Đang tải... (xem toàn văn)
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: sử dụng tế bào gốc trung mô làm tăng khả năng tái tạo và phục hồi tế bào ruột non sau chiếu xạ trên chuột. Nhóm chuột chiếu xạ với liều 8,5Gy, các tế bào nhung mao ruột non bị tổn thương, tế bào niêm mạc bị chết, co lại tạo thành những khoảng trống lớn, mạch máu giãn rộng, đầu nhung mao bị đứt. Nhóm chuột chiếu xạ và tiêm tế bào gốc trung mô ở liều 107 tế bàoml, 3 ngày sau tiêm tế bào gốc đã kích thích sự phục hồi nhung mao ruột cũng như tái tạo sự hình thành mạch máu.
NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI CẤU TRÚC HIỂN VI RUỘT NON CHUỘT CỐNG TRẮNG ĐƯỢC ĐIỀU TRỊ BẰNG TẾ BÀO GỐC SAU CHIẾU XẠ Chế Thị Cẩm Hà 1,2 , François Sabine 2 , Alain Chapel 2 1. Khoa Sinh học, Trường Đại học khoa học Huế 2. Phòng thí nghiệm: Cell Therapy and Radiation Safety Accidental, University Pierre & Marie Curie - France Email: chethicamha@yahoo.com Tóm tắt: Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: sử dụng tế bào gốc trung mô làm tăng khả năng tái tạo và phục hồi tế bào ruột non sau chiếu xạ trên chuột. Nhóm chuột chiếu xạ với liều 8,5Gy, các tế bào nhung mao ruột non bị tổn thương, tế bào niêm mạc bị chết, co lại tạo thành những khoảng trống lớn, mạch máu giãn rộng, đầu nhung mao bị đứt. Nhóm chuột chiếu xạ và tiêm tế bào gốc trung mô ở liều 10 7 tế bào/ml, 3 ngày sau tiêm tế bào gốc đã kích thích sự phục hồi nhung mao ruột cũng như tái tạo sự hình thành mạch máu. Từ khóa: I. MỞ ĐẦU Xạ trị là một liệu pháp có hiệu quả cao được sử dụng rộng rãi nhằm tiêu diệt các khối u trong việc điều trị bệnh ung thư. Tuy vậy, các bộ phận của cơ thể rất nhạy cảm với tia xạ và khi dùng ở liều cao sẽ gây ra các phản ứng không mong muốn. Tia xạ liều cao có tác dụng tiêu diệt các tế bào ác tính hoặc kìm hãm sự phát triển lan tràn của chúng nhưng các tế bào lành xung quanh khối u cũng bị tác động tuy không mạnh như các tế bào ung thư và phần lớn theo thời gian các tế bào lành này có thể phục hồi sau chiếu xạ. Tế bào gốc trung mô tủy xương (Mesenchymal Stem Cells-MSC) là các tế bào gốc đa năng, có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào xương, sụn, cơ, mỡ, thần kinh, biểu mô… Nhiều nghiên cứu đã sử dụng nguồn tế bào này trong điều trị cận lâm sàng trên nhiều bệnh và đã đạt nhiều kết quả khả quan. Nghiên cứu của chúng tôi là thử nghiệm sử dụng tế bào gốc trung mô tủy xương - MSC để tăng cường khả năng tái tạo và phục hồi tế bào ruột non sau chiếu xạ trên chuột nhằm nâng cao chất lượng và hiệu quả của việc điều trị. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng nghiên cứu: là loài chuột cống trắng (Sprague Dawley) có khả năng miễn dịch. - Chuột thí nghiệm: là chuột đực khỏe mạnh, một tháng tuổi, có trọng lượng ban đầu 200±20 gram và được kiểm dịch trong 5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. Chuột được nuôi ở các lồng riêng biệt, ở nhiệt độ 25°C, chiếu sáng liên tục 24 giờ/ngày, được cho ăn trong cùng một chế độ dinh dưỡng và cùng điều kiện chăm sóc suốt quá trình nghiên cứu. - Các chuột thí nghiệm được phân lô như sau: + Lô đối chứng sinh học: chuột không chiếu xạ và không tiêm tế bào gốc. + Lô đối chứng chiếu xạ: chuột bị chiếu xạ, không tiêm tế bào gốc + Lô thí nghiệm chiếu xạ: chuột bị chiếu xạ, sau đó được tiêm tế bào gốc Phương pháp: Tế bào gốc được lấy từ tủy xương với heparin. Tế bào được nuôi với mật độ 5000 tế bào/cm 2 trong 10 ml môi trường nuôi cấy MEM (Invitrogen, Pontoise, Pháp) có chứa huyết thanh bào thai bò 10%, trong tủ cấy 5% CO 2 ở nhiệt độ 37°C. Trong 1-2 giờ, các tế bào gốc phát triển trong hộp cấy, sau 48 giờ chúng sẽ phát triển nhanh, tạo thành một lớp hỗn hợp tế bào bám chặt trên bề mặt hộp cấy. Ở giai đoạn chuyển 2, các tế bào được nuôi với mật độ 1000 tế bào/cm 2 . Sau đó tiếp tục thay môi trường và nuôi tế bào đến ngày thứ 21, 3 ngày/một lần thay môi trường dinh dưỡng mới và loại bỏ các tế bào chết. Tiếp tục nuôi đến khi mật độ tế bào > 70%, cấy chuyền tăng sinh (chuyển 2), tinh sạch tế bào trước khi ghép. Hình 1: Thao tác tiêm tế bào gốc qua tĩnh mạch trên chuột thí nghiệm Chiếu xạ: chuột được đặt trong các hộp nhựa plastic đường kính 20cm và chiếu xạ ở vùng bụng dưới với diện tích 2x3cm với liều lượng 8,5 Gy bằng máy Tomotherapy tại Viện Bảo vệ bức xạ và An toàn hạt nhân Fontenay-aux-Roses - Pháp (hình 2). Hình 2: Qui trình chiếu xạ Phương pháp làm tiêu bản hiển vi: giải phẩu chuột để thu mẫu ruột non vào các ngày : trước khi chiếu xạ và ngày thứ 3, 5 sau khi chiếu xạ, đem cố định trong dung dịch formol hoặc Ethanol tùy theo mục đích nghiên cứu. Đúc mẫu trong parafin, sau đó mẫu được cắt thành các lát mỏng với độ dày 5µm, cố định lát cắt trên lam kính và để ở tủ ấm trong 12 giờ. Phương pháp nhuộm mẫu: Ngâm mẫu vào xylen để loại bỏ parafin, sau đó khử xylen bằng cồn ethylic, rồi rửa lại mẫu bằng nước cất và ngâm vào dung dịch Hematoxylin. Sau đó lấy ra rửa lại bằng nước cất rồi nhúng vào dung dịch Eosin. Tiếp tục khử nước bằng cồn ethylic, và khử cồn bằng xylen, sau cùng là gắn lamen lên trên mẫu ở lam bằng máy Thermo Fisher Scientific. Quan sát và chụp ảnh cấu trúc bằng kính hiển vi quang học Olympus. Thống kê và xử lý số liệu: So sánh kết quả ở các lô thí nghiệm bằng phân tích ANOVA, sử dụng phần mềm Stat View với mức ý nghĩa p<0,05. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Do ruột non nằm gần vị trí chiếu xạ và cũng là cơ quan có độ nhạy cảm phóng xạ rất cao nên việc nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc nhung mao ruột trước và sau chiếu xạ, có tiêm tế bào gốc được chúng tôi đặc biệt quan tâm nghiên cứu. 1. Cấu trúc hiển vi nhung mao ruột non ở chuột đối chứng sinh học Cấu trúc hiển vi ruột non của chuột ở lô đối chứng sinh học được thể hiện ở hình 3. Khi quan sát những tiêu bản lát cắt ngang lông nhung ruột non ở những lô chuột khỏe mạnh được nhuộm màu bằng Hematoxylin - Eosin, chúng tôi nhận thấy: cấu trúc ruột non gồm 4 tầng là tầng niêm mạc, tầng hạ niêm mạc, tầng cơ và tầng vỏ ngoài. Các nhung mao của ruột non lồi ra có dạng hình ngón tay hay hình lá tạo thành các khe hở. Hình dạng nhung mao của ruột rất lớn, các nhung mao sắp xếp sát nhau dày đặc do vậy mà làm tăng diện tích tiếp xúc của ruột non với thức ăn lên nhiều lần. Nhân có dạng hình trứng và hình cầu, bắt màu đều nhau. Trên tiêu bản cũng thấy xuất hiện các nang bạch huyết rộng, dài đến tận đầu mút các nhung mao. Ở gốc tầng niêm mạc nhìn rõ các tuyến Lieberkuhn. Hình 3: Lát cắt ngang nhung mao ruột non chuột ở lô đối chứng sinh học (độ phóng đại 10×40) 2. Cấu trúc hiển vi nhung mao ở chuột bị chiếu xạ và không tiêm tế bào gốc Quan sát lát cắt ngang ở ruột non sau 3 và 5 ngày chiếu xạ của lô chuột khỏe mạnh dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10x40 (hình 4) kết quả cho thấy: các tuyến Brunner và Lieberkuhn nằm rải rác ở niêm mạc ruột bị teo lại, tế bào niêm mạc hoại tử tạo thành những khoảng trống, không rõ cấu trúc tế bào. Đặc biệt các tế bào hình dài bị thu nhỏ về kích thước, chiều dài của các nhung mao giảm rõ rệt, nhiều đầu nhung mao bị đứt khỏi niêm mạc và lớp hạ niêm mạc có những điểm bị tách khỏi lớp cơ. Hình 4: Lát cắt ngang nhung mao ruột non chuột ở lô chiếu xạ và không tiêm tế bào gốc (độ phóng đại 10×20) 3. Cấu trúc hiển vi nhung mao ở chuột bị chiếu xạ và tiêm tế bào gốc Ở lô đối chứng chiếu xạ với liều 8,5Gy, sau khi chiếu xạ 24 giờ và tiêm tế bào gốc với liều: 10 7 tế bào/ml. Sau khi tiêm 7 ngày, tiến hành thu mẫu và làm tiêu bản hiển vi, khi quan sát lát cắt ngang ở ruột non dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10x 40, kết quả cho thấy: các tế bào niêm mạc đã có kích thước trung bình và lớn. Bắt đầu thấy rõ cấu tạo nhung mao, các tế bào tuyến và dịch nhầy. Các tầng tế bào có xu hướng tái tạo, xuất hiện các nang bạch huyết và lớp hạ niêm mạc có các mao mạch (hình 5). Hình 5: Nhung mao ruột chuột ở lô chiếu xạ và tiêm tế bào gốc (độ phóng đại 10×20) Sự có mặt của tế bào gốc trung mô tủy xương ở thời điểm này đã kích thích sự phục hồi nhung mao ruột và cấu trúc của vách ruột về cả cấu tạo và chức năng sau 5 ngày tiêm. Việc sử dụng các tế bào gốc này đã chứng minh rằng nó có vai trò trong quá trình tái tạo mô, kích thích sự hình thành mạch máu sau khi chiếu xạ vô tình hay tiếp xúc với quá trình chiếu xạ. Từ kết quả này, theo chúng tôi khi sử dụng phương pháp xạ trị có thể phối hợp với tiêm tế bào gốc trung mô MSC để giúp sửa chữa các loại mô sau khi chiếu xạ nhằm tăng hiệu quả trong điều trị bệnh. KẾT LUẬN 1. Tế bào nhung mao ruột non ở chuột đối chứng chiếu xạ bị tổn thương, tế bào niêm mạc bị chết co lại tạo thành những khoảng trống lớn, mạch máu giãn rộng, đầu nhung mao bịt đứt. 2. Sau 3 ngày ghép tế bào gốc trung mô tủy xương ở liều 10 7 tế bào/ml đã kích thích sự phục hồi nhung mao ruột, kích thích sự hình thành mạch máu sau khi chiếu xạ ở liều 8,5Gy. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Francois, S. et al. Human mesenchymal stem cells favour healing of the cutaneous radiation syndrome in a xenogenic transplant model. Ann Hematol 86, (2007). [2] Imasawa, T., Y. Utsunomiya, et al. (2001). "The potential of bone marrow-derived cells to differentiate to glomerular mesangial cells." J Am Soc Nephrol 12 (7) [3] Li, Y. Q., Roberts, S. A., Paulus, U., Loeffler, M. & Potten, C. S. The crypt cycle in mouse small intestinal epithelium. J Cell Sci 107 (Pt 12), (1994). [4] Narisawa, T., Magadia, N. E., Weisburger, J. H. & Wynder, E. L. Promoting effect of bile acids on colon carcinogenesis after intrarectal instillation of N-methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidine in rats. J Natl Cancer Inst 53, (1974). [5] Potten, C. S., Owen, G. & Roberts, S. A. The temporal and spatial changes in cell proliferation within the irradiated crypts of the murine small intestine. Int J Radiat Biol 57, (1990). [6] Poulsom, R., S. J. Forbes, et al. (2001). "Bone marrow contributes to renal parenchymal turnover and regeneration." J Pathol 195 (2). [7] Satija, N. K. et al. Mesenchymal stem cell-based therapy: a new paradigm in regenerative medicine. J Cell Mol Med 13, (2009). STUDY OF THE STRUCTURAL CHANGES IN VIEW VI INTESTINE RATS TREATED WITH STEM CELL AFTER IRRADIATION Che Thi Cam Ha 1,2 , François Sabine 2 , Alain Chapel 2 1. Biology department. Hue University of Science 2. Cell Therapy and Radiation Safety Accidental, University Pierre & Marie Curie - France Abstract: The results of our study show that use of mesenchymal stem cells enhances the ability to regenerate and restore intestinal cells after irradiation in rats. In rats irradiated, the villi of small intestine cells are damaged, endometrial cells die and afterwards large gaps are formed which finally these are irraded by dilated blood vessels.3 days after injecting a dose of 10 7 cells/ml, mesenchymal stem cells were stimulated and the intestines were recover after a dose of 8,5 Gy of irradiation.