TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SÀNG LỌC CHỦNG VI KHUẨN PROBIOTIC ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI CBHD: PGS.TS. NGUY Ễ N THÚY HƯƠNG KS. PHAN THỊ THU DUNG SVTH: HOÀNG NGÂN HÀ MSSV: 60600569 iii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, bên cạnh sự cố gắng nổ lực của bản thân tôi còn nhận được sự giúp đỡ của: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương  Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp HCM  đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình các vấn đề liên quan đến đề tài. KS. Phan Thị Thu Dung  đã gợi ý đề tài và cung cấp mẫu trong quá trình phân lập. Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Bách Khoa TPHCM – là những người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường, giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Các cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108, 117 của Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM – đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc. Gia đình tôi đã động viên tinh thần và giúp đỡ về mặt kinh tế để tôi có thể an tâm thực hiện luận văn. Tôi xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành. iv TÓM TẮT Probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe con người và động vật. Ngày nay, probiotic không chỉ được sử dụng cho người mà con ứng dụng trong chăn nuôi. Nhằm mục đích sàng lọc chủng vi khuẩn probiotic để ứng dụng trong chăn nuôi, tiến hành phân lập hệ vi khuẩn trong đường ruột heo con dưới 20 ngày tuổi, kết quả thu được 10 chủng kí hiệu L1 đến L10 từ mẫu ruột non và 6 chủng kí hiệu K3, K4, K5, K6, K7, K9 từ mẫu ruột già. Qua quá trình sàng lọc hoạt tính probiotic ta thu được hai chủng K6, K7 có khả năng chịu được điều kiện cực đoan nhất. Kết quả định danh hai chủng này bằng bộ kit API50 CHL như sau K6: Lactobacillus acidophilus và K7: Bifidobacterium bifidum. v MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC ĐỒ THỊ x CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3 Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình chăn nuôi heo trên thế giới và ở Việt Nam 3 2.1.1 Tình hình chăn nuôi trên thế giới 3 2.1.2 Tình hình chăn nuôi ở Việt Nam 4 2.2 Đặc điểm của heo con 6 2.2.1 Giới thiệu chung 6 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến heo con trong giai đoạn cai sữa 7 2.2.3 Đặc điểm của hệ tiêu hóa heo 8 2.2.4 Hệ vi sinh vật đường ruột của heo trong giai đoạn cai sữa 8 2.2.5 Hình thái học ruột non của heo con 9 2.3 Tổng quan về probiotic 11 2.3.1 Định nghĩa probiotic 11 2.3.2 Giới thiệu nhóm vi khuẩn được sử dụng làm probiotic 12 2.3.3 Tác động của probiotic 17 2.3.4 Ảnh hưởng của probiotic đến hệ vi khuẩn đường ruột heo con 17 vi 2.3.5 Ảnh hưởng của probiotic lên sự tăng trưởng của heo 19 2.3.6 Tình hình sử dụng probiotic trong thức ăn chăn nuôi trên thế giới và ở Việt Nam 21 2.4 Prebiotic và synbiotic 24 2.4.1 Prebiotic 24 2.4.2 Synbiotic 24 2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 27 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32 3.1 Vật liệu và môi trường 32 3.2 Nội dung nghiên cứu 35 3.3 Phương pháp nghiên cứu 37 3.3.1 Quy trình thu nhận mẫu và phân lập 37 3.3.2 Cấy chuyền và làm thuần chủng vi khuẩn phân lập 39 3.3.3 Quan sát đại thể và vi thể 39 3.3.4 Đặc điểm sinh lý 40 3.3.5 Thử nghiệm sinh hóa nhằm định danh các vi khuẩn phân lập 41 3.3.6 Sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic cao 42 3.3.7 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh API50 CHL 44 3.3.8 Khảo sát giống 44 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47 4.1 Phân lập và chọn giống vi khuẩn lactic 47 4.1.1 Đặc điểm đại thể và vi thể 47 4.1.2 Đặc điểm sinh lý 53 4.1.3 Đặc điểm sinh hóa của hệ vi sinh vật phân lập 54 4.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic cao 58 vii 4.2.1 Khả năng sống trong môi trường pH thấp 58 4.2.2 Khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh 62 4.3 Kết quả định danh từ bộ kit API 50 CHL 63 4.4 Khảo sát giống 65 4.4.1 Xây dựng đường tương quan OD 610 và mật độ tế bào (CFU/ml) 65 4.4.2 Đường cong sinh trưởng 67 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 5.1 Kết luận 71 5.2 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Diễn biến số lượng đàn heo thế giới 3 Bảng 2.2: Lượng thịt heo tiêu thụ năm 2006 4 Bảng 2.3: Diễn biến số lượng đàn heo và sản lượng thịt heo Việt Nam 5 Bảng 2.4: Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người 13 Bảng 2.5: Những chủng vi sinh vật dùng làm probiotic cho động vật 15 Bảng 2.6: Tác động của một số chủng probiotic đến hệ vi khuẩn đường ruột heo . 18 Bảng 2.7: Tác động của probiotic lên khả năng tăng trưởng của heo 19 Bảng 2.8: Các loại oligosaccharide dùng làm prebiotic 24 Bảng 4.1: Đặc điểm đại thể và vi thể của vi khuẩn phân lập từ đường ruột heo 48 Bảng 4.2: Đặc điểm sinh lý của hệ vi khuẩn phân lập từ ruột heo 53 Bảng 4.3: Kết quả thử nghiệm catalase và khả năng sinh acid 54 Bảng 4.5: Sự thay đổi số lượng tế bào theo thời gian ở các mức pH khác nhau 59 Bảng 4.6: Khả năng kháng Bacillus sp. của các chủng thử nghiệm 62 Bảng 4.7: Kết quả định danh bằng bộ kit API50 CHL 64 Bảng 4.8: Số liệu đường chuẩn của Lactobacillus acidophilus trên môi trường MRS 65 Bảng 4.9: Số liệu đường chuẩn của Bifidibacterium bifidum trên môi trường MRS 66 Bảng 4.10: Độ đục thay đổi theo thời gian nuôi cấy của Lactobacillus acidophilus 68 Bảng 4.11: Độ đục thay đổi theo thời gian nuôi cấy của Bifidobacterium bifidum68 ix DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Heo con 6 Hình 2.3: Cấu tạo ruột non của heo 9 Hình 2.4: Ảnh chụp hiển vi lông ruột của heo 45 ngày tuổi 10 Hình 2.4: Vi khuẩn bám trên thành ruột 16 Hình 2.4: Sản phẩm probiotic cho heo 21 Hình 2.5: Sản phẩm probiotic cho gà, tôm, cá 23 Hình 2.6: Tác động của FOS 26 Hình 4.1: Mẫu ruột heo 47 Hình 4.1: Đặc điểm đại thể của các chủng phân lập được 51 Hình 4.2: Đặc điểm vi thể của hệ vi khuẩn phân lập từ mẫu ruột heo 53 Hình 4.3: Khả năng lên men các loại đường 57 Hình 4.4: Hoạt tính ức chế Bacillus sp. của các chủng phân lập 63 Hình 4.5: Hình kết quả định danh bằng bộ kit API50 CHL 64 x DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1: Đường chuẩn của Lactobacillus acidophilus 66 Đồ thị 4.2: Đường chuẩn của Bifidobacterium bifidum 67 Đồ thị 4.3: Đường cong sinh trưởng của chủng Lactobacillus acidophilus 69 Đồ thị 4.4: Đường cong sinh trưởng của chủng Bifidobacterium bifidum 70 Chương 1: Mở đầu 1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Dân số thế giới ngày càng gia tăng, đòi hỏi ngành nông nghiệp phải ngày càng phát triển để đáp ứng nhu cầu lương thực thực phẩm gia tăng nhanh chóng. Trong đó, cùng với trồng trọt thì chăn nuôi đóng vai trò quan trọng, cung cấp một lượng thực phẩm lớn cho con người. Đối với nước ta, là một nước nông nghiệp thì chăn nuôi là một ngành kinh tế quan trọng, vừa đáp ứng nhu cầu trong nước vừa đáp ứng nhu cầu xuất khẩu. Hiện nay việc sử dụng kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi đang rất tràn lan và thiếu kiểm soát. Dư lượng kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng trong gia súc làm giảm chất lượng thịt, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng và lo ngại sử dụng quá nhiều sẽ dẫn tới hiện tượng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh trong đường ruột. Từ năm 2006, ở Châu Âu đã phản đối mạnh mẽ việc sử dụng kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng hóa học trong chăn nuôi. Từ đó, việc nhập khẩu thịt heo của nước ta gặp phải rất nhiều khó khăn. Tuy nhiên việc cấm sử dụng các chất kháng sinh lại dẫn tới việc gia tăng nguy cơ mắc các bệnh về đường ruột như bệnh tiêu chảy và dẫn tới tử vong cho heo, mà trong chăn nuôi theo qui mô công nghiệp thì việc điều khiển năng suất và phòng ngừa được dịch bệnh là rất quan trọng. Đặc biệt, trong quá trình sinh trưởng và phát triển của heo thì thời điểm heo tách mẹ là giai đoạn quan trọng nhất, heo con thường bị stress do một số yếu tố bất lợi như: dinh dưỡng, môi trường, mất cân bằng hệ đường ruột. Kết quả là khả năng tiêu thụ thức ăn thấp, giảm chức năng tiêu hoá … dẫn đến hiện tượng tiêu chảy và sinh trưởng kém, ảnh hưởng đến toàn bộ quá trình phát triển của heo. Để thay thế chất kích thích tăng trưởng người ta muốn tìm một chất phụ gia khác. Và chất phụ gia trong thức ăn cho heo con cho đến nay là prebiotic, probiotic và synbiotic (là sự kết hợp của prebiotic và probiotic). Probiotic giúp kích thích tiêu hóa, tăng khả năng tiêu thụ thức ăn và khả năng miễn dịch của heo, phòng ngừa dịch bệnh đường ruột. [...]... nhiên, hiện nay các chủng vi khuẩn probiotic sử dụng trong chăn nuôi đang được nghiên cứu còn khá ít Từ những yêu cầu cấp thiết trên vi c nghiên cứu để tìm ra những chủng vi khuẩn probiotic có khả năng ứng dụng trong chăn nuôi là rất cần thiết 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích tìm ra những chủng vi khuẩn probiotic có khả năng ứng dụng trong chăn nuôi, giúp cải thiện... ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi và vi c sử dụng probiotic giúp cải thiện dinh dưỡng, giảm nguy cơ các bệnh về đường ruột Ngoài ra sử dụng probiotic còn làm giảm mối nguy gây bệnh trong thức ăn heo Nhiều chủng vi khuẩn được sử dụng làm probiotic được phân lập từ hệ đường ruột, miệng, phân của một số động vật và con người Nhóm vi khuẩn thường được dùng làm probiotic ở động vật là Lactobacillus,... nhiều vi khuẩn sống mà khi cung cấp cho người hay động vật thì mang lại những hiệu quả có lợi cho vật chủ bằng cách tăng cường các đặc tính của vi sinh vật trong hệ tiêu hóa [31][15] 2.3.2 Giới thiệu nhóm vi khuẩn được sử dụng làm probiotic 2.3.2.1 Nhóm vi khuẩn dùng làm probiotic cho người Dòng vi khuẩn phổ biến: vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) LAB đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe, được sử dụng. .. gia, để có hiệu quả các chủng probiotic cần phải đáp ứng điều kiện sau:  Sống được và ổn định trong thực phẩm gia súc  Có khả năng sống và sinh sản sau khi đi qua dạ dày  Cản trở ảnh hưởng của những vi khuẩn gây bệnh hoặc tiết ra các hợp chất chuyển hóa để ức chế vi khuẩn gây bệnh [22] 14 Chương 2: Tổng quan tài liệu Bảng 2.5: Những chủng vi sinh vật dùng làm probiotic cho động vật [19] Gia súc Chủng. .. các vi khuẩn tạo amin trong ruột và hạn chế sự hình thành những sản phẩm đồng hóa gây ung thư Đồng thời, chúng cũng làm giảm cholesterol, tăng và cân bằng oestrogen, phòng chống bệnh loãng xương, tránh những bệnh vi m nhiễm [4] 2.3.4 Ảnh hưởng của probiotic đến hệ vi khuẩn đường ruột heo con Một trong những lý do chính để bổ sung probiotic là nhằm ổn định hệ vi khuẩn đường ruột và chống lại các vi khuẩn. .. EU, Mỹ, Nga,… [39] 2.1.2 Tình hình chăn nuôi ở Vi t Nam Ở Vi t Nam chăn nuôi heo xuất hiện từ lâu đời và trở thành một nghề truyền thống của nông dân, tuy nhiên trình độ chăn nuôi lạc hậu cùng vi c sử dụng các giống nguyên thủy có sức sản xuất thấp nên hiệu quả không cao Chăn nuôi heo ở nước ta chỉ thực sự phát triển mạnh từ những năm cuối thế kỷ XX đầu thế kỷ XXI Trong thời gian gần đây do tình hình... nhóm vi khuẩn lactic kích thích sự phát triển của hệ vi khuẩn đường ruột Bổ sung probiotic làm kích thích sự tăng trưởng bifidobacteria và lactobacilli góp phần 17 Chương 2: Tổng quan tài liệu bảo vệ bảo vệ heo con khỏi mắc bệnh (Xuan và cs, 2001) Probiotic bổ sung vào sẽ ảnh hưởng đến một số vi khuẩn trong đường ruột và ở những mức nhất định Bảng 2.6: Tác động của một số chủng probiotic đến hệ vi khuẩn. .. chủng vi khuẩn bổ sung có tác dụng trong hệ tiêu hóa thì phải bổ sung đến một giới hạn nhất định khi đó các amino acid, vitamin, kháng thể do chúng sinh ra mới biểu hiện Thường vi khuẩn probiotic bổ sung chiếm 106 đến 107/g thì chúng sẽ cân bằng với hệ vi sinh vật có sẵn trong hệ tiêu hóa của động vật [21] Đối với nhiều loài động vật khác nhau thì ta có nhiều cách để bổ sung probiotic khác nhau, trong. .. cho vi c sử dụng probiotic cho động vật: Từ năm 1970, vi c sử dụng các chất phụ gia trong thức ăn cho động vật đã được quy định chặt chẽ ở châu Âu (quy định điều 70/524/EEC) và được điều chỉnh lại năm 1994 Những quy định này nhằm đảm bảo sự an toàn trong vi c sử dụng 16 Chương 2: Tổng quan tài liệu các vi sinh vật, enzyme làm chất phụ gia trong thức ăn của động vật Quy định an toàn như sau:  Các chủng. .. toàn như sau:  Các chủng vi sinh vật không được chứa các gen kháng kháng sinh, gen sinh độc tố cho các đối tượng và người sử dụng  Các chủng vi khuẩn probiotic phải được kiểm tra hoạt tính, khả năng gây bệnh và khả năng tác động đến đường tiêu hóa trước khi sử dụng 2.3.3 Tác động của probiotic Cơ chế tác động của vi khuẩn probiotic lên cơ thể kí chủ như: tạo cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột bằng . học Bách Khoa Tp HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Các bạn sinh viên lớp HC0 6BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM – đã cùng học. quá trình phân lập. Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Bách Khoa TPHCM – là những người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập. được sự giúp đỡ của: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương  Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa Tp HCM  đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình các vấn đề liên quan đến đề tài. KS. Phan Thị Thu Dung