BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  CÙ THU HÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ðẶC ðIỂM ENZYME PHYTASE TỪ BACILLUS SUBTILIS BC 2 CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI – 2013 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong báo cáo này là trung th ực và chưa hề ñược sử dụng trong bất kỳ một báo cáo khoa học nào. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện báo cáo này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong báo cáo này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2013 H ọc viên thực hiện Cù Thu Hà Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Sau m ột thời gian thực tập ñể hoàn thành luận văn nghiệp tại Bộ môn Sinh h ọc phân tử và Công nghệ vi sinh - trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, ngoài sự c ố gắng nỗ lực của bản thân, em ñã nhận ñược sự ñộng viên và giúp ñỡ của nhiều cá nhân và t ập thể. L ời ñầu tiên em xin ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới TS. Nguy ễn Văn Giang - Trưởng Bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ vi sinh thuộc khoa Công ngh ệ sinh học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình hướng d ẫn và ñịnh hướng cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Em xin chân thành c ảm ơn các thầy cô giáo trong phòng, ban của khoa Công ngh ệ sinh học trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã truyền ñạt cho em những ki ến thức vô cùng quan trọng và quý báu trong suốt thời gian học tập và thực hiện lu ận văn. Và cu ối cùng, em xin gửi lời tri ân tới gia ñình và bạn bè, những người ñã giúp ñỡ, ñộng viên và tạo ñiều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện ñề tài này. TÔI XIN CHÂN THÀNH C ẢM ƠN! Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2013 H ọc viên thực hiện Cù Thu Hà Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục chữ viết tắt viii Danh mục hình ix ðẶT VẤN ðỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu về acid phytic và phytate 4 1.1.1 ðịnh nghĩa 4 1.1.2 Cấu trúc hóa học của acid phytic 4 1.1.3 Sự tồn tại của acid phytic và phytate trong tự nhiên 5 1.1.4 Chức năng sinh lý của acid phytic 6 1.1.5 Ảnh hưởng của acid phytic 6 1.2 Phytase 7 1.2.1 ðịnh nghĩa 7 1.2.2 Các nguồn thu nhận enzyme phytase 8 1.2.3 Phân loại 10 1.2.4 Các ñặc tính lý, hóa của phytase 13 1.2.6 Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy phân axit phytic của phytase 18 1.2.7 ðộng học của phystase 19 1.2.8 Ứng dụng của enzyme phytase 19 1.3 Bacillus và phytase của Bacillus 21 1.3.1 Vài nét về Bacillus 21 1.3.2 Phân loại phytase của Bacillus 22 1.3.3 Cơ chất ñặc hiệu 23 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 1.3.4 Các ñặc tính lý hóa học của phytase từ Bacillus 23 1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 26 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 26 1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 27 Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 ðối tượng 29 2.1.2 Các môi trường ñược sử dụng trong ñề tài nghiên cứu 29 2.1.3 Hóa chất sử dụng cho ñề tài nghiên cứu 30 2.1.4 Máy móc thiết bị 30 2.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 31 2.4 Phương pháp nghiên cứu 31 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu. 31 2.4.2 Phân lập Bacillus spp. có khả năng tổng hợp phytase ngoại bào 31 2.4.3 Phương pháp giữ giống 32 2.4.4 Phương pháp nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh học của các chủng vi sinh v ật ñược chọn. 33 2.4.5 Phương pháp ñánh giá hoạt tính phân giải Na-phytate của các chủng Bacillus spp. phân l ập ñược (Phương pháp Fiske và Subbarow) 34 2.4.6 Phương pháp xác ñịnh ảnh hưởng của các ñiều kiện ñến khả năng sinh t ổng hợp phytase của chủng Bacillus ñã ñược tuyển chọn 37 2.4.7 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa ñến hoạt ñộ phytase. 38 2.4.8 Phương pháp xác ñịnh ảnh hưởng của các ñiều kiện ngoại cảnh ñến kh ả năng phân giải phytate của phytase 39 2.4.9 Phương pháp xác ñịnh nguồn gốc di truyền của vi sinh vật 40 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phytate 41 3.2 ðặc ñiểm hình thái của các chủng vi sinh vật ñược tuyển chọn 42 3.3 Xây dựng ñường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và n ồng ñộ mg/l của dung dịch H 3 PO 4 47 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 3.4 ðánh giá khả năng phân giải phytate bởi phytase của các chủng vi sinh v ật tuyển chọn 48 3.5 Phân tích di truyền của chủng BC 2 49 3.6 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng BC 2 theo thời gian nuôi c ấy 51 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường và một số ñiều kiện nuôi cấy ñến quá trình sinh t ổng hợp phytase của chủng BC 2 51 3.7.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến quá trình sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 51 3.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến quá trình sinh tr ưởng tổng hợp phytase của chủng BC 2 53 3.8 Khảo sát khả năng sử dụng nguồn C, N khác nhau của chủng BC 2 54 3.8.1 Khảo sát khả năng sử dụng C từ các nguồn khác nhau 54 3.8.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ tinh bột ñến quá trình sinh tổng hợp phytase c ủa BC 2 55 3.8.3 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn N khác nhau ñến khả năng sinh t ổng hợp phytase của chủng BC 2 56 3.8.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ NH 4 NO 3 ñối với quá trình sinh tổng h ợp phytase của BC 2 57 3.8.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ Ca2+ ñến khả năng sinh tổng hợp phytase c ủa BC 2 58 3.9 Khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa ñến hoạt ñộ chung của phytase t ừ chủng BC 2 59 3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH lên hoạt ñộ phytase của chủng BC 2 60 3.10.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt ñộ phytase từ chủng BC 2 60 3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt ñộ phytase từ chủng BC 2 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 1 Kết luận 63 2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Hàm lượng phytate và phospho trong các sản phẩm cây trồng [2] 5 1.2 Các nguồn cung cấp phytase 10 1.3 trọng lượng phân tử một số phytase [31] 14 1.4 Nhiệt ñộ và pH tối ưu của một số phytase 16 3.1 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi sinh vật tuy ển chọn 42 3.2 Chỉ số OD của các nồng ñộ KH 2 PO 4 khác nhau. 47 3.3 Khả năng phân giải Na-phytate bởi phytase của 12 chủng vi sinh vật kh ảo sát 49 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến khả năng sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 51 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến quá trình sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 52 3.6 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ñến khả năng sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 53 3.7 Ảnh hưởng của các nguồn cung cấp C ñến khả năng sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 54 3.8 Ảnh hưởng của các nồng ñộ tinh bột ñến khả năng sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 55 3.9 Ảnh hưởng của các nguồn cung cấp N ñến khả năng sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 56 3.10: Ảnh hưởng của các nồng ñộ NH 4 NO 3 ñến khả năng sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 57 3.11 Ảnh hưởng của các nồng ñộ Ca 2+ ñến khả năng sinh tổng hợp phytase c ủa chủng BC 2 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii 3.12 Ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa ñến hoạt ñộ chung của phytase t ừ chủng BC 2 59 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt ñộ của phytase 60 3.14 Ảnh hưởng của pH lên hoạt ñộ của phytase 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate BPP β-propeller phytase EX Enzym ngo ại bào FDA Food and Drug Administration HAPs axit histidin phosphatase HIV Human immunodeficiency virus IN Enzym n ội bào IN1 Enzyme n ội bào ñược tổng hợp ở trong tế bào chất IN2 Enzyme n ội bào dược tổng hợp ở lưới nội chất IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology IUPAC - IUB International Union of Pure and Applied Chemistry – International Union of Biochemistry JCBN Joint Commission on Biochemical Nomenclature KS K ỹ sư MR Methyl red NCBI National Center for Biotechnology Information NPY Neuropeptid Y OD Optical density PAP purple axit phosphatase pHop pH tối ưu 3-phytase Myo-inositolhexakisphosphat-3-phosphohydrolase 6-phytase Myo-inositolhexakisphosphat-6-phosphohydrolase TS Ti ến sĩ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc hóa học của acid phytic 4 1.2 Cấu trúc hóa học của phytate 4 1.3 Phản ứng thủy phân phytat bởi enzyme phytase 8 1.4 Phản ứng thủy giải liên kết ester tại vị trí C3, 4/6, và 5 của phytases trong vòng inositol cho cấu hình D / L tương ứng (Kerovuo và cộng sự, 2000) 11 1.5 Cấu trúc không gian 3 chiều của acid phosphatase 12 1.6 Cấu trúc không gian 3 chiều của β – propeller phytase 12 1.7 Cấu trúc không gian 3 chiều của purple acid phosphatase 13 1.8 Các con ñường thủy phân acid phytic của enzyme phytase 25 3.1 Các chủng vi sinh vật phân giải phytate trên môi trường LB (trái) và môi trường PSM (phải) 41 3.2 Khuẩn lạc chủng B1 43 3.3 Tế bào chủng B1 43 3.4 Khuẩn lạc chủng B2 44 3.5 Tế bào chủng B2 44 3.6 Khuẩn lạc chủng B3 44 3.7 Tế bào chủng B3 44 3.8 Khuẩn lạc chủng B6 44 3.9 Tế bào chủng B6 44 3.10 Khuẩn lạc chủng B9 45 3.11 Tế bào chủng B9 45 3.12 Khuẩn lạc chủng B11 45 3.13 Tế bào chủng B11 45 3.14 Khuẩn lạc chủng B12 45 3.15 Tế bào chủng B12 45 3.16 Khuẩn lạc chủng BC2 45 3.17 Tế bào chủng BC2 45 3.18 Khuẩn lạc chủng BC3 46 3.19 Tế bào chủng BC5 46 [...]... nuôi và th c ph m 2 M c ñích và yêu c u 2.1 M c ñích Nghiên c u ñư c ñ c ñi m sinh h c c a ch ng vi khu n Bacillus subtilis sinh phytase và m t s ñ c ñi m c a enzyme thu ñư c 2.2.Yêu c u Phân l p và tuy n ch n ch ng vi khu n Bacillus có kh năng sinh enzyme phytase cao Kh o sát các ñ c tính sinh h c c a ch ng vi khu n tuy n ch n Kh o sát m t s ñ c tính c a enzyme phytase sinh t ch ng vi khu n tuy n ch... và h sinh thái t o nên s ña d ng phong phú c a các loài vi sinh v t, cũng như do nhu c u và t m quan tr ng c a các s n ph m phytase thương m i, chúng tôi ñã ti n hành ñ tài “Kh o sát m t s ñ c tính sinh h c và ñ c ñi m enzyme phytase t Bacillus subtilis BC2 nh m tìm ki m vi sinh v t có kh năng sinh enzyme phytase cao và là ch ng an toàn, ñáp ng nhu c u trong công nghi p ch bi n th c ăn chăn nuôi và. .. phospho c a cây(Richardson et al., 2001) 1.3 Bacillus và phytase c a Bacillus 1.3.1 Vài nét v Bacillus Trong các gi ng vi khu n, Bacillus là gi ng có m c ñ ph bi n cao và có nhi u công trình nghiên c u v ñ c ñi m, sinh lý cũng như kh năng c m ng, sinh t ng h p các lo i enzyme Bacillus là vi khu n gram dương, hình que, s ng hi u khí, có kh năng sinh bào t và khi sinh bào t thì không làm bi n d ng hình thái... c hi u v i ATP (ho t ñ ñ t 50%) và ADP (ho t ñ ñ t 75%) Tính ñ c hi u c a phytase Bacillus r t cao, tuy nhiên hi u qu ñ c hi u th p, so v i phytase sinh t ng h p t các ngu n khác Ho t ñ ñ c hi u th p làm c n tr vi c s d ng phytase c a Bacillus trong s n xu t công nghi p 1.3.4 Các ñ c tính lý hóa h c c a phytase t Bacillus 1.3.4.1 Tr ng lư ng phân t Phytase Bacillus là enzyme ñơn phân t B ng phương... c ch c a c phyA và phyB c a A.ficuum Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 17 1.2.4.6 Các y u t nh hư ng lên quá trình sinh t ng h p phytase vi sinh vât Phytase là s n ph m ñư c vi sinh v t t ng h p trong quá trình sinh trư ng m t s vi sinh v t (n m m c, vi khu n Bacillus ) phytase ñư c ti t vào môi trư ng nuôi c y, m t s vi sinh v t khác, phytase ch ñư c... cho quá trình phát tri n, các ch ng Bacillus có th i gian sinh trư ng khá ng n, kho ng 24 gi Các ch ng Bacillus ñư c nghiên c u khá nhi u, ñ c bi t là trong vi c s d ng ñ t ng h p nhi u lo i enzyme khác nhau: amylase, protease, phytase .M t vài nghiên c u (Idriss và c ng s , 2002 ; Richardson và c ng s 2001) cho th y m t s ch ng Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens ñóng vai trò... có kh năng t o phytase tuy nhiên v i m t lư ng r t ít, không ñ ñ phân gi i phytat trong ñ t, do ñó s xu t hi n c a các ch ng Bacillus có kh năng sinh t ng h p phytase có ý nghĩa quan tr ng 1.3.2 Phân lo i phytase c a Bacillus Phytase sinh t ng h p t Bacillus có hai lo i là phyC (Kerovuo, 1998) và TS – phy (Kim, 1998) C hai lo i này ñ u thu c nhóm β-propeller phytase (BPP) S ph thu c vào liên k t v... nhóm enzyme này Hình 1.7: C u trúc không gian 3 chi u c a purple acid phosphatase 1.2.4 Các ñ c tính lý, hóa c a phytase [7, 34] 1.2.4.1 C u t o và tr ng lư ng phân t H u h t các phytase ñã ñư c xác ñ nh là các enzyme ñơn phân t Ví d như phytase c a vi n m (Wyss và c ng s , 1999, Ullah và Gibson, 1987; Dvorakova et al, 1997), E.coli và Klebsiella terrigena (Greiner và c ng s , 1993; Greiner và c ng... trên gel SDS, các nhà khoa h c ñã xác ñ nh phytase c a Bacillus có tr ng lư ng phân t trong kho ng 36,5 – 44 kDa, trong ñó phytase c a Bacillus subtilis có tr ng lư ng là 44 kDa (Yang Mun Choi, 2001) 1.3.4.2 Thành ph n acid amin trong phytase t Bacillus Trong phytase c a Bacillus subtilis có h u h t các lo i acid amin Trong 1 mol phytase có ch 3 mol tryptophan và 12 mol tyronsin, còn l i là các lo i khác,... khi bi n tính 90oC (Wyss và c ng s , 1999) 1.2.4.3 pH [2, 7, 8, 30] Giá tr pH là y u t quan tr ng nh t nh hư ng ñ n ho t tính xúc tác c a enzyme Enzyme r t nh y c m v i s thay ñ i pH c a môi trư ng M i lo i enzyme thư ng ch ho t ñ ng m nh nh t m t vùng pH xác ñ nh g i là pH t i thích ð pH nh hư ng ñ n ho t tính c a enzyme do pH làm thay ñ i tr ng thái ion hóa c a enzyme và c a cơ ch t, ph c h p enzyme- cơ . và tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme phytase cao. Khảo sát các ñặc tính sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn. Kh ảo sát một số ñặc tính của enzyme phytase sinh từ. BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  CÙ THU HÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ðẶC ðIỂM ENZYME PHYTASE TỪ BACILLUS SUBTILIS BC 2 . hành ñề tài Khảo sát một số ñặc tính sinh học và ñặc ñiểm enzyme phytase t ừ Bacillus subtilis BC 2 ” nhằm tìm kiếm vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và là ch ủng an toàn, ñáp