Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN QUANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP NHÂN TẠO ĐỂ LÂY NHIỄM VIRUS GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA Chuyên nghành : Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến Thái nguyên tháng 10 - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn này là do tôi nghiên cứu, dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hải Yến và sự giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn đã đƣợc sự đồng ý của cán bộ hƣớng dẫn và nhóm nghiên cứu, các tài liệu trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Văn Quang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Hải Yến, giảng viên Khoa Khoa học Sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ phòng thí nghiệm Sinh học – Khoa Khoa học Sự sống – Trƣờng Đại học Khoa học, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học đã truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành các thí nghiệm trong luận văn. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Thái nguyên, ngày10 tháng 9 năm 2014 Học viên Nguyễn Văn Quang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC MỤC Trang MỞ ĐẦU…………………………………………………………… 1 1. Đặt vấn đề………………………………………………………… 1 2. Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………… 2 3. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………… 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………… 3 1.1. Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua………… 3 1.1.1. Nguồn gốc và Phân loại……………………………………… 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học…………………………………………… 4 1.1.3. Một số bệnh hại cà chua……………………………………… 5 1.2. Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua……………………… 7 1.2.1. Triệu chứng biểu hiện bệnh…………………………………… 7 1.2.2. Phân loại virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua…………… 8 1.2.3. Đặc điểm hình thái và cấu tạo………………………………… 8 1.2.4. Đặc điểm lây lan và môi giới truyền bệnh…………………… 10 1.2.5. Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua……… 13 1.3. Các phƣơng pháp lây nhiễm TYLCV trong thực nghiệm……… 16 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Vật liệu………………………………………………………… 19 2.1.1. Vật liệu thực vật……………………………………………… 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.1.2. Chủng vi khuẩn ……………………………………………… 20 2.1.3. Hoá chất, thiết bị máy móc…………………………………… 20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………… 21 2.2.1. Phƣơng pháp lây nhiễm bằng bọ phấn ……………………… 21 2.2.2. Phƣơng pháp lây nhiễm bằng ghép áp………………………… 22 2.2.3. Phƣơng pháp lây nhiễm bằng Agro - inoculation …………… 22 2.2.4. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)…… 23 2.2.5. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ biểu hiện bệnh………………… 23 2.2.6. Phƣơng pháp phân tích sự có mặt của virus TYLCV………… 24 2.2.6.1. Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số…………………… 24 2.2.6.2. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose……………………… 25 2.2.6.3. Phƣơng pháp PCR nhân gen của TYLCV ………………… 26 Chƣơng 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………… 27 3.1. Kết quả tạo nguồn bệnh……………………………………… 27 3.1.1. Kết quả lây nhiễm virus trong vƣờn có nguồn bệnh………… 27 3.1.2. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của virus trên cây bệnh…… 28 3.2. Kết quả lây nhiễm TYLCV cho cà chua bằng bọ phấn ………… 30 3.3. Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng phƣơng pháp ghép cây lành với cây bị bệnh…………………………………………………………… 32 3.4. Kết quả lây nhiễm TYLCV bằng Agro - inoculation ………… 35 3.5. Đánh giá hiệu quả lây nhiễm TYLCV của các phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo……………………………………………………… 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………………… 41 1. KẾT LUẬN……………………………………………………… 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi 2. ĐỀ NGHỊ……………………………………………………… 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh Bp Cặp base base pair CTAB CTAB Cetyltrimethylammonium Bromid CP protein vỏ Coat protein DNA Axit Deoxyribonucleic Deoxyribonucleic Acid dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate EDTA EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr EtBr Ethidium Bromide GB GB Gel binding buffe Kb Kb kilobyte ORF trình tự đọc mở Open reading frame PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction Primer F Mồi xuôi Primer Forward Primer R Mồi ngƣợc Primer Reverse Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus IR Vùng liên gen Intergenic region Rep Tái bản Replication SCR vùng vệ tinh Satelite Conserved Region TYLCV Virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua Tomato Yellow Leaf Curl Virus TB Trung bình RAPD nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA Random Amplified Polymorphic DNA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Nồng độ các hoá chất trong dung dịch đệm tách DNA tổng số 24 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen từ mẫu DNA tổng số 26 3.1 27 3.2 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm qua bọ phấn 31 3.3 Kết quả theo dõi mức độ biểu hiện bệnh của các giống cà chua sau lây nhiễm bằng ghép áp 33 3.4 Kết quả giá trị OD ở bƣớc sóng 660 nm của các chủng khuẩn sau nuôi lắc phục vụ thí nghiệm lây nhiễm 35 3.5 Kết quả theo dõi biểu hiện bệnh sau lây nhiễm TYLCV bằng Agro- inoculation vào các giống cà chua 36 3.6 Tổng hợp kết quả theo dõi biểu hiện bệnh trung bình của thí nghiệm lây nhiễm TYLCV vào cây cà chua bằng 3 phƣơng pháp 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Sơ đồ cấu trúc genome của TYLCV 9 1.2 Chu kỳ sinh trƣởng của bọ phấn (Bemisia tabaci) 11 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 21 2.2 Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua 24 3.1 Hình ảnh cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV trồng tại vƣờn có nguồn bệnh sau 50 ngày 27 3.2 Kết quả điện di sản phẩm tách DNA tổng số của một số dòng cà chua nhiễm bệnh 28 3.3 Kết quả PCR kiểm tra gen CP của TYLCV trong các mẫu cà chua nhiễm bệnh 29 3.4 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng bọ phấn. 32 3.5 Kết quả PCR nhân gen CP của TYLCV kiểm tra sự có mặt của virus trong các dòng cây thí nghiệm sau lây nhiễm bằng phƣơng pháp ghép. 34 3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 10 ngày lây nhiễm bằng Agro- inoculation 37 3.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra TYLCV sau 50 ngày lây nhiễm bằng Agro- inoculation 37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ x TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Tên đề tài: “Nghiên cứu một số phƣơng pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua”. 2. Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hải Yến 3. Ngƣời thực hiện: Nguyễn Văn Quang 4. Mục tiêu nghiên cứu Tìm đƣợc phƣơng pháp lây nhiễm virus TYLCV phù hợp để lây bệnh cho cà chua nhằm tạo phƣơng pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho cà chua trong điều kiện nhà lƣới và vƣờn thí nghiệm. 5. Nội dung nghiên cứu 1. Thu thập các giống cà chua mẫn cảm với virus, kháng tự nhiên với virus. . 3. Tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho cà chua 4. Theo dõi và phân tích kết quả, đánh giá mức độ biểu hiện bệnh sau khi lây nhiễm. 5. Đƣa ra quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua. 6. Kết quả nghiên cứu (1) Thu thập giống cà chua phục vụ thí nghiệm: + Giống PT 18 do viện rau quả Việt Nam cung cấp. Cà chua PT18 có chiều cao trung bình 80 – 100 cm, dạng cây gọn, màu lá xanh nhạt, phân cành ít, sinh trƣởng hữu hạn. PT18 là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV. + Giống F 1 GM - 2008, là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp. Quả của F1 GM - 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tƣơi, thịt dày, rắn chắc. F1 GM - 2008 sinh trƣởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, giống F 1 GM2008 đƣợc lai tạo theo hƣớng kháng bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV. [...]... đề xuất một số phƣơng pháp để lây nhiễm TYLCV cho cà chua, tuy nhiên vẫn chƣa có công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống Xuất phát từ thực tiễn và cơ sở lý luận trên chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài là Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua Nhằm phục vụ trong nghiên cứu, đánh giá khả năng kháng virus TYLCV ở cà chua 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác... Geminivirus gây hại cà chua ở những vùng nhiệt đới Virus thƣờng gây ra triệu trứng xoăn lá, nhất là ngọn xoăn rất mạnh Lá có dạng xoắn vào trong, cây lùn thấp, mặt lá thƣờng bị khảm đốm vàng Những cây bị bệnh, sinh trƣởng phát triển kém, thƣờng không cho quả Bệnh xoăn lá do virus có thể gây nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh cà chua khác nhƣ: nụ hoa cà chua lớn, cà chua vàng trên đầu, bệnh xoăn lá sinh... phƣơng pháp lây nhiễm virus TYLCV cho cà chua trồng trong điều kiện nhà lƣới và vƣờn thí nghiệm, nhằm tạo phƣơng pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho cà chua 3 Nội dung nghiên cứu 1 Thu thập các giống cà chua mẫn cảm với virus, kháng tự nhiên với virus 3 Tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho cà chua 4 Theo dõi và phân tích kết quả, đánh giá mức độ biểu hiện bệnh sau khi lây nhiễm. .. loại sâu bệnh nhƣ nấm, côn trùng, vi khuẩn và đặc biệt là virus Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV gây nên đƣợc xem là bệnh gây hậu quả nghiêm trọng nhất [17], [21] Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thƣờng rất cao, có khi tới 100% TYLCV là loài virus thuộc chi Begomovirus, họ... thuốc sâu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu THU THẬP GIỐNG TẠO NGUỒN BỆNH Phương pháp nuôi thả bọ phấn Phương pháp ghép LÂY NHIỄM VIRUS Phương pháp Agroinoculation Theo dõi biểu hiện KIỂM TRA VÀ ĐÁNH GIÁ PCR nhân gen virus ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH LÂY NHIỄM Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp lây nhiễm bằng bọ phấn Gieo hạt và cách li cây sau nảy mầm, sau đó tiến hành lây nhiễm bọ phấn, tiến hành... Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ năng kháng virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua để đƣa vào sản xuất Tuy nhiên, để đánh giá các dòng cây tạo ra có kháng đƣợc với virus hay không thì công việc lây nhiễm virus để kiểm tra khả năng kháng là rất quan trọng Virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua không truyền qua hạt giống, qua hạt, đất, qua va chạm cơ học nhƣng lan truyền... phƣơng pháp này tốn kém, gây ô nhiễm môi trƣờng và nông phẩm khi sử dụng chất hóa học độc hại tiêu diệt côn trùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.2.5 Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua Bệnh xoăn vàng lá cà chua đã đƣợc biết đến nhiều năm, tuy nhiên vẫn chƣa có phƣơng pháp phòng tránh hiệu quả và những thiệt hại do virus này gây ra... phấn truyền virus [9] 1.2.2 Phân loại virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua Theo hệ thống phân loại virus quốc tế (ICTV) năm 2013, TYLCV thuộc chi Begomovirus, họ Geminiviridae Họ này có 7 chi bao gồm Begomovirus (288 loài), Curtovirus (3 loài), Eragrovirus (1 loài), Mastrevirus (29 loài), Topocuvirus (1 loài), Turncurtovirus (1 loài) và Becurtovirus (2 loài) Geminiviridae là họ virus gây bệnh thực... khi lây nhiễm 5 Đƣa ra 01 quy trình lây nhiễm virus TYLCV cho cà chua Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây cà chua và một số bệnh hại cà chua 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại Cà chua (Lycopersicon esculentum L.) có bộ nhiễm sắc thể 2n = 24 và đa số chúng là cây tự thụ phấn Cà chua có nguồn gốc từ Nam mỹ (Bolivia,... quả Vì vậy gây tổn thất nghiêm trọng đến năng suất, có khi không cho thu hoạch Đặc biệt từ sau khi trồng đến thời kỳ ra hoa, cây bị hại sẽ làm giảm khối lƣợng quả rất lớn Ở Việt Nam, bệnh xoăn lá cà chua phát triển mạnh trong vụ cà chua sớm và vụ xuân hè khi nhiệt độ không khí từ 25 - 30oC, độ ẩm trên 70% 1.2 Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua 1.2.1 Triệu chứng biểu hiện bệnh Bệnh do virus thuộc . nghiên cứu đề tài là Nghiên cứu một số phương pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua . Nhằm phục vụ trong nghiên cứu, đánh giá khả năng kháng virus TYLCV ở cà chua. . http://www.lrc-tnu.edu.vn/ x TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Tên đề tài: Nghiên cứu một số phƣơng pháp nhân tạo để lây nhiễm virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua . 2. Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Thị. Một số bệnh hại cà chua …………………………………… 5 1.2. Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua …………………… 7 1.2.1. Triệu chứng biểu hiện bệnh ………………………………… 7 1.2.2. Phân loại virus gây bệnh xoăn vàng