1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne Muscular Dystrophy-DMD) là một bệnh lý cơ do di truyền thường gặp nhất, được phát hiện ở tất cả các chủng tộc khác nhau trên thế giới. Tần suất bệnh vào khoảng 1/3500 trẻ trai. Hầu hết trẻ trai mắc bệnh đều có dấu hiệu lâm sàng với triệu chứng yếu cơ, biểu hiện bằng khó đi lại, khó đứng lên ngồi xuống và khó khăn khi leo cầu thang. Trong giai đoạn nặng, bệnh nhân trở nên tàn phế, mất khả năng đi lại vào lứa tuổi 12 và thường tử vong ngoài 20 tuổi do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [146]. DMD là bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể (NST) X ở locus Xp21, có chiều dài khoảng 2400 kb gồm 79 exon với 7 promotor khác nhau. Đây là gen lớn nhất của người được phát hiện cho đến nay. Gen này sao mã ra mRNA 14kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin. Protein này có mặt ở màng bào tương của tế bào cơ và có chức năng chính trong việc duy trì sự ổn định màng, bảo vệ tế bào cơ khỏi bị tổn thương trong quá trình co cơ. Khi gen bị đột biến, quá trình tổng hợp protein bị ảnh hưởng, hậu quả là tế bào cơ của bệnh nhân bị thoái hóa dần và gây nên bệnh DMD [96], [109]. Hiện nay, bản đồ đột biến gen dystrophin gần như đã được xác định. Dạng đột biến mất đoạn gen là phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 60%. Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20-30%. Đột biến lặp đoạn, khoảng 10-15% [106]. Nhiều công trình nghiờn cứu cho thấy đột biến mất đoạn gen thường tập trung vào hai vùng trọng điểm (hotspot) là vùng trung tâm ở giữa gen (exon 43-60) và vùng tận cùng 5’ (exon 1-19) [91], [107]. Vì vậy, để tiết kiệm về kinh phí và thời gian trong việc phát hiện đột biến mất đoạn gen, các tác giả thường sử dụng 19-25 cặp mồi tập trung đặc hiệu cho 19-25 exon trong vùng hay xảy ra mất đoạn [7], [20], [69]. 2 Những năm gần đây, nhờ vào sự phát triển của ngành sinh học phân tử, nhiều nhà khoa học nước ngoài cũng như trong nước đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện được đột biến gen dystrophin ở các bệnh nhân DMD. Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu thường tập trung vào xác định dạng đột biến mất đoạn gen ở mức độ DNA và thường chỉ ưu tiên xác định đột biến trong 2 vùng trọng điểm [1], [7], [10]. Trong khi đó đột biến gen dystrophin có thể rải rác khắp 79 exon. Do vậy, các nghiên cứu trên thường bỏ sót đột biến ở những exon khác và cả đột biến xảy ra trong quá trình hoàn thiện các tiền mRNA. Một điều cần lưu ý là để xác định đột biến xảy ra ở gen dystrophin bằng phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ở mức độ DNA, chúng ta phải khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, có nghĩa phải khuếch đại toàn bộ 79 exon để xác định đột biến. Trên phân tử DNA, các exon lại nằm xen kẽ với các intron có kích thước quá lớn nên để khuếch đại 79 exon ở mức độ DNA người ta phải thiết kế 79 cặp mồi bắt cặp đặc hiệu ở hai đầu mỗi exon. Điều này gây tốn kém cả về tài chính lẫn thời gian. Ngược lại, ở cấu trúc của mRNA, các đoạn intron đã bị cắt bỏ và 79 exon nằm liên tục nhau. Do vậy, để khuếch đại toàn bộ chiều dài đoạn mRNA chứa 79 exon này, người ta chỉ cần dùng 15 cặp mồi đặc hiệu đã có thể khuếch đại được cả chiều dài đoạn gen dystrophin [9], [77], [129]. Như vậy, việc xác định đột biến ở mức độ RNA giúp tiết kiệm rất nhiều công sức, thời gian cũng như hóa chất. Với những biểu hiện lâm sàng nặng nề cùng rối loạn về tinh thần và tử vong sớm do chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne thực sự là một tai họa đối với bản thân người bệnh và là gánh nặng của gia đình cũng như của cộng đồng. Theo nhiều nghiờn cứu, 2/3 bệnh nhân DMD nhận gen di truyền từ người mẹ dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân bị đột biến mới phát sinh [66]. Do vậy, việc chẩn đoán người mẹ dị hợp tử, chẩn đoán 3 trước sinh phát hiện các thai nhi bất thường và phòng bệnh bằng phương pháp phá thai chủ động là sự lựa chọn được nhiều người đồng thuận, từ đó có thể giảm tỉ lệ mắc bệnh DMD trong cộng đồng [93], [107]. Ở Việt Nam, năm 1996, Nguyễn Thị Trang và CS nghiên cứu về lâm sàng, phân tích phả hệ, đo hoạt độ của creatine kinase (CK) trong chẩn đoán người mang gen bệnh và phát hiện được khoảng 50% trường hợp nghiên cứu có khả năng là người mang gen bệnh [20]. Trong một nghiên cứu khác, năm 2006, Nguyễn Văn Quyệt cho rằng, phối hợp giữa phân tích phả hệ và định lượng hoạt độ CK có thể phát hiện được 50% bà mẹ dị hợp tử [16]. Tuy nhiên, những kết quả trên chỉ mang tính chất gợi ý, không có cơ sở về tổn thương di truyền và chưa đủ sức thuyết phục để thực hiện tư vấn di truyền. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài “Xác định đột biến mất đoạn gen dystrophin gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh” được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xác định đột biến mất đoạn gen trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA. 2. Chẩn đoán người lành mang gen bệnh (mẹ, chị em gái và dì) trong gia đình bệnh nhân đã được xác định đột biến mất đoạn gen ở trên. 3. Bước đầu thực hiện chẩn đoán trước sinh cho những bà mẹ dị hợp tử. 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh DMD - Tháng 12-1851, Meryon, một thầy thuốc người Anh đã mô tả chi tiết về 8 trẻ trong 3 gia đình mắc cùng một bệnh mà về sau này được gọi là bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Ông cho rằng nguyên nhân của bệnh là do giảm các yếu tố dinh dưỡng [49]. - Năm 1861, Duchenne, một nhà thần kinh học người Pháp đã có công mô tả dạng giả phì đại của bệnh loạn dưỡng cơ thường gặp ở trẻ trai. Năm 1868, Duchenne thực hiện một nghiên cứu quy mô về bệnh lý này, ông đưa ra những tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh dựa trên kết quả giải phẫu bệnh và kích thích điện. Duchenne nhận thấy có sự thay thế mô cơ bằng những mô xơ hoặc mô liên kết trên tiêu bản sinh thiết cơ. Sau đó ụng đó sử dụng thủy trị liệu kết hợp với xoa bóp để điều trị cho bệnh nhân và nhận thấy có sự cải thiện bệnh ở một số bệnh nhân. Chính nhờ sự phát hiện quan trọng này mà sau đó bệnh được mang tờn ụng [34]. - Năm 1879, Gowers đã thu thập bệnh án 220 bệnh nhân và mô tả một cách kỹ lưỡng bệnh này với những hình ảnh lâm sàng điển hình và rất chi tiết. Ông cũng phát hiện một phụ nữ có những đứa con trai khác cha cùng bị bệnh. Gowers nhận thấy rằng các trẻ mắc bệnh có một đặc điểm giống nhau khi thay đổi tư thế từ nằm sang đứng. Từ đó, dấu hiệu này được xem là dấu hiệu điển hình của bệnh DMD và được mang tên ông: dấu hiệu Gowers [62]. - Nếu tớnh từ thời Meryon thì bệnh DMD đã được biết hơn 150 năm. Tuy nhiên, trong suốt một thời gian dài, bệnh chủ yếu chỉ được đánh giá ở mức độ lâm sàng và điều trị chỉ tập trung vào chăm sóc hỗ trợ trong quá trình của bệnh [140]. 5 - Trong những năm 1980, các nghiên cứu tập trung vào chẩn đoán và đặc biệt là chẩn đoán sớm bệnh DMD khi chưa có biểu hiện lâm sàng, phát hiện dị hợp tử bệnh DMD bằng đo hoạt độ enzym CK, phục vụ cho điều trị và tư vấn di truyền [58], [102]. - Năm 1981, Zatz và CS đã phát hiện ra gen dystrophin nằm ở vị trí Xp21.1 nhờ quan sát những trẻ gái mắc bệnh DMD. Những bệnh nhân nữ này mang chuyển đoạn giữa NST X và NST thường [140]. - Năm 1984-1987, Hoffman và CS đã phát hiện ra gen dystrophin và sản phẩm protein tương ứng của gen này [38], [65]. - Những năm sau 1987, ở một số nước tiên tiến, các phương pháp di truyền phân tử phát triển mạnh giúp việc phát hiện đột biến gen dystrophin, tiến tới chẩn đoán trước sinh và phát hiện người nữ lành mang gen bệnh để tư vấn di truyền nhằm hạn chế sinh ra những đứa trẻ bị bệnh DMD [29], [38]. - Năm 1987-1988, các nhà nghiên cứu cho biết gen dystrophin gồm 60 exon. - Năm 1989, gen dystrophin được phát hiện với kích thước 2300 kb [47]. - Năm 1993, thành phần và cấu trúc gen dystrophin đã được phát hiện đầy đủ gồm 79 exon với kích thước 2400 kb [106], [112]. - Từ năm 1993 trở lại đây, cơ chế sinh học phân tử của bệnh ngày càng được làm sáng tỏ, liệu pháp điều trị gen đã và đang được các nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra những giải pháp tốt nhất khắc phục hậu quả nặng nề do bệnh gây ra [92], [109]. 1.2. Đặc điểm của bệnh DMD 1.2.1. Biểu hiện lâm sàng của DMD Bệnh DMD được biểu hiện qua 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1 (3-5 tuổi): trẻ có dấu hiệu chậm biết đi hoặc đi lại hay vấp ngã nhưng chưa có biểu hiện teo cơ. 6 - Giai đoạn 2 (6-7 tuổi): trẻ có biểu hiện yếu cơ và xuất hiện dấu hiệu Gowers rõ. Khi trẻ đang ngồi xổm muốn đứng thẳng lên hoặc đang nằm muốn ngồi dậy, trẻ phải quay người sang một bên, gấp đầu gối lại, hai tay chống nạng đỡ lấy thân để giữ ở tư thế như quỳ bắn; sau đó bằng cách tỳ hai tay lần lượt lên cẳng chân, đầu gối và đùi, trẻ đẩy cho thân thẳng dậy. Sự tiếp nối các động tác như vậy được xem là đặc hiệu của bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến. - Giai đoạn 3 (12-15 tuổi): trẻ thường mất khả năng đi lại lúc 12 tuổi. Sau đó dấu hiệu teo cơ xuất hiện do trẻ không đi lại được. Cuối cùng trẻ thường tử vong ở tuổi 20-25 do tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp [62], [96]. 1.2.2. Xét nghiệm cận lâm sàng 1.2.2.1. Định lượng hoạt độ CK toàn phần CK được Lohman phát hiện vào năm 1934. CK là enzym xúc tác sự tạo năng lượng giúp cho quá trình co, duỗi cơ và quá trình chuyển hóa chất trong tế bào cơ. Năm 1959, Ebashi và CS là những người đầu tiên áp dụng việc định lượng hoạt độ CK huyết thanh trong chẩn đoán bệnh lý tổn thương cơ. Các tác giả nhận thấy hoạt độ CK tăng cao gấp hàng chục lần ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ tiến triển. Manhoney (1977), Edward (1984) phát hiện CK tăng trong máu của các thai nhi bị bệnh DMD [48], [104]. Ở bệnh nhân DMD, hoạt độ CK huyết thanh thường tăng rất cao trước khi có dấu hiệu lâm sàng, thậm chí tăng từ thời kỳ sơ sinh. Hoạt độ CK huyết thanh ở bệnh nhân DMD khoảng từ 10000 đến 35000 UI/L (bình thường dưới 160 UI/L). Theo Matsuo (2002), hoạt độ CK huyết thanh bình thường có thể loại trừ chẩn đoán DMD. Tuy nhiên, trong giai đoạn muộn của quá trình bệnh, hoạt độ enzym này giảm thấp. Lý do của hiện tượng trên là vào giai đoạn cuối, khối cơ còn lại quỏ ớt, mặt khác bệnh nhân giảm vận động nên lượng cơ thoái hóa cũng ít đi [4], [91], [102]. 7 1.2.2.2. Phương pháp thăm dò điện sinh lý cơ Ghi điện cơ là phương pháp nghiên cứu hoạt động điện của cơ bằng cách ghi lại điện thế hoạt động của các sợi cơ ở những trạng thái khác nhau. Nhờ nghiên cứu của Kugelberg (1947), Buchtbal (1953), phương pháp ghi điện cơ được ứng dụng để chẩn đoán sớm các bệnh loạn dưỡng cơ tiến triển trước khi có biểu hiện lâm sàng. Năm 1979, Stalberg và Trontelj mô tả chi tiết hình ảnh tổn thương trên điện cơ đồ ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ [103]. Trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne, điện cơ đồ cho thấy những biến đổi đặc trưng của bệnh lý cơ nhưng không đặc hiệu cho DMD, khụng có bằng chứng của hiện tượng suy giảm phân bố thần kinh trong cơ, tốc độ dẫn truyền thần kinh cảm giác và vận động bình thường [34]. 1.2.2.3. Sinh thiết cơ Vào thế kỷ 19, Meryon (1852) và Duchenne (1868) đã áp dụng phương pháp sinh thiết cơ để chẩn đoán bệnh DMD [34]. Trong nhiều năm sau đó, phương pháp này được xem là công cụ đắc lực để chẩn đoán xác định bệnh DMD và chẩn đoán phân biệt với các bệnh lý khác. Sinh thiết cơ có tác dụng chẩn đoán xác định dựa vào những thay đổi đặc trưng trờn mụ sinh thiết. Biến đổi mô bệnh học đặc trưng bao gồm tăng sinh tổ chức liên kết của mô bọc sợi cơ, các sợi cơ bị thoái hóa và tái sinh rải rác. Mô bệnh học cũng cho thấy các ổ thâm nhiễm tế bào viêm đơn nhân, đõy là hậu quả của phản ứng viêm được khởi động bởi quá trình hoại tử sợi cơ; song song các sợi cơ có chức năng bình thường cũng biểu hiện những thay đổi nhẹ về mặt cấu trúc. Ngoài ra, mô sinh thiết còn có rất nhiều sợi đậm đặc; các sợi cơ co rút thái quá này có thể là hậu quả của sự hoại tử ở một vị trí khỏc trờn chiều dài của sợi cơ, quỏ trình hoại tử này tạo điều kiện cho canxi đi vào nội bào qua chỗ tổn thương của màng sợi cơ vân, luồng canxi đi vào sẽ khởi động quá trình co rút của toàn bộ chiều dài sợi cơ [34]. Vị trí sinh thiết 8 thường sử dụng nhất trong lâm sàng ở cơ rộng ngoài của cơ tứ đầu đùi hoặc cơ sinh đôi ngoài [62]. 1.2.2.4. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (MDHQ) Protein dystrophin định vị ở màng sợi cơ. Bởi vậy với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản sinh thiết, đường viền các sợi cơ bình thường xuất hiện sự phát sáng huỳnh quang liên tục, không ngắt quãng; trong khi đó ở tiêu bản sinh thiết cơ của những bệnh nhân DMD không có sự bắt màu, không thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ, phản ánh sự vắng mặt của protein dystrophin trên màng tế bào cơ của bệnh nhân DMD [62], [89]. Một thể bệnh nhẹ của DMD rất hay gặp là loạn dưỡng cơ Becker (BMD). Triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân BMD xuất hiện muộn hơn so với ở bệnh nhân DMD, mức độ biểu hiện nhẹ hơn và thời gian tiến triển chậm hơn. Trên tiêu bản sinh thiết cơ, protein dystrophin giảm đáng kể trên màng tế bào sợi cơ song không vắng mặt hoàn toàn như trong thể nặng DMD [28]. Người bình thường Bệnh nhân BMD Bệnh nhân DMD Hình 1.1. Hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của protein dystrophin (Nguồn: Matsuo, 2002) 1.2.2.5. Phương pháp di truyền phân tử xác định gen đột biến Sự thành công của Kunkel và CS (1985) trong việc phát hiện sự mất đoạn lớn của NST X ở 1 bệnh nhân nam DMD đã khởi đầu cho một loạt những nghiên cứu xác định gen ở bệnh nhân DMD. Hiện nay, có rất nhiều kỹ thuật sinh học phân tử giúp xác định đột biến gen dystrophin như kỹ thuật PCR, Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR), Fluorescence in situ Hybridization 9 (FISH), Southern blot, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) [90], [91], [107]. Các kỹ thuật này sẽ được trình bày ở phần 1.4. 1.2.3. Tần số của bệnh DMD là một bệnh di truyền phổ biến, có tần suất cao trong nhóm bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến với tỉ lệ 1/3500 trẻ trai [34]. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu rõ ràng về tần suất mắc bệnh DMD. Theo Nguyễn Thu Nhạn và CS những năm 1981-1990 có 131 bệnh nhân vào điều trị tại Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền, Bệnh Viện Nhi Trung Ương, chiếm 0,6% trong tổng số bệnh nhân vào điều trị [13]. Theo Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng giai đoạn 1991-1996 có 88 bệnh nhân DMD vào điều trị tại viện Bệnh Viện Nhi Trung Ương, chiếm 19,4% trong các bệnh di truyền của Khoa Nội tiết-Chuyển hóa-Di truyền và chiếm khoảng 0,11% trong tổng số bệnh nhân vào điều trị tại bệnh viện [14]. 1.2.4. Di truyền học bệnh DMD DMD là bệnh di truyền đơn gen, tuân theo quy luật di truyền lặn liên kết NST X không có alen tương ứng trên NST Y. Bệnh thường gặp ở trẻ trai mà rất hiếm gặp ở trẻ gái. Trẻ trai chỉ cần nhận một gen bệnh trên NST X của người mẹ mang gen (X D X d ) là có biểu hiện bệnh, trong khi đó trẻ gỏi đòi hỏi phải nhận 2 gen X mang bệnh, một gen bệnh từ mẹ và một gen bệnh từ bố mới có khả năng biểu hiện bệnh. Tuy nhiên, trẻ trai bị bệnh DMD thường chết sớm ở tuổi từ 20 đến 25 nên không có khả năng lập gia đình. Do vậy, trong sáu trường hợp ở bảng 1.1, khả năng thứ hai là hay gặp nhất, người mẹ mang gen bệnh có khả năng truyền bệnh cho 50% số con trai và truyền gen bệnh cho 50% số con gái của họ [96]. Trong một vài trường hợp, người nữ mang gen có biểu hiện bệnh khi NST X không mang gen bệnh bị bất hoạt và dẫn đến NST X còn lại mang gen bệnh sẽ biểu hiện bệnh [54], [56]. 10 Bảng 1.1. Kiểu gen bố mẹ và tỷ lệ bị bệnh ở thế hệ con Genotyp và phenotyp của cha mẹ Tần số con với các genotyp khác nhau Trai Gái Cha Mẹ X D Y lành X d Y bệnh X D X D lành X D X d lành mang gen bệnh X d X d bệnh X D Y lành X D X D lành 1 0 1 0 0 X D Y lành X D X d lành mang gen bệnh 1/2 1/2 1/2 1/2 0 X D Y lành X d X d bệnh 0 1 0 1 0 X d Y bệnh X D X D lành 1 0 0 1 0 X d Y bệnh X D X d lành mang gen bệnh 1/2 1/2 0 1/2 1/2 X d Y bệnh X d X d bệnh 0 1 0 0 1 Theo nghiên cứu của White (2002), Hung (2006), khoảng 30% bệnh nhân DMD có nguyên nhân không phải di truyền từ bố mẹ mà do quá trình đột biến mới phát sinh trong giai đoạn tạo giao tử ở bố hoặc mẹ. Khoảng 70% bệnh nhân DMD là do nhận gen bệnh từ người mẹ [66], [137]. Phụ nữ mang gen bệnh thường không có triệu chứng yếu cơ hoặc bất kỳ một dấu hiệu lâm sàng nào của bệnh. Norman (1989) cho rằng khoảng 2/3 người lành mang gen bệnh có hoạt độ CK huyết thanh tăng [99]. 1.2.5. Điều trị bệnh DMD Điều trị bệnh DMD vẫn còn là vấn đề khó khăn đối với nền y học. Hiện tại, chưa có những biện pháp điều trị đặc hiệu cũng như ngăn cản sự tiến triển của bệnh. Tuy nhiên, chúng ta vẫn có thể điều trị các triệu chứng, các biến chứng của bệnh và nâng cao chất lượng sống cho đứa trẻ. [...]... 2004) 1.3.4 Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin 1.3.4.1 Đột biến mất đoạn gen dystrophin Đột biến mất đoạn gen là dạng thường gặp nhất ở bệnh nhân DMD, chiếm khoảng 60-65% các dạng đột biến gây bệnh DMD Những đột biến mất đoạn làm lệch khung dịch mã của mRNA, tạo ra protein dystrophin không có chức năng và gây nên bệnh cảnh lâm sàng nặng DMD Những mất đoạn gen khụng gây lệch khung dịch mã... đại và mỗi đoạn có kích thước khoảng 1000-1400 bp Sau khi khuếch đại, các đoạn DNA được điện di trên agarose để xác định đột biến mất đoạn gen Mặt khác, 10 đoạn gen này có thể được tạo dòng và giải trình tự để phát hiện các dạng đột biến khó xác định của gen dystrophin như đột biến điểm, đột biến lặp đoạn Các tác giả Tay và Lai đã sử dụng phương pháp này để xác định dạng đột biến mất đoạn trên bệnh. .. trở ngại lớn trong việc xác định đột biến Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gen dystrophin đã được xác định [106], [112] 1.4.3.3 Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn Đột biến lặp đoạn, thêm đoạn là nguyên nhân gây nên DMD trong hầu hết các trường hợp còn lại Prior (2005) cho rằng 80% đột biến lặp đoạn xảy ra ở đầu tận 5’ và 20% ở vùng trung tâm [107] Ngoài ra, một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân DMD có đột biến. .. có thể xác định được bằng các phương pháp khác như nhuộm ethedium bromide [12], [126] 1.4.2.2 Ứng dụng trong chẩn đoán DMD Ngoài việc phát hiện được đột biến xóa đoạn, Southern blot còn cho phép xác định các đột biến lặp đoạn gen dystrophin Ở bệnh nhân đột biến mất đoạn, băng lai của các exon bị đột biến và đoạn dò đặc hiệu không xuất hiện trên phim Đối với các bệnh nhân đột biến lặp đoạn, có hiện tượng... protein dystrophin bị cắt ngắn ở giữa nhưng còn một phần chức năng và gây bệnh cảnh lâm sàng nhẹ hơn là BMD Tuy nhiên, khả năng gây lệch khung dịch mã được xác định trên 90% các trường hợp có đột biến mất đoạn [90], [106] Đột biến mất đoạn của gen dystrophin chiếm tỷ lệ 2/3 các trường hợp DMD/BMD và tập trung chủ yếu ở hai vùng “hotspot” - vùng trung tâm và đầu 5’ của gen dystrophin [106] Các đột biến mất. .. biến mất đoạn gen được phát hiện bằng phân tích Southern blot và hầu hết (90-95%) được phát hiện bởi phương pháp PCR với việc sử dụng các cặp mồi tập trung vào hai vùng “hotspot” [63], [75] 17 1.3.4.2 Đột biến điểm Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 25-30% Hầu hết đột biến điểm trong bệnh DMD tạo ra mã kết thúc sớm và gây thể bệnh nặng Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo... tương ứng với các exon 45-50 ở mẹ bệnh nhân chỉ bằng ½ so với chứng nữ, chứng tỏ mẹ bệnh nhân ở dạng dị hợp tử, mang 1 NST X chứa gen dystrophin đột biến mất đoạn từ exon 45-50 Hình 1.11 Kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến lặp đoạn (A) và đột biến mất đoạn gen dystrophin (B) (Nguồn: Marzese, 2008) 28 1.4.5 Kỹ thuật giải trình tự gen bằng máy tự động Máy giải trình tự gen tự động được thiết kế trên nguyên... cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích Dựa vào màu huỳnh quang, máy sẽ nhận diện được các nucleotid, từ đó biết được trình tự của DNA đích [73] Phương pháp này giúp xác định các đột biến khó phát hiện của gen dystrophin như đột biến điểm, đột biến nhỏ, đột biến lặp đoạn, Hình 1.12 Hình ảnh giải trình tự gen dystrophin. .. sức và hóa chất Trước đây và cho đến hiện nay, phương pháp multiplex PCR vẫn là phương pháp được ưu tiên sử dụng để phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin như trong nghiên cứu của Coutelle (1989), Lee (1993), Prior (2005), Basak (2006), Sura (2008), Năm 2006, Trần Võn Khỏnh đó sử dụng phương pháp này để phát hiện đột biến trên 85 bệnh nhân DMD Kết quả cho thấy tỷ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin. .. blot xác định đột biến gen dystrophin (Nguồn: Prior, 2005) Người mẹ (I-1) sinh một người con trai bị DMD (II-3) với đột biến mất đoạn exon 50 và 2 người con gái (II-1 và II-2) Phản ứng Southern blot được tiến hành với 2 exon, 1 exon bệnh nhân không bị đột biến nhằm làm đối chứng nội là exon 19 và 1 exon mà bệnh nhân bị mất đoạn (exon 50) Để tránh sai số, Prior phân tích kết quả dựa vào tỷ lệ đậm độ băng . dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA và phát hiện người lành mang gen bệnh được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xác định đột biến mất đoạn gen trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne ở mức độ mRNA. . Hình 1.5. Cơ chế bệnh sinh của DMD (Nguồn: Rando, 2004) 1.3.4. Các dạng đột biến cấu trúc của gen dystrophin 1.3.4.1. Đột biến mất đoạn gen dystrophin Đột biến mất đoạn gen là dạng thường. sớm và gây thể bệnh nặng. Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài gen tạo ra trở ngại lớn trong việc xác định đột biến. Hiện nay có khoảng trên 200 đột biến điểm của gen dystrophin đã được xác