1 PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN TÍNH KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA MỘT SỐ CHẤT BẰNG REAL-TIME RT-PCR Chủ nhiệm đề tài: Trần Quốc Vũ Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện đề tài: 12 tháng Kinh phí được duyệt: 80 triệu Kinh phí đã cấp: 80 triệu theo TB số : TB-SKHCN ngày / / Mục tiêu: Xây dựng, hoàn chỉnh quy trình in vitro xác định khả năng tăng cường miễn dịch của hợp chất tự nhiên. Nội dung: Công việc dự kiến Công việc đã thực hiện Nội dung 1: Xây dựng và hoàn chỉnh quy trình real-time RT-PCR đo sự thay đổi biểu hiện mRNA của hai loại cytokine IL-2 và TNF-α trong 2 dòng tế bào. Tối ưu hóa một số điều kiện phản ứng, xây dựng và hoàn chỉnh được quy trình real-time RT-PCR. Nội dung 2: Áp dụng real-time RT-PCR để phát hiện khả năng kích thích miễn dịch của một số chất. Kết quả về tác động của một số hợp chất trên sự biểu hiện mRNA IL-2 và TNF-α. 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN Hệ miễn dịch của con người có thể bảo vệ cơ thể chống lại tác hại do các vi sinh vật xâm nhiễm gây ra. Hệ miễn dịch bao gồm miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch đặc hiệu. Trong đó, các tế bào giết tự nhiên (NK-nature killer), hệ thống bổ thể, đại thực bào, các tế bào trình diện kháng nguyên và bạch cầu trung tính tạo thành hệ miễn dịch bẩm sinh, chúng đáp ứng ngay lập tức, không đặc hiệu với tác nhân gây bệnh. Nếu tác nhân gây bệnh (như vi khuẩn, virus) vượt qua hàng rào đầu tiên này, hệ miễn dịch đặc hiệu, bao gồm miễn dịch dịch thể và trung gian tế bào sẽ bắt đầu hoạt động. Các kháng nguyên (nấm, virus, vi khuẩn, độc tố…) bị xử lý và được các tế bào trình diện kháng nguyên trình diện với tế bào T hỗ trợ (T H có mang protein bề mặt CD4), qua đó hoạt hóa sự tiết cytokine. Ngoài các cơ chế tự nhiên, có những yếu tố bổ sung có khả năng kích thích và ức chế miễn dịch của cơ thể. Tính kích thích miễn dịch sẽ nâng cao khả năng miễn dịch tổng thể của cơ thể và phản ứng miễn dịch không đặc hiệu chống lại các tác nhân gây bệnh của vi sinh vật. Các tác nhân kích thích miễn dịch cũng hoạt động để nâng cao đáp ứng miễn dịch dịch thể và tế bào, bằng cách tăng cường tiết cytokine, hoặc bằng cách trực tiếp kích thích tế bào lympho T và B. Cytokine là các peptide và glycoprotein có nhiều tác động, có nhiều nguồn, nhiều mục tiêu, và nhiều chức năng. Chúng điều khiển các đáp ứng miễn dịch thông qua khả năng kích thích hoặc ức chế các hoạt động của tế bào thể hiện qua sự hoạt hóa, tăng sinh, biệt hóa tế bào cũng như điều hòa sự tiết của các kháng thể hoặc các cytokine khác. Trong đáp ứng miễn dịch, cytokine bám lên các thụ thể đặc hiệu trên màng của tế bào đích và khởi sự các con đường truyền tín hiệu dẫn đến thay đổi sự biểu hiện gene ở tế bào đích và các phân tử cytokine có thể tác động theo kiểu tự tiết, cận tiết hoặc nội tiết. Vì vậy, cytokine rất quan trọng trong phản ứng viêm bẩm sinh và thích ứng. Trong đó, các tế bào chính tiết cytokine là tế bào T H và đại thực bào. Cytokine do tế bào T H tiết ra sẽ tác động trở lại làm biệt hóa các tế bào T H thành tế bào T H1 và T H2 . Hoạt động của tế bào T H1 liên quan đến sự hoạt hóa các đại 3 thực bào, đồng thời cũng liên quan đến con đường miễn dịch qua trung gian tế bào; trong khi các tế bào T H2 lại có ảnh hưởng đến sự tạo và tiết kháng thể. Một loại tế bào T khác là tế bào T gây độc (có mang protein CD8 trên bề mặt) lại cảm ứng apoptosis ở các tế bào của cơ thể mang kháng nguyên lạ (Tan & cs, 2004; Oppenheim, 2001) . TNF-α là một trong các cytokine chính trong đáp ứng miễn dịch, do đại thực bào hoặc tế bào T tạo ra khi đáp ứng viêm với vi khuẩn hay các tác nhân kích thích. TNF-α hoạt động như một yếu tố dẫn dụ hóa học, lôi kéo đại thực bào hay các tế bào bạch cầu đến vị trí viêm. Ngoài ra, TNF-α còn cho thấy có khả năng tăng cường đáp ứng kháng ung thư. Trong khi đó, IL-2 được coi như là một yếu tố tăng trưởng tế bào T, thúc đẩy sự tăng sinh, sự hoạt hóa và biệt hóa tế bào T, B. IL-2 có thể kích thích tế bào NK và các tế bào gây viêm như tế bào mono/đại thực bào và các tế bào trung tính. Bên cạnh đó, IL-2 còn có tác động lên sự sản xuất các cytokine khác như IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α. Người ta chú ý đến ứng dụng lâm sàng của IL-2 do khả năng hoạt hóa tế bào NK và tăng cường đáp ứng kháng tế bào ung thư. Các liệu pháp dựa trên IL-2 đã được FDA cho phép tiến hành trong điều trị ung thư thận suốt 2 thập niên qua (McDermott & cs, 2004) Thảo dược đã được sử dụng để điều trị bệnh từ lâu đời. Hiện nay, người ta ước tính rằng khoảng 50% các loại thuốc tổng hợp có nguồn gốc từ chất hóa học thực vật. Các nghiên cứu khoa học gần đây đã chứng minh rằng nhiều loại thảo mộc có khả năng giúp tăng cường hệ thống miễn dịch bằng cách kích thích các tế bào bạch cầu và cũng như điều hòa biểu hiện các cytokine quan trọng trong hoạt động miễn dịch của cơ thể (Tan & cs, 2004). Một số nghiên cứu tiêu biểu như: Melanin, được chiết từ Nigella sativa L. cảm ứng sự biểu hiện của TNF-α, IL-6 và VEGF mRNA của monocyte, tế bào đơn nhân ngoại vi, dòng tế bào THP-1; ở mức độ protein, melanin cảm ứng sự tạo thành TNF- α, IL-6 (El-Obeida & cs, 2006). LZ-8, một protein từ Ganoderma lucidum có khả năng kích thích các tế bào lympho ngoại vi tạo IL-2, đồng thời làm tăng sự biểu hiện của thụ thể của IL-2 (Hsu & cs, 2008). 4 Các cycloartane phân lập từ Astragalus melanophrurius (Fabaceae) có hoạt tính điều hòa miễn dịch trên các tế bào lympho người được phân lập. Các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng dùng astrasieversianins II, X; astragalosides I, II, IV, và VI; cyclocanthosides E, G ở các nồng độ từ 0,01 đến 10 µg/mL có thể kích thích sự tăng sinh của các tế bào lympho người. Trong khi đó oleanolic acid and echinocystic acid phân lập từ Luffa cylindrica (Cucurbitaceae) làm tăng chỉ số thực bào, kích thích đại thực bào, làm gia tăng đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào (Ríos & cs, 2010). Các nghiên cứu về sự biểu hiện cytokine khi bị cảm ứng bởi các tác nhân gây kích thích rất đa dạng, với nhiều kỹ thuật được áp dụng cùng với các mô hình động vật, tế bào. Sau đây là những phương pháp tiêu biểu: + Kỹ thuật phát hiện protein cytokine: - Phương pháp ELISA: dùng để đo hàm lượng cytokine do các tế bào thuộc hệ thống miễn dịch (tế bào lympho, đại thực bào…) tiết ra sau khi được cảm ứng với các hợp chất. Trong phương pháp này, kháng thể kháng cytokine sơ cấp gắn trên bề mặt giếng của đĩa 96 giếng sẽ bắt giữ những cytokine tương ứng hiện diện trong mẫu (dịch nuôi cấy tế bào). Những kháng thể kháng cytokine thứ cấp đã được đánh dấu biotin được bổ sung sau đó sẽ gắn vào những cytokine nói trên. Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) gắn với biotin sẽ phân cắt cơ chất tạo sản phẩm hiện màu hoặc phát huỳnh quang của HRP. Cường độ của những tín hiệu này phản ánh khả năng cảm ứng tạo cytokine của chất thử nghiệm. Phương pháp này còn cho phép đo được lượng cytokine có trong máu của người sử dụng thuốc. - Phương pháp ELISPOT: cũng tương tự như ELISA, nhưng tế bào được gây cảm ứng sẽ phát triển trong giếng đã gắn sẵn kháng thể sơ cấp kháng cytokine. Cytokine do tế bào tiết ra đều được các kháng thể sơ cấp bắt giữ. Sau đó, những kháng thể kháng cytokine thứ cấp đã được đánh dấu biotin được bổ sung sau đó sẽ gắn vào những cytokine nói trên. Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) gắn 5 với biotin sẽ phân cắt cơ chất tạo những đốm màu. Số lượng đốm màu tạo thành sẽ được quan sát và định lượng bằng kính hiển vi và phần mềm xử lý hình ảnh (Christian & cs, 2008). - Phương pháp flow cytometry: phát hiện ra sự thay đổi thành phần tế bào trong quần thể tế bào miễn dịch cũng như hàm lượng cytokine do chúng tiết ra. Trong kỹ thuật này, các tế bào được thu nhận từ máu toàn phần hay tế bào máu đơn nhân ngoại vi sẽ được ủ với các kháng thể của các marker bề mặt đặc trưng cho từng loại tế bào (CD3, CD14, CD15, CD69…). Sau đó, các tế bào trải qua xử lý sẽ được đưa vào máy flow cytometry để phát hiện và phân tách thành các quần thể tế bào khác nhau (Christian & cs, 2008). + Kỹ thuật phát hiện sự biển hiện gene cytokine: - Phương pháp RT-PCR và real-time RT-PCR: đây là phương pháp phản ánh mức độ biểu hiện của gene mã hóa cho cytokine ở mức phiên mã. Những năm gần đây real-time RT-PCR ngày càng được sử dụng nhiều để định lượng mRNA của cytokine mục tiêu. Điều này cho thấy tiềm năng của việc định lượng sự biểu hiện mRNA nhằm xác định sự đáp ứng của các tế bào miễn dịch trong các thử nghiệm về thuốc hay các hợp chất tự nhiên. Tuy nhiên, mức độ phiên mã không phải lúc nào cũng phản ánh chính xác cytokine được tiết ra. Do đó, để đánh giá chính xác ảnh hưởng của chất cảm ứng lên các tế bào miễn dịch cần có sự phối hợp của các phương pháp trên (Christoph & cs, 2001; Prescilla, 2008; Stephan & cs, 2008). Nguồn tế bào được sử dụng để thử nghiệm chất cảm ứng kích thích miễn dịch là các tế bào thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể: tế bào mono, tế bào lympho T, Phương pháp phổ biến để phân lập các tế bào này từ máu là sử dụng ly tâm trên đệm Ficoll nhằm tách chúng khỏi hồng cầu, tiều cầu và huyết tương. Theo nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau, các tế bào miễn dịch sẽ được tiếp tục xử lý 6 để thu nhận được các nhóm tế bào thuần nhất hơn, ví dụ chỉ sử dụng tế bào mono, hoặc chỉ sử dụng quần thể tế bào lympho T (CD4, CD8) (Christian & cs, 2008). Hiện nay, ngoài việc phân lập các tế bào miễn dịch từ máu cho các thí nghiệm đo ảnh hưởng của các chất cảm ứng, việc sử dụng máu toàn phần (không loại bỏ hồng cầu, huyết tương ) cũng được áp dụng rộng rãi. Ưu điểm của phương pháp này là khi lượng mẫu máu nhỏ không đủ để tách bằng Ficoll; hạn chế các tế bào miễn dịch bị biến đổi về mặt sinh lý do quá trình tách chiết và ảnh hưởng của hóa chất; đồng thời việc sử dụng máu toàn phần nhằm tạo ra điều kiện tương tự với điều kiện tự nhiên của cơ thể. Tuy nhiên, việc sử dụng các tế bào máu từ những người tình nguyện đòi hỏi phải có sự quản lý chặt chẽ về hồ sơ sức khỏe cũng như những biến động do khả năng đáp ứng khác nhau đối với chất thử nghiệm (Christoph & cs, 2004; Prescilla, 2008; Stephan & cs, 2008). Bên cạnh đó, một số dòng tế bào của người cũng được sử dụng cho các nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc hay các hợp chất tự nhiên lên khả năng biểu hiện và sản xuất cytokine. Các dòng tế bào được sử dụng gồm có: dòng tế bào Jurkat (tế bào lympho T) có khả năng biểu hiện và tiết cytokine IL-2 ; U937 (dòng tế bào mono) có khả năng biểu hiện và tiết cytokine TNF-α, hay dòng THP1 (dòng tế bào mono)… Việc sử dụng các dòng tế bào này đã được sử dụng trong các nghiên cứu trên thế giới về cơ chế điều hòa miễn dịch, cơ chế điều hòa biểu hiện gene cytokine thông qua NF-kB (El-Obeida & cs, 2006; Grzanna & cs, 2006; Hsu & cs, 2008). Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến tăng cường hệ miễn dịch từ cây thuốc đã được công bố trong thời gian gần đây. Một số công trình sử dụng mô hình chuột được gây suy giảm miễn dịch bằng cách chiếu xạ, kết quả cho thấy một số cao chiết từ thảo dược có tác dụng làm phục hồi đáng kể tổn thương các mô lympho, tăng chức năng đại thực bào và tỷ lệ tế bào lách tạo quầng dung huyết, tăng chuyển dạng tế bào lympho ở lách chuột. Ngoài ra, thử nghiệm in vitro cho thấy làm tăng chuyển dạng tế bào lympho của máu ngoại vi người khỏe mạnh, tăng khả năng thực bào, khả năng tiết nitric oxide của bạch cầu đa nhân trung tính người (Nguyễn Thị 7 Thư & cs, 2008). Có sản phẩm chiết xuất từ cây thuốc đã được thương mại hóa như Phylamin chiết từ loài Azolla microphylla có tác dụng hoạt hoá các đại thực bào và các lympho bào, do đó tăng cường khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư (Trần Công Yên & cs, 2005). Trong khi đó, những nghiên cứu của trung tâm Sâm và dược liệu TP.HCM về tính kích thích miễn dịch của các hợp chất chiết xuất từ các cây thuốc thuộc họ Nhân sâm cho thấy cao chiết Đinh lăng có tính năng tương tự như zymosan (một chất kích thích khả năng thực bào), có khả năng làm gia tăng chỉ số thực bào của chuột bình thường và chuột đã được gây suy giảm miễn dịch. Đặc biệt các nghiên cứu về sâm Ngọc Linh và hợp chất majonosid-R2 chiết xuất từ sâm Ngọc Linh cho thấy có hoạt tính làm gia tăng chỉ số thực bào in vivo của đại thực bào ở chuột, tương tự như chất kích thích sự thực bào điển hình zymosan – A. Các thử nghiệm trên chuột gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid cho thấy bột chiết sâm vẫn duy trì được lượng bạch cầu, làm tăng trọng lượng lách và tuyến ức, gia tăng chỉ số thực bào (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007). Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để phát hiện những thay đổi ở mức độ biểu hiện gene của các cytokine quan trọng trong hoạt động miễn dịch. Vì real-time RT-PCR đang được sử dụng rộng rãi để định lượng cytokine từ tế bào, dịch thể, mô và sinh thiết. Đây là phương pháp mạnh và nhạy, có thể dùng để xác định các mức độ biểu hiện mRNA của cytokine, thường biểu hiện rất thấp trong các mô nghiên cứu. Phương pháp này cho phép phát hiện trực tiếp sản phẩm PCR trong pha tăng trưởng của phản ứng nhờ vào việc sử dụng các mẫu dò huỳnh quang (Taqman probe). Sự biểu hiện các cytokine được kiểm soát ở nhiều cấp độ nhưng sự phiên mã gene là bước đầu tiên, quan trọng trong quá trình tạo thành protein cytokine. Do đó, chúng tôi sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR, nhằm mục đích phát hiện những thay đổi của tế bào khi cảm ứng với hợp chất tự nhiên ở mức phiên mã gene, từ đó có thể phát hiện khả năng kích thích miễn dịch của các hợp chất đó. Ngoài ra, trong phạm vi đề tài này, chi phí cho việc xây dựng 8 qui trình real-time RT-PCR nhằm phát hiện sự biểu hiện cytokine thấp hơn nhiều so với việc sử dụng các bộ kit ELISA phát hiện protein cytokine (giá thành bộ kit ELISA cho từng loại cytokine với khoảng 192 phản ứng là 25-30 triệu đồng). Vì vậy, nếu dùng ELISA để nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất tự nhiên lên sự biểu hiện nhiều loại cytokine sẽ không có lợi về kinh tế. Trong khi đó, chi phí đặt mua mồi và mẫu dò cho một gene mã hóa cytokine thì thấp, nên có thể phát triển cho nhiều loại cytokine với mục đích sàng lọc. Những hợp chất có tiềm năng sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu chuyên sâu về sau ở mức độ biểu hiện protein hay lâm sàng. Mô hình tế bào mà chúng tôi sử dụng trong đề tài này là 2 dòng tế bào ung thư: dòng tế bào Jurkat, đại diện cho tế bào lympho T và dòng tế bào U937 đại diện cho tế bào mono/đại thực bào trong các thí nghiệm cảm ứng với các hợp chất tự nhiên. Chúng tôi chọn hai dòng tế bào này vì đây là dòng tế bào của người, đặt mua từ ATCC, có khả biểu hiện cytokine IL-2 (Jurkat), TNF-α (U937) khi được kích thích với các phytohaemagglutinin (PHA), lipopolysaccharide (LPS); ngoài ra, các thí nghiệm trên dòng tế bào cho phép chúng tôi kiểm soát được tính biến động của tế bào so với việc dùng tế bào máu ngoại vi hay máu toàn phần thu từ nhiều người khác nhau. Bên cạnh đó, thử nghiệm với 2 dòng tế bào này cũng cho phép chúng tôi đánh giá được tác động của từng hợp chất tự nhiên lên hai loại tế bào miễn dịch là tế bào lympho T và mono/đại thực bào một cách riêng rẽ. Vì vậy, đây là mô hình phù hợp để xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của các hợp chất tự nhiên thông qua sự biểu hiện gene IL-2 và TNF-α. Sau khi xây dựng và tối ưu hóa quy trình real-time RT-PCR xong, chúng tôi sử dụng chứng dương là phytohaemagglutinin (PHA) và lipopolysacchride (LPS) để thử nghiệm quy trình trước tiên. Hai chất này đã được chứng minh là có khả năng kích thích biểu hiện gene IL-2, TNF-α ở các tế bào lympho T và tế bào mono / đại thực bào (Dupuis & cs, 1988). 9 Ở giai đoạn thử nghiệm quy trình, chúng tôi chọn 2 hợp chất được chiết xuất từ sâm Việt Nam là majonosid-R2 và ginsenosid-Rg1 làm chất gây cảm ứng; đây là những hợp chất đã được Trung tâm Sâm và dược liệu TP.HCM nghiên cứu, cho thấy có khả năng gây kích thích miễn dịch, làm tăng chỉ số thực bào khi thử nghiệm trên chuột (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007). Ngoài ra, nhiều công trình trên thế giới cũng cho thấy ginsenosid-Rg1 có một số ảnh hưởng nhất định đối với hoạt động miễn dịch. Theo Qu và cộng sự (2011), khi tiêm chuột với hỗn hợp Rg1 và kháng nguyên Toxoplasma gondii SAG1 tái tổ hợp làm gia tăng đáng kể đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên này ở chuột. Trong khi đó, nghiên cứu của Sun và cộng sự (2008) cho thấy một mình Rg1 có thể nâng cao đáng kể việc sản xuất isotypes IgG chuyên biệt kháng nguyên và sự tiết IL-5 và IFN-γ (Qu & cs, 2011; Sun & cs, 2008). Trong khi đó, majonosid-R2 có khả năng ức chế đáng kể lượng TNF-α có trong huyết thanh của khi chuột được tiêm bằng DGaIN/LPS. Mặt khác, majonosid-R2 cũng có khả năng bảo vệ tế bào gan chuột nuôi cấy sơ cấp bằng cách ức chế quá trình apoptosis cảm ứng bằng D-GalN/TNF-alpha in vitro (Tran & cs, 2002). Đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real-time RT-PCR” sẽ tạo ra một công cụ hữu ích trong việc phát hiện những hợp chất (đặc biệt là những chất có nguồn gốc từ tự nhiên) có tác dụng kích thích đối với hệ miễn dịch thông qua sự biểu hiện các cytokine quan trọng (IL-2, TNF-α) của tế bào T, monocyte; qua đó góp phần đưa những hợp chất có trong cây cỏ vào các nghiên cứu ứng dụng về sau. 10 CHƯƠNG II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real-time RT-PCR” có hai nội dung nghiên cứu chính: - Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch - Áp dụng quy trình với một số chất thử nghiệm 2.1 Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch Mục tiêu: thiết lập các thông số cần thiết cho quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch 2.1.1 Nuôi cấy tế bào - Tế bào Jurkat và U937 được nuôi cấy trong môi trường RPMI1640- Glutamax (Gibco) có bổ sung 10% FBS (Gibco), 1% HEPES (Gibco), 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco) ở 37 o C, 5% CO 2 . - Sau đó, ly tâm thu sinh khối ở 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4 o C. - Rửa lại bằng PBS, tiếp tục ly tâm thu sinh khối ở 5.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4 o C. - Tách chiết RNA bằng KIT illustra RNAspin Mini (GE Healthcare). - Điện di kiểm tra RNA thu nhận được, sau đó chuyển thành cDNA bằng reverse transcriptase (Khoa Thương). - cDNA tạo thành sẽ được xác định nồng độ và bảo quản ở -20 o C cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.1.2 Kiểm tra hoạt động của các cặp mồi và mẫu dò Chúng tôi thu nhận trình tự các cặp mồi và mẫu dò cho IL-2, TNF-α và β- actin trên các công trình đã công bố trước đây [28] . Sau đó, chúng tôi sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho việc thiết kế mồi như Annhyb 4.943 và Oligo analyzer [...]... lý thống kê bằng phần mềm GraphPad Prism 5 29 3.2 Áp dụng quy trình real- time RT-PCR với một số chất thử nghiệm Đầu tiên, chúng tôi kiểm tra khả năng phát hiện sự biểu hiện gene IL-2 và TNF-α bằng quy trình real- time RT-PCR vừa xây dựng với hai chất làm chứng dương là phytohaemagglutinin (PHA) và lipopolysacchride (LPS) Đây là những chất đã được chứng minh là có khả năng kích thích biểu hiện gene IL-2,... Nhiệt độ 30 giây 72 oC 5 phút  Sản phẩm cần đạt : Quy trình real- time RT-PCR có thể phát hiện thay đổi biểu hiện gene của các cytokine mục tiêu trên các dòng tế bào tương ứng 2.2 Áp dụng quy trình với một số chất thử nghiệm Mục tiêu : kiểm tra khả năng phát hiện sự biểu hiện gene IL-2 và TNF-α bằng kỹ thuật real- time RT-PCR vừa xây dựng 2.2.1 Sự biểu hiện gene IL-2 ở tế bào Jurkat khi cảm ứng với PHA... chúng tôi không khảo sát thêm các điều kiện khác như nồng độ mồi, MgCl2 và mẫu dò 3.1.4 Quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch Với các bước đã thực hiện gồm: nuôi cấy tế bào, tách chiết RNA, tạo cDNA kiểm tra và chuẩn hóa các thông số của phản ứng real- time PCR Chúng tôi đưa ra quy trình phát hiện tính kích thích như sau:  Nuôi cấy tế bào - Giải đông tế bào Jurkat (U937), kiểm tra tình trạng... động của PHA, LPS, majonosid-R2 và ginsenosid-Rg1 trên sự biểu hiện mRNA IL-2 và TNF-α ở dòng tế bào Jurkat, U937 18 CHƯƠNG III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch Các bước xây dựng quy trình được tiến hành theo lưu đồ sau : Nuôi cấy tế bào và thu nhận tế bảo Tách chiết RNA và chuyển thành cDNA Kiểm tra hoạt động của mồi và mẫu dò - BLAST - PCR - Giải trình. .. đệm N9 (Wu & cs, 2007) 35 Hình 3.8: Mức độ thay đổi biểu hiện gene TNF-α ở tế bào U937 khi được cảm ứng ginsenosid-Rg1 Với các kết quả thu được từ việc áp dụng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch bằng kỹ thuật real- time RT-PCR đối với majonosid-R2 và ginsenosidRg1, chúng tôi có thể đánh giá được ảnh hưởng của các chất này lên sự biểu hiện mRNA IL-2 và TNF-α ở 2 dòng tế bào Jurkat và U937 36... các thông số trong phản ứng real- time PCR 3.1.1 Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào Jurkat (tế bào lympho T) có khả năng biểu hiện và tiết cytokine IL-2 (Hsu & cs, 2008), trong khi U937 (dòng tế bào mono) lại có khả năng biểu hiện và tiết cytokine TNF-α (Garrelds & cs, 1999) Do đó, chúng tôi sử dụng cả hai dòng tế bào này để xây dựng quy trình phát hiện khả năng kích thích miễn dịch thông qua sự biểu hiện IL-2... có trình tự đúng với trình tự mRNA IL-2, TNF-α và β-actin 21 A B C Hình 3.2: Kết quả giải trình tự các sản phẩm PCR của 3 cặp mồi IL-2 (A), TNF-α (B) và β-actin (C) 3.1.3 Tối ưu hóa các thông số trong phản ứng real- time PCR phát hiện sự biểu hiện mRNA của các gen mục tiêu Trong phản ứng real- time PCR, Ct (chu kỳ ngưỡng) được định nghĩa là số chu kỳ PCR mà tại đó tín hiệu huỳnh quang vượt qua mức độ phát. .. biểu hiện gene TNF- α ở tế bào U937 khi được cảm ứng LPS Như vậy, từ các kết quả trên (mục 3.2.1 và 3.2.2) cho thấy các phản ứng multiplex real- time PCR do chúng tôi xây dựng có thể phát hiện sự thay đổi biểu hiện mRNA của IL-2 và TNF-α Chúng tôi tiếp tục áp dụng quy trình trên nhằm thử nghiệm khả năng làm tăng sự biểu hiện IL-2 và TNF-α của majonosid-R2 và ginsenosid-Rg1 Chúng tôi chọn hai hợp chất. .. những hợp chất đã được Trung tâm Sâm và dược liệu TP.HCM nghiên cứu, cho thấy có khả năng gây kích thích miễn dịch khi thử nghiệm trên chuột (Nguyễn Thượng Dong & cs, 2007) 32 Ngoài ra, nhiều công trình trên thế giới cũng cho thấy ginsenosid-Rg1 có một số ảnh hưởng nhất định đối với hoạt động miễn dịch (Qu & cs, 2011; Sun & cs, 2008) Tuy nhiên, chưa có công trình nào công bố về ành hưởng của hai chất này... biểu hiện mRNA IL-2, đạt mức tối đa ở thời điểm 12 giờ, duy trì ở mức độ cao trong 48 giờ tiếp theo, sau đó giảm nhanh ở thời điểm 72 giờ (Yamamoto & cs, 2002) 3.2.2 Sự biểu hiện TNF-α trên tế bào U937 được cảm ứng LPS Chúng tôi sử dụng LPS làm chất cảm ứng trên dòng tế bào U937 để thử nghiệm quy trình real- time RT-PCR phát hiện khả năng làm gia tăng biểu hiện mRNA TNF-α Kết quả cho thấy không có một . tài Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real- time RT-PCR có hai nội dung nghiên cứu chính: - Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch. dụng quy trình với một số chất thử nghiệm 2.1 Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch Mục tiêu: thiết lập các thông số cần thiết cho quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch. tài Xây dựng quy trình phát hiện tính kích thích miễn dịch của một số chất bằng real- time RT-PCR sẽ tạo ra một công cụ hữu ích trong việc phát hiện những hợp chất (đặc biệt là những chất