SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM CÁC TÝP HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS) Ở PHỤ NỮ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : TS.BS Vũ Thò Nhung BV Hùng Vương CƠ QUAN PHỐI HP CHÍNH : 1.Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG-HCM, Khoa Sinh học, bộ môn Vi sinh-sinh học phân tử 2.Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, Khoa Y, bộ môn Vi sinh. CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI : Sở Khoa Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh (Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội Đồng nghiệm thu đề tài ngày 15/9/2006) Năm 2006 ii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa………………………………………………………………………………………………………………… ………… i Mục lục…………………………………………………………………………………………………………………………………………. ii Danh mục các chữ viết tắt…………………………………………………………………………………………………… iii Bảng đối chiếu Việt –Anh…………………………………………………………………………………………………… iv Danh mục các bảng …………………………………………………………………………………………………………………. v Danh mục các hình ………………………………………………………………………………………………………………… vi MỞ ĐẦU …………………………………………………………………………………………………………………………. ………… 1 CHƯƠNG I : Tổng quan tài liệu……………………………………………………………………………… ………. 3 A) NHỮNG ĐẶC ĐIỂM CỦA HPV …………………………………………………………………… 3 1. Cấu tạo…………………………………………………………………………………………………………. 3 2. Bộ gene HPV…………………………………………………………………………………………… 4 3. Dòch tễ học của HPV……………………………………………………………………………… 8 4. Các týp HPV ……………………………………………………………………………………………… 9 5. Cơ chế sinh bệnh …………………………………………………………………………………… 12 6. Những yếu tố nguy cơ nhiễm HPV ………………………………………………… 16 B) XÉT NGHIỆM TẦM SOÁT HPV……………………………………………………………… 16 CHƯƠNG II : ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… ………………………. 21 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ………………………………………………………………………………………………………………. 39 CHƯƠNG IV : BÀN LUẬN ……………………………………………………………………………………………………………. 50 KẾT LUẬN…………………………………………………………………………………………………………………… ……………………… 58 ĐỀ NGHỊ ………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………………………………………………………. 60 PHỤ LỤC ………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 65 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASCUS Atypical squamous cells of undetermined significance CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia CIN1 grade 1 Cervical Intraepithelial Neoplasia CIN2 grade 2 Cervical Intraepithelial Neoplasia CIN3 grade 3 Cervical Intraepithelial Neoplasia CNV Công nhân viên CTC Cổ tử cung DCTC Dụng cụ tử cung GPB Giải phẫu bệnh HPV Human papilloma virus HSIL High grade of squamous intraepithelial lesion LSIL Low grade of squamous intraepithelial lesion ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction TC Tử cung TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh URR Upstream Regulatory Region XN Xét nghiệm iv BẢNG ĐỐI CHIẾU VIỆT - ANH ASCUS Tế bào gai không điển hình không rõ ý nghóa CIN Dò sản CIN1 Dò sản nhẹ CIN2 Dò sản vừa CIN3 Dò sản nặng HSIL Tổn thương trong thượng mô gai mức độ cao IARC Cơ quan nghiên cứu Ung thư Thế giới LSIL Tổn thương trong thượng mô gai mức độ thấp Pap Phết tế bào âm đạo – cổ tử cung WHO Tổ chức Y tế Thế giới v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Phân bố theo nhóm tuổi 38 3.2 Phân bố theo các đặc điểm khác của đối tượng nghiên cứu 39 3.3 Phân bố theo các đặc điểm khác của đối tượng nghiên cứùu 40 3.4 Tình trạng bệnh Phụ khoa của đối tượng nghiên cứu 40 3.5 Kết quả Giải phẫu bệnh cổ tử cung 41 3.6 Kết quả tế bào học cổ tử cung 41 3.7 Kết quả PCR tầm soát và đònh týp HPV 42 3.8 Tình hình nhiễm các týp HPV 43 3.9 So sánh Kết quả Giải phẫu bệnh cổ tử cung và kết quả theo PCR 44 3.10 Liên quan giữa GPB và độ nguy cơ của các nhóm HPV 45 3.11 So sánh Kết quả tế bào cổ tử cung và kết quả theo PCR 45 3.12 Liên quan giữa tình trạng kinh tế và HPV 46 3.13 Liên quan giữa nhóm tuổi và HPV 47 3.14 Liên quan giữa nhóm tuổi và Các tổn thương 47 tiền ung thư Cổ tử cung vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1 Cấu trúc, hình dạng HPV 4 2 Cấu trúc bộ gene của HPV 5 3 Bộ gene HPV dạng mạch thẳng 7 4 Sự tiến triển của tổn thương cổ tử cung do HPV 11 5 Chu kỳ sống của HPV 12 6 Quy trình phát hiện và đònh type HPV 17 7 Quy trình tầm soát tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 19 1 Mở đầu Ung thư cổ tử cung là bệnh lý phổ biến, đứng hàng thứ ba trong số các ung thư ở phụ nữ trên thế giới và là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu của giới nữ , nhất là ở những nước đang phát triển mặc dù thực tế thì đây là bệnh có thể phòng ngừa được [12] . Mỗi ngày có khoảng 1400 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh Ung thư cổ tử cung, 750 người chết vì bệnh này [5] . Như vậy, hàng năm có 500.000 trường hợp mắc mới và có khoảng 270.000 người tử vong vì ung thư cổ tử cung [5] .Đặc biệt là khoảng 50% các trường hợp ung thư cổ tử cung xảy ra ở Châu Á. Theo IARC thì tỷ lệ và tử suất ung thư cổ tử cung ở các nước đang phát triểàn tăng cao vì những nơi đó không có chương trình tầm soát ung thư cổ tử cung [30] . Tại Việt Nam , theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2.000 thì tỷ lệ ung thư cổ tử cung vào khoảng 16-24/100.000 . Tại TP. Hồ Chí Minh, đây là bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất ở người phụ nữ (tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là 28,6/100.000 dân) [37ø] . Trong thập niên 70, Human papillomavirus (HPV) được mô tả như là một trong những tác nhân gây biến đổi tế bào cổ tử cung (dò sản cổ tử cung), tiền đề của ung thư cổ tử cung [12] .Người ta cho là nguy cơ do HPV chiếm khoảng 82% ở các nước đang phát triển [38] . Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã khẳng đònh sự liên quan mật thiết giữa HPV và ung thư cổ tử cung. Ngoài ra nó còn có vai trò trong ung thư vùng hậu môn, âm hộ, âm đạo và dương vật cũng như một số ung thư vùng hầu họng. Người ta phân biệt các týp có nguy cơ thấp ít khi làm tiến triển đến ung thư và các týp nguy cơ cao thường gây ung thư. Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu dòch tễ học mang tính đại diện được tiến hành trên đề tài này. Như vậy , việc tìm hiểu về tình trạng nhiễm các genotýp HPV ở phụ nữ là vấn đề rất đáng quan tâm vì nhờ đó có thể góp phần tiên lượng khả năng diễn tiến bệnh khi 2 chưa tiến đến ung thư để các Bác só lâm sàng có thể có thái độ xử trí thích hợp , có lợi cho ngươi bệnh Đó là lý do chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát tình hình nhiễm các týp HPV (Human Papilloma Virus) ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật sinh học phân tử” Mục tiêu nghiên cứu : • Mục tiêu tổng quát : Nghiên cứu dòch tễ học các genotýp HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi 18-69. • Mục tiêu chuyên biệt : 1.Xác đònh tỉ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi 18-69. 2.Xác đònh tỉ lệ nhiễm các týp HPV nguy cơ cao. 3.Xác đònh mối tương quan giữa hình ảnh tế bào học, mô bệnh học với các týp HPV. 4. Đánh giá xét nghiệm PCR chẩn đoán và đònh týp HPV. 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU A) NHỮNG ĐẶC ĐIỂM CỦA HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS) 1. Cấu tạo : Human Papilloma Virus (HPV), một virus có vật liệu di truyền là DNA, gây bệnh ở người thuộc họ Papovaviridae [14] . Khác với các loại virus như viêm gan siêu vi A, C, SARS coronavirus có cấu tạo di truyền RNA. Bởi vì virus này không thể phát triển trong thực nghiệm và không có xét nghiệm huyết thanh nào đáng tin cậy, nên sự nhận diện Human PapillomaVirus và đònh týp HPV căn cứ vào tiêu chuẩn Nucleic Acid. Một đặc điểm rất quan trọng của virus này là chúng không phát triển trong điều kiện nuôi cấy ở phòng thí nghiệm [22] nên để nghiên cứu, chỉ có thể dựa trên nghiên cứu invivo trên người hay động vật bò nhiễm. Những mẫu nhiễm này có thể lưu trữ ở -20 o C trong một thời gian dài mà không làm giảm khả năng hoạt động của virus. HPV có cấu trúc capsid không vỏ, đối xứng xoắn ốc. Virion có đường kính 52-55nm, vỏ gồm 72 đơn vò capsomer. Mỗi đơn vò là một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này có thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dòch đặc hiệu). Riboxom có hệ số lắng là 21S. Tiểu phần lớn có một vòng xoắn cuộn có thể chuyển đổi thành tiểu phần nhỏ trong quá trình sao chép. Ngoài ra, một tiểu phần thứ 3 có hệ số lắng là 14S sẽ xuất hiện chòu trách nhiệm sao chép lại DNA tế bào chủ khi bao trong Virion. Khi đó, capsid chứa DNA tế bào chủ được gọi là Virion giả hay Pseudovirion [14] . 4 Hình 1: Cấu trúc, hình dạng HPV 2. Bộ gen HPV 2.1. Cấu trúc bộ gen của HPV Đó là một DNA mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại ở dạng siêu xoắn hình vòng, chứa khoảng 7800-8000 cặp base, có 10 khung đọc mở ORF [22] . Sự sao chép, phiên mã xảy ra trên một mạch và theo một chiều duy nhất. Bộ gen được phân làm 3 vùng [22] : • Vùng điều hoà URR (Upstream Regulatory Region) hay cũng còn gọi là vùng điều hoà dài LCR (Long Control Region): chiếm 10% chiều dài bộ gen, chứa khoảng 800-1000 cặp base tùy từng týp. Đây cũng là vùng biến động nhất trong bộ gen HPV. Trình tự vùng URR bao gồm: o Trình tự tăng cường: là nơi gắn của các nhân tố phiên mã (AP- 1, NF1, oct 1, TEF1, TEF2, YY1 …). o Promoter (gen khởi động) cho sự phiên mã tổng hợp RNA (được gọi là P97 ở HPV16, và P105 ở HPV18). Promoter này bao gồm một hộp TATA và vùng khởi đầu phiên mã. o Điểm khởi đầu sao chép ORI. . . Protein capsid (L1) Acid nucleic (DNA) [...]... sử dụng phương pháp tế bào học để phát hiện sớm ung thư cổ tử cung hay chẩn đoán nhiễm HPV qua hình ảnh tế bào học Gần đây có thêm một số nghiên cứu với phương pháp sinh học phân tử: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán một số bệnh thường gặp ở Việt Nam” (Hồ Huỳnh Thùy Dương & cs, 2004)[32], “Xây dựng quy trình phát hiện HPV (Human papillomavirus) phục vụ nghiên cứu và chẩn... & cs, 2002) Thực hiện PCR đònh týp 17 Tình hình nghiên cứu trên thế giới : Một số kỹ thuật phân tử như PCR, lai tại chỗ (in situ hybridization) được phát triển gần đây để phát hiện sự hiện diện của DNA HPV trong tế bào cổ tử cung Các kỹ thuật phân tử này còn cho phép xác đònh được các týp và phân biệt các thương tổn cổ tử cung không liên quan đến HPV Đặc biệt kỹ thuật PCR, với độ nhạy và độ đặc hiệu... khoảng 269 triệu phụ nữ trên thế giới nhiễm HPV .Tình trạng viêm nhiễm này dẫn đến 440.000 người bò ung thư cổ tử cung hàng năm (Châu u có 23.000 – 35.000 ở Châu Mỹ Latin và 18.000 người ở Bắc Mỹ) [26] Số phụ nữ cóù nguy cơ nhiễm HPV khoảng 2 tỷ người Đỉnh tuổi nhiễm HPV thay đổi tùy đòa phương Thí dụ như ở Phần Lan, nhiễm HPV thường xảy ra trong độ tuổi 20 –29 tuổi Nghiên cứu trên 10.758 phụ nữ tuổi từ 20-29... ung thư cổ tử cung ở phụ nữ trên 29 tuổi chứng tỏ HPV- DNA có giá trò trong việc tầm soát hay loại trừ tân sản trong biểu mô cổ tử cung (CIN) Kết quả HPV và PAP HPV (-) PAP (-) HPV (+) PAP (- ) HPV (-) ASC-US Lập lại Pap & HPV 3 năm 6-12 tháng HPV (+) ASC-US PAP ≥ LSIL Soi cổ tử cung 12 tháng Hình 7 : Quy trình tầm soát tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 19 Tình hình nghiên cứu trong nước Các tác giả... trong cơ quan sinh dục trở thành nơi phổ biến nhất cho virus phát triển Giai đoạn tiềm ẩn: Đây là giai đoạn có sự xâm nhiễm của HPV nhưng các kỹ thuật xét nghiệm tế bào học, hình thái học, soi phóng đại đều cho kết quả tế bào bình thường Chỉ 13 những xét nghiệm sinh học phân tử có độ nhạy cao như PCR, lai phân tử mới có khả năng phát hiện thấy HPV Thời kỳ này có thể kéo dài 1-8 tháng, tuỳ tình trạng sức... 20-29 của Susanne K Kjaer ở 8 Copenhagen tỷ lệ nhiễm HPV là 14% [26] cũng như một nghiên cứu khác của Anna R.Giuliano ở vùng biên giới Hoa Kỳ- Mexico cho tỷ lệ nhiễm HPV là 14,4% trong nhóm 2319 phụ nữ từ 15-79 tuổi [1] Có nghiên cứu cho thấy nguy cơ nhiễm HPV là 79% Phụ nữ Tỷ lệ này cũng tương đương trong nam giới Cách truyền bệnh chủ yếu qua quan hệ tình dục[26] 4 Các týp HPV HPV là một trong những... nhiễm Còn ở những bệnh nhân không thuyên giảm thì khả năng chuyển sang ung thư ác tính là cực kỳ cao 6 Những yếu tố nguy cơ nhiễm HPV : Hành vi quan hệ tình dục : số bạn tình, bạn tình bò nhiễm HPV, mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục (Chlamydia,Neisseria,Trichomonas, Herpes Simplsex virus) Tuổi : dưới 25 tuổi thì tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất Tình trạng hệ thống miễn nhiễm của cơ thể : dễ bò nhiễm HPV. .. về tần suất nhiễm các týp HPV giữa các vùng đòa lý nhưng týp 16,18 thường gây ung thư ở hầu hết các nơi trên thế giới [ 21,27] Hầu hết những trường hợp nhiễm HPV là tạm thời Nếu bệnh nhân có sức đề kháng mạnh thì có thể khỏi bệnh Do cơ chế nào chưa rõ , có khoảng 5-10% phụ nữ nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao sẽ còn tồn tại tình trạng nhiễm HPV này Những bệnh nhân ấy có khả năng tiến triển sang các tổn thương... Trọng Hiếu & Cs với WHO năm 2002 bằng test HPV- DNA, cho thấy tỉ lệ nhiễm HPV ở một quận nội thành ở thành phố Hồ Chí Minh là 10,9% và 2% ở Hà Nội HPV được tìm thấy nhiều nhất ở phụ nữ dưới 25 tuổi ở TP.Hồ Chí Minh (22,3%)[35,36] Nghiên cứu của Phạm Việt Thanh [ 41] về tỷ lệ nhiễm HPV ơ”ø 408 trường hợp có tổn thương tế bào HSIL và ung thư cổ tử cung là 93,14% trong đó nhiễm nhóm nguy cơ cao là 95% và... bố (Van den Brule & cs, 2002) do công ty Integrated DNA Technologies (IDT – Mỹ) tổng hợp được trình bày trong bảng 1 Bảng 1 : Trình tự các primer và probe sử dụng trong đề tài Tên MY11 MY09 GP5+ GP6+ HPV6 HPV1 1 HPV4 2 HPV4 3 HPV6 1 HPV7 0 HPV7 1 HPV8 1 HPV1 6 HPV1 8 HPV3 1 HPV3 3 Trình tự nucleotide 5'-GCM CAG RGW CAT AAY AAT GG-3' 5'-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3' 5'-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3' 5'-GAA . SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM CÁC TÝP HPV (HUMAN PAPILLOMAVIRUS) Ở PHỤ NỮ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC. do chúng tôi thực hiện nghiên cứu Khảo sát tình hình nhiễm các týp HPV (Human Papilloma Virus) ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Mục tiêu nghiên cứu : • Mục tiêu. HỌC PHÂN TỬ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI : TS.BS Vũ Thò Nhung BV Hùng Vương CƠ QUAN PHỐI HP CHÍNH : 1.Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG -HCM, Khoa Sinh học, bộ môn Vi sinh- sinh học phân tử 2.Đại học