ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn này em đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Đại Học Bách Khoa TP.HCM, cũng như sự hợp tác, hỗ trợ tích cực của các bạn lớp HC06BSH. Em xin chân thành cảm ơn thầy cô và các bạn đã giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới Th.S Hoàng Mỹ Dung, giảng viên trực tiếp hướng dẫn em thực hiện đề tài này. Cô đã giúp em chọn đề tài, định hướng luận văn, chia sẻ tài liệu và dành rất nhiều thời gian để sửa bài, góp ý cũng như động viên tinh thần để em có thể hoàn thành cuốn luận văn này. Cuối cùng em xin cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã hỗ trợ cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình em thực hiện luận văn này. Ba mẹ, người thân và bạn bè luôn luôn ở bên cạnh để động viên, giúp đỡ em vượt qua những khó khăn, trở ngại cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. iii MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii CHƯƠNG 1. HPV 1 1.1. Cấu tạo: 1 1.2. Phân loại: 3 1.3. Sinh sản: 3 CHƯƠNG 2. HPV VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 5 2.1. Lịch sử: 5 2.2. Ung thư cổ tử cung: 6 2.3. Các yếu tố nguy cơ : 9 2.4. Triệu chứng: 10 2.5. Giải phẫu bệnh: 11 2.5.1. Đại thể: 11 2.5.2. Vi thể: 12 2.6. Các giai đoạn: 13 2.7. Cơ chế bệnh sinh nhiễm HPV: 19 2.8. Tầm soát HPV & ung thư cổ tử cung: 22 2.8.1. Xét nghiệm Pap (Pap smear): 23 2.8.2. Quan sát bằng mắt thường với axít axêtic (VIA): 25 2.8.3. Quan sát bằng mắt thường với dung dịch iốt Lugol (VILI): 26 2.8.4. Xét nghiệm HPV DNA: 27 2.9. Điều trị ung thư cổ tử cung: 31 2.9.1. Các phương pháp điều trị: 31 2.9.2. Áp dụng điều trị: 33 2.9.3. Kết quả: 36 2.9.4. Biến chứng: 37 CHƯƠNG 3. VACCINE NGỪA UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 38 iv 3.1. Cơ chế đáp ứng miễn dịch đối với vaccine: 38 3.2. Phân loại vaccine: 41 3.2.1. Vaccine cổ điển: 41 3.2.2. Vaccine thế hệ mới: 42 3.2.3. Vaccine dùng để điều trị: 43 3.3. Vaccine ngừa HPV: 43 3.3.1. Vaccine Gardasil: 43 3.3.2. Vaccine Cervarix: 46 CHƯƠNG 4. SẢN XUẤT VACCINE NGỪA UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 57 4.1. Tối ưu hóa điều kiện sản xuất và tinh sạch HPV 16 L1 ở S. cerevisiae: 57 4.2. Nguyên liệu & phương pháp: 61 4.3. Kết quả: 62 4.3.1. Sự phụ thuộc của sản xuất HPV 16 protein L1 trên nguồn carbon: 62 4.3.2. Tối ưu hóa tinh sạch HPV 16 L1: 62 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Virus HPV 1 Hình 1.2: Cấu trúc ADN của HPV. 2 Hình 1.3: Cơ chế sao chép HPV. 3 Hình 1.4: Giai đoạn HPV xâm nhiễm tế bào chủ. 4 Hình 2.1: Công trình đoạt giải Nobel Y học 2008. 5 Hình 2.2: Cổ tử cung 6 Hình 2.3: Ung thư cổ tử cung. 7 Hình 2.4: Tỷ lệ mắc HPV theo tuổi ở phụ nữ trên thế giới. 8 Hình 2.5: Các yếu tố nguy cơ của ung thư cổ tử cung. 9 Hình 2.6: Tế bào biểu mô lát ác tính trong ung thư cổ tử cung. 13 Hình 2.7: Cấu trúc ADN HPV 16. 19 Hình 2.8: Cơ chế sinh bệnh nhiễm HPV. 20 Hình 2.9: Cơ chế sinh bệnh ung thư cổ tử cung. 21 Hình 2.10: Các dụng cụ trong pap smear 23 Hình 2.11: Phương pháp pap smear. 24 Hình 2.12: Vị trí các gen L1 và E6/E7 của HPV và độ dài sản phẩm PCR. 28 Hình 2.13: Kết quả ts-PCR định type HPV type 33, 6/11, 58, 52 và 56. 29 Hình 2.14: Kết quả ts-PCR định type HPV type 35, 42, 43 và 44. 29 Hình 2.15: Kết quả ts-PCR định type HPV type 68, 39, 51 và 66. 29 Hình 2.16: Kết quả ts-PCR định type HPV type 16, 18, 31, 59 và 45. 30 Hình 2.17: Phát hiện và định type HPV bằng kỹ thuật NMPCR. 30 Hình 3.1: Đáp ứng miễn dịch qua dịch thể và trung gian tế bào. 39 Hình 3.2: Vaccine Gardasil. 46 Hình 3.3: Vaccine Cervarix 46 Hình 4.1: Sinh tổng hợp vaccine HPV L1 VLP. 58 Hình 4.2: Quy trình tinh sạch HPV 16 L1 VLP. 61 Hình 4.3: Sự phụ thuộc của HPV 16 L1 ở S.cerevisiae trên nguồn carbon. 62 Hình 4.4: Tinh sạch HPV 16 L1 bằng sắc ký trao đổi cation. 64 Hình 4.5: Hình ảnh lắp ráp protein HPV 16 L1 dưới KHV điện tử. 65 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Triệu chứng ung thư cổ tử cung. 11 Bảng 2.2: Hình dạng đại thể ung thư cổ tử cung 12 Bảng 2.3: Phân loại ung thư cổ tử cung theo FIGO & UICC. 14 Bảng 2.4: Phân loại theo CIN 17 Bảng 2.5: Phân loại theo WHO. 18 Bảng 2.6: Kết quả điều trị. 36 Bảng 3.1: Hiệu quả vaccine Cervarix trên quần thể chưa phơi nhiễm. 49 Bảng 3.2: Hiệu quả vaccine Cervarix trên quần thể chung. 50 Bảng 3.3: Vaccine Gardasil và Cervarix. 56 Bảng 4.1: Các phương pháp tinh sạch HPV 16 L1 tái tổ hợp. 60 vii CHỮ VIẾT TẮT ASC – H: Atypical Squamous Cells, cannot rule out a High-grade lesion, tế bào trụ không điển hình, không thể loại trừ khả năng một tổn thương cao cấp ASC – US: Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance, tế bào trụ không điển hình, không xác định nguyên nhân. ASC: Atypical Squamous Cells, tế bào trụ không điển hình CIN: Cervical Intraepithelial Neoplasia, tân sinh biểu mô cổ tử cung DNA: Deoxyribonucleic Acid E: Early, vùng gen sớm FIGO: International Federation of Gynecology and Obstetrics, Hiệp hội Phụ khoa và Phụ sản quốc tế HPV: Human papillomavirus HSIL: High-grade Squamous Intraepithelial Lesion, tổn thương biểu mô lát mức độ cao L: Late, vùng gen trễ LCR: Long Control Region, vùng kiểm soát dài LSIL: Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion, tổn thương biểu mô lát mức độ thấp NCCC: National Cervical Cancer Coalition, Liên minh ung thư cổ tử cung Hoa Kỳ PCR: Polymerase Chain Reaction UICC: Union for International Cancer Control, Hiệp hội kiểm soát ung thư quốc tế UTCTC: Ung thư cổ tử cung VaIN: Vaginal Intraepithelial Neoplasia, tân sinh biểu mô âm đạo VIA: Visual Inspection with Acetic acid, quan sát bằng mắt thường với acid acetic VILI: Visual Inspection with Lugol's Iodine, quan sát bằng mắt thường với dung dịch Iốt Lugol VIN: Vulvar Intraepithelial Neoplasia, tân sinh biểu mô âm hộ WHO: World Health Organization, Tổ chức Y tế thế giới viii TÓM TẮT Ung thư cổ tử cung là một trong những căn bệnh ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ, đứng hàng thứ hai trên thế giới (sau ung thư vú). Theo các nghiên cứu ung thư tại Việt Nam thì trong các ung thư ở phụ nữ, ung thư cổ tử cung đứng hàng thứ hai sau ung thư vú tại Hà Nội và đứng đầu tại Thành Phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, đa số những căn bệnh ung thư cổ tử cung đều có thể được chữa khỏi nếu phát hiện sớm bằng các xét nghiệm pap smear và HPV DNA. Nguyên nhân chính của ung thư cổ tử cung là do sự có mặt của virus gây u nhú ở người Human papillomavirus (HPV). Hiện nay, trên thế giới đã sản xuất được 2 chủng vaccine phòng ngừa HPV là Gardasil (Merck) và Cervarix (GSK). Luận văn sẽ tìm hiểu về các loại vaccine phòng ngừa ung thư cổ tử cung trên. ABSTRACT Cervical cancer is one of the most popular cancers in women. It has ranked second in worldwide (after breast cancer). According to the cancer researchs in Vietnam, among of women’s cancers, cervical cancer ranks second after breast cancer in Hanoi and first in Ho Chi Minh City. However, most cervical cancers can be hell if detected early by Pap smear and HPV DNA. The main cause of cervical cancer is the presence of Human papillomavirus (HPV). Currently, there are two vaccines protecting against HPV infections, Gardasil (Merck) and Cervarix (GSK). This thesis will learn about these vaccines to prevent cervical cancer. Chương 1. HPV 1 CHƯƠNG 1. HPV 1.1. Cấu tạo: Human papillomavirus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae, gồm các chi: Alphapapilloma, Betapapilloma, Gammapapilloma, Mupapilloma, Nupapilloma. [1] HPV là một loại virus chứa DNA kép, dạng vòng, kích thước 5300 – 8000 nucleotid, guanine + cytosine chiếm 40-50%, khối lượng phân tử khoảng 3 – 5 x 10 6 Dalton. HPV có cấu trúc đối xứng lập phương, hạt hình đa diện, capsid dạng khối, không có vỏ ngoài, đường kính 40-55nm, gồm 72 capsome sắp xếp nghiêng. [2] Hình 1.1: Virus HPV [Nguồn: www.med-ars.it] DNA của HPV gồm 3 vùng chính: vùng kiểm soát dài (LCR), vùng gen sớm (E1-8) và vùng gen trễ (L1-2). Vùng gen sớm (E) bao gồm một số gen điều khiển quá Chương 1. HPV 2 trình tự sao, phiên mã virus và kiểm soát chu trình tế bào. Vùng gen trễ (L) chứa 2 gen mã hóa protein capsid. Vùng kiểm soát dài (LCR) có tất cả các yếu tố điều hòa cis cần thiết cho HPV phiên mã bao gồm promoter sớm và điểm bắt đầu sao chép (ori). [3] Hình 1.2: Cấu trúc ADN của HPV. Chương 1. HPV 3 1.2. Phân loại: Có hơn 100 loại HPV, chia làm 2 nhóm: HPV nguy cơ cao và HPV nguy cơ thấp (về tính gây ung thư). Những nhóm có nguy cơ cao có liên quan mạnh đến bệnh lý ung thư: hầu như các trường hợp ung thư cổ tử cung đều phát hiện có nhiễm HPV nguy cơ cao; trái lại nhóm HPV nguy cơ thấp thì hiếm khi gặp trong các trường hợp ung thư. Trong 40 loại HPV gây bệnh ở cơ quan sinh dục con người, có 14 loại được liệt vào hạng "độc" (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68). Hai loại thường gặp nhất là HPV-16 và HPV-18 có khả năng nhiễm sâu vào cổ tử cung phụ nữ, sau đó làm tân sinh biểu mô tử cung (CIN: cervical intraepithelial neoplasia) và gây bệnh ung thư cổ tử cung. Ngoài ra HPV loại độc cũng là nguyên nhân gây ung thư âm đạo, ung thư âm hộ, ung thư hậu môn, ung thư dương vật, ung thư đầu và cổ. Loại ít độc hơn, HPV-6 và HPV-11, có thể gây 90% chứng mụn cóc (mào gà) của cơ quan sinh dục. Loại nhẹ gây chứng mụn cóc ở tay (HPV-2) và bàn chân (HPV-1). [4] 1.3. Sinh sản: Hình 1.3: Cơ chế sao chép HPV. [...]... Chương 2 HPV và ung thư cổ tử cung HPV DNA được tìm thấy ở bệnh nhân ung thư cổ tử cung nhờ mẫu dò PNAS 1983 HPV sau khi nhiễm vào cổ tử cung sẽ được nhân lên Tuy nhiên, 90% các trường hợp nhiễm HPV sẽ tự khỏi sau 2 năm Nếu bị nhiễm HPV lâu dài (10-30 năm) sẽ gây ung thư xâm lấn 2.2 Ung thư cổ tử cung: Hệ thống cơ quan sinh sản phụ nữ bao gồm buồng trứng, ống dẫn trứng, tử cung và âm đạo Cổ tử cung là phần... nhất gây ra ung thư cổ tử cung Những tế bào bất thư ng này được gọi là tân sinh trong biểu mô cổ tử cung (CIN) Nếu không được điều trị, nó sẽ dần trở thành ung thư Hình 2.2: Cổ tử cung [Nguồn: www.giaoducsuckhoe.com] 6 Chương 2 HPV và ung thư cổ tử cung Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư cổ tử cung là loại ung thư thường gặp ở phụ nữ, do quá trình viêm nhiễm kéo dài (khoảng 20 năm) các loại vi... thư cổ tử cung [Nguồn: www.adam.com] 7 Chương 2 HPV và ung thư cổ tử cung Tuổi thư ng gặp ung thư cổ tử cung là 30-59, đỉnh cao là 48-52 tuổi Có thể nhận thấy là đỉnh của ung thư cổ tử cung muộn hơn tân sinh cổ tử cung khoảng 10-15 năm [8] Hình 2.4: Tỷ lệ mắc HPV theo tuổi ở phụ nữ trên thế giới [Nguồn: www.medscape.org] Tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất ở lứa tuổi 20-24 trong khi tỷ lệ ung thư cổ tử cung cao... bội nhiễm và hoại tử Dạng thâm Xuất phát từ kênh cổ tử cung, tiến tới ăn toàn bộ cổ tử cung nhiễm Dạng loét Hủy hoại cấu trúc cổ tử cung và sớm ăn lan vào tận cùng âm đạo Bảng 2.2: Hình dạng đại thể ung thư cổ tử cung 2.5.2 Vi thể: Nghịch sản cổ tử cung (CIN): dị dạng tế bào xảy ra ở biểu mô cổ tử cung, thư ng được phát hiện bằng phết tế bào cổ tử cung, và chia làm 3 độ CIN là chỉ dành cho tế bào biểu... các loại vi rút HPV, ung thư cổ tử cung đứng hàng thứ hai trên thế giới sau ung thư vú Theo các nghiên cứu ung thư tại Việt Nam thì trong các ung thư ở phụ nữ, ung thư cổ tử cung đứng hàng thứ hai sau ung thư vú tại Hà Nội và đứng đầu tại TP.HCM Các chuyên gia ung thư chưa lý giải được vì sao phụ nữ ở TP.HCM lại có tỷ lệ mắc cao như thế [7] Thống kê của Liên minh ung thư cổ tử cung Hoa Kỳ (NCCC) cho... dưới của tử cung (dạ con) Kênh cổ tử cung đi ngang qua cổ tử cung, cho phép kinh nguyệt hoặc bào thai đi từ tử cung vào âm đạo, và tinh dịch đi từ âm đạo vào tử cung Âm đạo là cấu trúc của hàng triệu tế bào nhỏ Thỉnh thoảng, những thay đổi có thể xảy ra đối với các tế bào này Những thay đổi này nếu không được điều trị kịp thời có thể phát triển thành ung thư cổ tử cung Nhiễm trùng cổ tử cung với virus... năm; 20 Chương 2 HPV và ung thư cổ tử cung khoảng 50% dị sản nặng sẽ trở thành ung thư tại chỗ cổ tử cung, đặc biệt khả năng này ít gặp ở người trẻ tuổi Hình 2.9: Cơ chế sinh bệnh ung thư cổ tử cung HPV tác động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung tại nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp 2 lọai mô khác nhau: biểu mô tế bào trụ tuyến và biểu mô lát tầng... Chương 2 HPV và ung thư cổ tử cung giai đoạn này sẽ không phát triển thành ung thư, nhưng khoảng 12% sẽ phát triển thành ung thư chưa di căn (giai đoạn 3) - Giai đoạn 3 là ung thư chưa di căn / ung thư tại chỗ (carcinoma in-situ): Ở giai đoạn này, tế bào có dấu hiệu ung thư nhưng chỉ giới hạn trong cổ tử cung, và do đó điều trị có thể đem lại kết quả khả quan Một số trường hợp ung thư cổ tử cung ở giai... nguy cơ của ung thư cổ tử cung Có nhiều tác nhân dẫn đến ung thư cổ tử cung, mà nhiễm virus HPV là nguy cơ chính Trong hơn 100 chủng HPV, có 14 chủng (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) dẫn đến ung thư, thư ng gặp nhất là 2 chủng HPV 16, 18 Quá trình 9 Chương 2 HPV và ung thư cổ tử cung diễn tiến từ nhiễm virus đến ung thư thường lâu dài, từ loạn sản nhẹ, vừa, nặng đến ung thư tại... Contre le Cancer), ung thư cổ tử cung gồm các giai đoạn: 13 Chương 2 HPV và ung thư cổ tử cung FIGO Biểu hiện của tế bào cổ tử cung UICC 0 Ung thư tại chỗ Tis I Khư trú ở cổ tử cung T1 IA Vi xâm lấn, chỉ thấy ở kính hiển vi T1a IB Xâm lấn, tổn thư ng có d>2mm T1b II Lan quá CTC, tới âm đạo nhưng chưa tới vách chậu T2 IIA Âm đạo (trừ 1/3 dưới) T2a IIB Chu cung nhưng đáy tử cung còn di động được T2b III