ưu hoá các điều kiện thí nghiệm như nhiệt độ bắt cặp, n ồng độ mồi… Từ những thông tin đó, nhận diện những loci mang tính đa hình cao và áp dụng lên tập hợp mẫu lớn thu thập từ Chương trình chống lao Quốc gia được thu nhận theo chiến lược phân tầng rồi bốc ngẫu nhiên, rút ra 100 mẫu tiêu biểu đại diện toàn bộ tập hợp mẫu cho dự án giải toàn bộ bộ gene. Mục tiêu đề tài Một phần trong chiến lược lâu dài đó, phạ m vi luận văn để giải quyết việc áp dụng kĩ thuật VNTR - MIRU với 31 loci trên 95 mẫu đại diện đầu tiên trong tập hợp mẫu thu nhận được tại Tp HCM để hoàn thiện phương pháp trong điều kiện áp dụng phòng thí nghiệm tại địa phương, loại bỏ những loci không có tính đa dạng, tìm kiếm những loci cho thông tin ổn định mà vẫn mang tính phân biệt giữa các chủng trong họ Beijing và Việt Nam: - Tiến hành tối ưu hoá 31 PCR với các bộ mồi gắn màu - Điều chỉnh các điều kiện điện di mao quản trên hệ thống máy DNA analyzer Applied Biosystems Inc. 3130xl - Thiết lập qui trình xử lí thông tin bằng phần mềm GeneMapper v3.0 - Phân tích độ tương đồng kiểu gene giữa các chủng bằng phần mềm BioNumerics v4.0 (Applied Maths, Belgium)