TÓM TẮT i TÓM TẮT TIẾNG VIỆT Loài cây bắt ruồi Drosera đã đƣợc chứng minh là có giá trị dƣợc tính trong điều trị các căn bệnh nhƣ: lao, ung thƣ, HIV, tim mạch, ho gà, hen suyễn…kể cả những căn bệnh do đột biến [Samaj J., 1999]. Thế nhƣng, trong tự nhiên Drosera tƣơng đối hiếm, là loài có nguy cơ tuyệt chủng, nhiều quốc gia đã phải ban hành luật để bảo vệ chúng [Blehova A, 1995], [Bonnet M, 1984].Ở Việt Nam, có 3 loài Drosera [Phạm Hoàng Hộ, 1995]; chƣa loài nào đƣợc nghiên cứu về thành phần hóa học cũng nhƣ dƣợc tính [Đỗ Tất Lợi]. Do vậy, đề tài đã ra đời với nhu cầu thiết yếu của nó nhằm bảo tồn nguồn cây Drosera vốn khan hiếm; khai thác tiềm năng dƣợc tính của 1 loài cây hoang dại ở Việt Nam; đáp ứng nhu cầu thực vật cũng nhƣ về dƣợc chất 1 cách chủ động. Với đại diện là cây bắt ruồi D. burmanii Vahl đƣợc thu hái ở Việt Nam, chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình vi nhân giống; sàng lọc, thu nhận và chứng minh cấu trúc của plumbagin, vốn là hoạt chất có giá trị dƣợc tính cao từ nguồn nguyên liệu in vitro của loài Drosera này. Trong đề tài này, chúng tôi tập trung nghiên cứu tạo hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D. burmanii (thông qua mô sẹo và trực tiếp từ lớp mỏng tế bào) và ứng dụng 1 số kỹ thuật tăng sinh plumbagin trên dịch huyền phù tế bào: điều kiện nuôi cấy thích hợp (ủ tối, tốc độ lắc 125 vòng/phút, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 2,6×10 4 tế bào/ml), bổ sung tiền chất (phenylalanine 0,3mM hay tyrosine 0,3mM); chất cảm ứng (acid salicylic 1,5mg/l trong 4 ngày khi dịch huyền phù tế bào đƣợc 8 ngày tuổi); và loại bỏ 2,4-D trong thành phần môi trƣờng nuôi cấy đều là những kỹ thuật giúp gia tăng tích lũy plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D. burmanii. Trong đó, việc loại bỏ 2,4-D (từ ngày thứ 8 trở đi) có ảnh hƣởng rõ nhất đến khả năng tích lũy plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D. burmanii, giúp tăng hàm lƣợng plumbagin lên gấp 2,58 lần. TÓM TẮT ii TÓM TẮT TIẾNG ANH Species of Drosera have been proved to have important phamacognostical evaluation in treatment of ailments like: tuberculosis, cancer, HIV, cardiovascular, asthma, whooping cough, without exception of mutation related diseases [Samaj J., 1999]. Beingrelatively rare in nature, Droseraare such endangered species that many countries have enacted legislation to protect them [Blehova A, 1995], [Bonnet M, 1984]. However, among three known species of Drosera in Vietnam [Pham Hoang Ho, 1995], it is the fact that there has been no publication studying these species on the chemistry, pharmacology [Do Tat Loi]. There is an urgent need to adopt conservation measure regionally, which may preserve these valuable species from being vanished. Moreover, studying in specific potential medicinal properties of these wild plants may suggest a source of fresh biomass and their extracted substances for interesting industrial employment. Focusing on D. burmani Vahl collected inVietnam, the micro propagation has been successfully established. From these in vitro materials, the screening, isolating and elucidating (both structural and bioactive properties) of quercertine and plumbagin have also been carried out.Especially in this thesis is successful application of cell suspension cultures strategies for D. burmani(via callus and directly via thin cell layers of tissue) to improve plumbagin yields:choosing appropriate culture conditions (dark incubation, shaking speed 125 round/minute, cell concentration 2,6×10 4 cells/ml), precursor addition (phenylalanine 0,3mM or tyrosine 0,3mM); elicitation (salicylic acid 1,5mg/l in 4 days) on 8 day old cell suspension;2,4-D elimination from media of 8 day old cell suspesion.Among these, the last strategy is reported to increasing plumbagin yield to the highest level (2.58 times than control). MỤC LỤC iii MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x PHẦN MỞ ĐẦU 1 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Đặc điểm giống thực vậtDrosera 4 1.1.1 Đặc điểm phân loại 4 1.1.2 Đặc điểm phân bố 6 1.1.3 Đặc điểm hình thái 7 1.1.4 Đặc tính sinh học 12 1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112] 14 1.1.6 Thành phần hóa học 15 1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng 18 1.1.8 Tình hình nghiên cứu 21 1.2 Nuôi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) 23 1.2.1 Sự phát sinh cơ quan 23 1.2.2 Sự phát sinh phôi thể hệ 24 2 VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Nuôi cấy in vitrođể tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 26 2.1.1 Vật liệu 26 MỤC LỤC iv 2.1.2 Phƣơng pháp 26 2.2 Sàng lọc và thu nhận plumabgin từ nguồn nguyên liệu in vitrocủa D.burmani: tìm hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào bằng phƣơng pháp Sulforhodamine B (SRB)28 2.2.1 Các bƣớc tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro của D. burmani 30 2.2.2 Xác định cấu trúc và hàm lƣợng hợp chất 31 2.3 Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bàoD. burmani nhằm thu nhận plumbagin33 Vật liệu 33 Phƣơng pháp 33 2.3.1 Tạo mô sẹo 33 2.3.2 Tạo dịch huyền phù tế bào 34 2.3.3 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận plumbagin lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 36 2.4 Xử lý thống kê 39 3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 40 3.1 Nuôi cấy in vitrođể tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 40 3.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 40 3.1.2 Nhân giống bằng chồi bên 40 3.1.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào 43 3.1.4 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh 45 3.2 Sàng lọc và thu nhận plumbagin từ nguồn nguyên liệu in vitro 46 3.2.1 Xử lý mẫu và điều chế các loại cao chiết 46 3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bàoin vitrotheo phƣơng pháp Sulforhodamine B (SRB) 47 MỤC LỤC v 3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 52 3.3.1 Tạo mô sẹo 52 3.3.2 Tạo dịch huyền phù tế bào 59 3.3.3 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 63 4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 77 4.1 Kết luận 77 4.2 Đề nghị 77 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC a DANH MỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid ABS : Absorbent BA : 6-benzylaminopurine BSA : Bovine Serum Albumine COSY : COrelation SpectroscopY DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DLD-1 : dòng tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời DMSO : Dimethyl sulphoxide DTT : 1, 4-DiThioTreitol DW : Dry weight (trọng lƣợng khô) FBS : Fetal Bovine Serum FW : Fresh weight (trọng lƣợng tƣơi) GB5 : Gamborg B5 HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation. HMQC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation. HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) I : tỷ lệ ức chế sự tăng sinh tế bào (%) IAA : indoleacetic acid IBA : 3-indolebutyric acid IR : Infrared KN : Kinetine LB : Luria – Bertani MS : Murashige & Skoog, 1962 NAA : Naphthalene Acetic Acid NMR : Nuclear Magnetic Resonance DANH MỤC vii OD : Optical Density PAL : Phenylamine ammonia lysase PBS : Phosphate Buffer Saline PVP : Poly Vinyl Pyrrolidone SRB : SulfoRhodamine B TAL : Tyrosine ammonia lyase TBS : Tris Buffered Saline TCA : Trichloroacetic acid TTC : TriphenylTetrazolium Chloride UV : Ultra Violet KÍ HIỆU J : Hằng số ghép cặp MHz : Megahertz s, d, t : Singlet (mũi đơn), Doublet (mũi đôi), Triplet (mũi ba) DANH MỤC viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [99] 16 Bảng 1.2. Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin và 7-methyljuglone [99] 16 Bảng 1.3. Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera [99] 16 Bảng 1.4. Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera [99] 19 Bảng 1.5. Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây nhất của D. burmani [73] 20 Bảng 1.6. Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera 21 Bảng 1.7. Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera 22 Bảng 2.1. Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D 38 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự nhân chồi bên 41 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự tạo chồi bất định từ phát hoa 43 Bảng 3.3. Phần trăm nước của hai loại nguyên liệu tươi Drosera in vitro (%) 46 Bảng 3.4. Thu suất các loại cao từ bột cây D.burmani 46 Bảng 3.5. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các cao chiết (100µg/ml) 47 Bảng 3.6. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. burmani 48 Bảng 3.7. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn (100µg/ml) 49 Bảng 3.8. Kết quả sắc ký cột phân đoạn 3 của bảng 3.14 50 Bảng 3.9. Phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và HMBC của hợp chất B 51 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nền khoáng, nồng độ đường lên khả năng sống của lớp mỏng tế bào 53 DANH MỤC ix Bảng 3.11 . Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá và rễ D. burmani 54 Bảng 3.12. Tỷ lệ % mẫu tạo mô sẹo từ lá dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA 56 Bảng 3.13. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA 57 Bảng 3.14. Hàm lượng plumbagin tích lũy trong các loại mô khác nhau 63 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đến thời gian tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào rễ Drosera 64 Bảng 3.16. Ảnh hưởng ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng trưởng và tích lũy plumbagin 66 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 68 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D. burmani 71 Bảng 3.19.Ảnh hưởng của acid salicylic lên lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 74 Bảng 3.20. Kết quả định lượng plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D. burmani đã được ứng dụng kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng HPLC 75 DANH MỤC x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên trình tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome [122] 5 Hình 1.2. Sự phân bố Drosera trên thế giới (vùng có màu xanh lá) [121] 6 Hình 1.3. Các dạng cấu trúc thân của Drosera 7 Hình 1.4. Các hình dạng khác nhau của lá và lông tuyến Drosera [127] 8 Hình 1.5. Màu sắc đa dạng của hoa Drosera [130] 10 Hình 1.6. Mặt cắt ngang của hoa Drosera 10 Hình 1.7. Các dạng nang chứa hạt của Drosera [125] 11 Hình 1.8. Hình thái hạt Drosera [56] 11 Hình 1.9. Phương tiện và cơ chế bắt côn trùng của D. indica L. 13 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tách chiết từ các loài Drosera [22]. 17 Hình 1.11. Một số flavonoid và flavonoid glucoside có trong Drosera 17 Hình 1.12. Một số hình thái lạ mắt của Drosera [131] 20 Hình 2.1 . Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bên [7] 27 Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bất định [64] 28 Hình 2.3. Buồng đếm tế bào và quy tắc đếm trong 1 ô lớn có thể tích 0,1mm 3 37 Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của D. burmani 41 Hình 3.2.Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D. burmani sau 5 tuần 42 Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của D. burmani 44 Hình 3.4. Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. burmani 44 [...]... hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 74 Hình 3.23 Sinh tổng hợp plumbagin ở Drosera và một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp 76 xii PHẦN MỞ ĐẦU PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài/dự án: NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ SẸO VÀ DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY BẮT RUỒI DROSERA BURMANI VAHL NHẰM THU NHẬN PLUMBAGIN Chủ nhiệm đề tài/dự án: QUÁCH NGÔ... (plumbagin: 1,4%) và D capensis (7-methyljuglone: 0,5%), Huyền phù tế bào D.muscipula trên môi trƣờng (McC) có bổ sung 2,4-D, NAA và tạo ra plumbagin (2,59%) sau 30 ngày nuôi cấy Huyền phù tế bào D rotundifolia trên môi trƣờng MS không có naphthoquinone Tạo mô sẹo và nuôi cấy thành công dịch huyền phù tế bào để thu nhậnplumbagin từ cây Drosophyllum lusitanicum trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l IBAvà... dịch huyền phù D burmani làm nguồn nguyên liệu thu nhận plumbagin: 1 Sinh khối tế bào D burmani trong dịch huyền phù đạt 64.3g/lít 2 Hoàn toàn không bị tạp nhiễm 3 Thời gian nuôi cấy từ cây con in vitro cho đến khi thu đƣợc dịch huyền phù ổn định là 3 tháng 4 Hàm lƣợng plumbagin đƣợc xác định khoảng 0.05% FW (so với trọng lƣợng tƣơi sinh khối) Bài báo: 3 bài 1 Nhân giống in vitro Cây Bắt ruồi Drosera. .. hay cụm chồi, tùy thu c vào loài, trạng thái sinh lý của mô cấy và môi trƣờng nuôi cấy [10] Nuôi cấy mô phân sinh ngọn là một phƣơng pháp hiệu quả trong vi nhân giống, sản xuất cây sạch bệnh bảo tồn và lƣu trữ nguồn gen Sự phát sinh cơ quan chịu ảnh hƣởng bởi tuổi, trạng thái sinh lý của mô cấy của chính những cơ quan bên dẫn xuất từ mô phân sinh ngọn và sự thay đổi của các điều kiện môi trƣờng, đặc... Hình 3.14 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo 60 Hình 3.15 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào .61 Hình 3.16 Tế bào D burmani bắt màu hồng khi nhuộm TTC – A: tế bào trong dịch huyền phù từ mô sẹo; B: tế bào trong dịch huyền phù từ lớp mỏng tế bào .62 Hình 3.17 Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D burmani có mật độ tế bào ban đầu khác... in vitrohay thu nhận dƣợc chất từ loài cây này ở Việt Nam chƣa đƣợc biết đến, tình hình nghiên cứu về chúng chƣa đƣợc đào sâu và còn khá mới mẻ 1.1.8.2 Ngoài nước Bảng 1.6 Những nghiên cứu về nhân giống in vitrogiống Drosera Loài Mẫu cấy Môi trƣờng Kết quả Hạt RM Lá RM Cây in vitro Nhân chồi D pygmaea Hạt Agar Cây in vitro D aliciae Hạt RM Cây in vitro Hạt MS; RM Cây in vitro Lá GB5 Tạo mô sẹo Chồi MS... pháp HPLC Tạo hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào D burmani (thông qua mô sẹo và trực tiếp từ lớp mỏng tế bào) Tối ƣu hóa đƣợc điều kiện nuôi cấy dịch huyền phù D burmani để thu đƣợc dịch huyền phù có hàm lƣợng plumbagin cao nhất: 1 PHẦN MỞ ĐẦU Điều kiện nuôi cấy thích hợp (ủ tối, tốc độ lắc 125 vòng/phút, mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 2,6×104 tế bào/ml), Bổ sung tiền chất (phenylalanine 0,3mM... dịch huyền phù tế bào đƣợc 8 ngày tuổi); Loại bỏ 2,4-D trong thành phần môi trƣờng nuôi cấy đều là những kỹ thu t giúp gia tăng tích lũy plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D burmani Trong đó, việc loại bỏ 2,4-D (từ ngày thứ 8 trở đi) có ảnh hƣởng rõ nhất đến khả năng tích lũy plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D burmani, giúp tăng hàm lƣợng plumbagin lên gấp 2,58 lần Sản phẩm: Quy trình tạo dịch. .. trình Nuôi cấy in vitro D commnis St Hil trên môi trƣờng lỏng McC cho hàm lƣợng naphthoquinone = 0,17% DW Nuôi cấy trong bioreator 25l, sau 3 tháng thu đƣợc 1,2 kg D communis tƣơng ứng với 200mg plumbagin Cảm ứng tổng hợp và tiết plumbagin vào môi trƣờng trên dung dịch huyền phù tế bàoDrosophyllum lustitanicum bằng chitin, chitosan, glucan Xác định hàm lƣợng naphthoquinone trên cây: Dionaea muscipula (plumbagin: ... hai giai đoạn: tạo các tế bào sinh phôi (mô sẹo, dịch huyền phù tế bào) và tiến hóa phôi từ các tế bào sinh phôi [11] Sự tạo mô sẹo: Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thƣờng đƣợc tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan Do đó, các phần non của cơ thể thực vật dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dƣới tác động của một auxin . PHẦN MỞ ĐẦU 1 PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài/dự án: NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ SẸO VÀ DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY BẮT RUỒI DROSERA BURMANI VAHL NHẰM THU NHẬN PLUMBAGIN Chủ nhiệm đề tài/dự án: QUÁCH NGÔ DIỄM. tăng trưởng và sự tích l y plumbagin của dịch huyền phù tế bào D. burmani 71 Bảng 3.19.Ảnh hưởng của acid salicylic l n l n sự tăng trưởng và sự tích l y plumbagin của dịch huyền phù tế bào. Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bàoD. burmani nhằm thu nhận plumbagin3 3 Vật liệu 33 Phƣơng pháp 33 2.3.1 Tạo mô sẹo 33 2.3.2 Tạo dịch huyền phù tế bào 34 2.3.3 Ứng dụng một số kỹ thu t