TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT CLEA ĐỂ THU NHẬN ENZYME CELLULASE CBHD: TS. HUỲNH NGỌC OANH SVTH: NGUY Ễ N BÁ HUY MSSV: 60600883 i LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Hóa học và Dầu khí đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt những năm học vừa qua, đặc biệt trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học và cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức quí báu trong suốt thời gian em học tập và thực hiện khóa luận. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cô Huỳnh Ngọc Oanh đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn giáo viên phản biện đã giành thời gian quí báu của mình để đọc nội dung luận văn. Em xin chân thành cảm ơn ba mẹ và bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin gởi đến tất cả quý Thầy, Cô, gia đình và các bạn sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất. ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG viii CHƯƠNG 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích đề tài 1 1.3. Nội dung thực hiện 1 CHƯƠNG 2 2.1. Enzyme cellulase 3 2.1.1. Giới thiệu, phân loại, nguồn gốc 3 2.1.2. Cơ chất cellulose 4 2.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase 5 2.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis 7 2.2.1. Đặc điểm chung 7 2.2.2. Cellulase được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis 8 2.3. Sản xuất enzyme nhờ VSV 9 2.3.1. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật 10 2.3.2. Phương pháp lên men vi sinh vật thu nhận enzyme hòa tan 12 2.3.3. Thiết bị lên men (Fermenter New Brunswick Co. Bioflo 110) 13 2.4. Enzyme cố định 16 2.4.1. Định nghĩa 16 2.4.2. Ưu điểm của enzyme cố định 16 2.4.3. Các phương pháp cố định enzyme 17 2.5. Phương pháp tạo liên kết chéo 17 2.5.1. Giới thiệu glutaraldehyde 18 iii 2.5.2. Phương pháp cross-linked enzyme aggregate (CLEA) 18 2.6. Một số ví dụ về cố định celluase 20 CHƯƠNG 3 1 3.1. Vật liệu và hóa chất 21 3.2. Một số phương pháp chung 22 3.2.1. Phưong pháp xác định hàm lượng protein 22 3.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 22 3.2.3. Phương pháp tính toán 23 3.3. Cách tiến hành thí nghiệm 24 3.3.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 25 3.3.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp 26 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp 30 3.4. Khảo sát quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA 31 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất 31 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 32 3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ cố định đến hiệu suất cố định 33 CHƯƠNG 4 4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 35 4.1.1. Quan sát vi sinh vật 35 4.1.2 Định tính khả năng sinh tổng hợp cellulase của Bacillus subtilis 36 4.1.3 Khảo sát đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis 37 4.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp 38 4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 38 4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng CMC đến khả năng 39 4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 40 4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase . 41 4.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 42 iv 4.4. Khảo sát quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA 43 4.4.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định 43 4.4.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định đến sự cố định Cellusoft 45 4.4.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định Cellusoft 46 4.5. Khảo sát khả năng tái sử dụng của Cellusoft cố định dạng CLEA 48 CHƯƠNG 5 5.1. Kết luận 50 5.2. Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 52 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CLEA : Cross-linked enzyme aggregate CMC : Carboxymetyl-cellulose glu : Glutaraldehyde E : Enzyme HL : Hàm lượng HS : Hiệu suất HĐ : Hoạt độ cđ : Cố định dd : Dung dịch bđ : Ban đầu cl : Còn lại UI : Đơn vị hoạt độ (của enzyme) ∑ : Tổng số vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cellulase hoạt động trên bề mặt cellulose 3 Hình 2.2. Ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose 4 Hình 2.3. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose 4 Hình 2.4. Cấu trúc vi sợi 5 Hình 2.5. Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson 5 Hình 2.7. Trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme cellulase 8 Hình 2.8. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh sạch enzyme 9 Hình 2.9. Cơ chế điều hòa trấn áp sinh tổng hợp enzyme bởi sản phẩm 10 Hình 2.10. Cơ chế điều hòa cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 11 Hình 2.11. Một số thiết bị lên men của New Brunswick Co. 13 Hình 2.12. Hệ thống Fermenter Bioflo 110 (New Brunswich Co., Inc., NJ, Mỹ) 15 Hình 2.13. Thiết kế headplate 15 Hình 2.14. Sơ đồ phân loại các phương pháp cố định enzyme 17 Hình 2.15. Cấu tạo hóa học của glutaraldehyde 18 Hình 2.16. Mô hình 3D của phân tử glutaraldehyde 18 Hình 2.17. Phương pháp CLEA 19 Hình 2.19. Phản ứng giữa poly(glutaraldehyde) với amin của protein 19 Hình 2.18. Phản ứng polyme hóa glutaraldehyde 19 Hình 3.1. Sơ đồ các bước nghiên cứu chung 24 Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 26 Hình 3.4. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả năng 27 Hình 3.5. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH lên men đến khả năng tổng hợp 28 Hình 3.6. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp 29 Hình 3.7 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase 30 Hình 3.8. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất 31 Hình 3.9 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất cố định enzyme 32 vii Hình 3.10. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định enzyme 33 Hình 3.11. Sơ đồ khảo sát khả năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA 34 Hình 4.1. Nhuộm Gram Bacillus subtilis và quan sát dưới kính hiển vi (x100) 35 Hình 4.2. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis sau hai ngày cấy trãi 35 Hình 4.3. Vòng thủy phân biểu hiện hoạt tính cellulase 36 Hình 4.4. Kết quả điện di 36 Hình 4.5. Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng vi khuẩn Bacillus subtilis theo 37 Hình 4.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng 38 Hình 4.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả năng tổng hợp 39 Hình 4.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả năng tổng hợp 40 Hình 4.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp . 41 Hình 4.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng 42 Hình 4.11. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng tổng …42 Hình 4.12. Khảo sát nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định Cellusoft 43 Hinh 4.13. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định 44 Hình 4.14. Khảo sát thời gian cố định Celusoft 45 Hình 4.15. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 45 Hình 4.16. Khảo sát nhiệt độ cố định Cellusoft 46 Hình 4.17. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định Cellusoft 47 Hình 4.18. Đồ thị biểu diễn hiệu năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng 48 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Tên và nguồn gốc cellulase từ Bacillus subtilis 8 Bảng 2.2. Thuộc tính enzyme cellulase từ Bacillus subtilis 8 Bảng 4.1. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 38 Bảng 4.2. Biểu diễn ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả năng tổng hợp cellulase 40 Bảng 4.3. Biểu diễn ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả năng tổng hợp 41 Bảng 4.4. Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp 41 Bảng 4.5. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 42 Bảng 4.6. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất cố định 44 Bảng 4.7. Biểu diễn ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 45 Bảng 4.8. Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định 46 Bảng 4.9. Biểu diễn hiệu năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA 48 CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU [...]... sinh tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau Vi sinh vật giống Nhân giống Sản xuất chế phẩm enzyme Lên men bề mặt Sản xuất VSV cố định Lên men chìm Thu nhận chế phẩm enzyme thô Ứng dụng lên men Ứng dụng Tinh sạch enzyme Thu nhận enzyme tinh khiết Sản xuất enzyme không hòa tan Ứng dụng Ứng dụng Hình 2.8 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất và kỹ thu t tinh sạch enzyme [2] 9 Tổng quan tài liệu 2.3.1... nhiều phát minh và máy móc hiện đại, từ đó các hệ thống lên men fermenter với khả năng hữu ích lần lượt ra đời Việc áp dụng những thiết bị công nghệ cao cũng là một phần thiết yếu giúp nâng cao hiệu năng và hiệu suất của quá trình sản xuất enzyme Việc áp dụng những kỹ thu t và thiết bị lên men hiện đại, những phương thức cố định enzyme tiên tiến để sản xuất chế phẩm enzyme hữu ích, đa dụng là hướng đi... dụng môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (bán rắn) [2] Phương pháp lên men chìm: là phương pháp ở đó VSV phát triển hẳn trong lòng môi trường [2] Phương pháp này được sử dụng trong nghiên cứu của đề tài Phương pháp lên men chìm có những ưu điểm cơ bản sau:  Phương pháp lên men chìm thường cần ít diện tích Quá trình lên men thường được thực hiện trong các thiết bị lên men Các thiết bị lên men. .. đó Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm Do đó không phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng cao 11 Tổng quan tài liệu 2.3.2 Phương pháp lên men vi sinh vật thu nhận enzyme hòa tan Trong công nghiệp sản xuất enzyme trên thế giới đang tiến hành hai phương pháp: phương pháp lên men bề mặt và phương pháp lên men chìm Phương pháp lên men bề mặt đã được nghiên cứu và phát... hệ thống điều khiển tự động  Phương pháp lên men chìm có thể thực hiện liên tục bằng hệ thống nhiều thiết bị lên men nối tiếp nhau Do đó, việc kiểm soát chất lượng lên men trở nên rất dễ dàng Quá trình lên men chìm có thể thực hiện theo ba phương pháp: lên men theo chu kỳ (batch), lên men theo chu kì có bổ sung (fed-batch) hay lên men liên tục Phương pháp lên men theo chu kì đơn giản, dễ thực hiện,... (trường hợp lên men tảo đơn bào Chlorella Spirulina hay Scenedesmus)  Giúp khuấy đảo môi trường làm tăng quá trình trao đổi chất, quá trình phát triển và quá trình sinh sản  Giúp giải phóng các chất khí được tạo ra từ quá trình trao đổi chất, làm giảm ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men 2.2.4.2 Thiết bị có cánh khuấy Các thiết bị có lắp đặt cánh khuấy đều được ứng dụng trong quá trình lên men hiếu khí... đầu  Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của chủng Bacillus subtilis ở điều kiện erlen  Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến sinh tổng hợp cellulase của chủng Bacillus subtilis ở quy mô fermenter  Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp cross-linked enzyme aggregate  Khảo sát khả năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA 2 CHƯƠNG... tổng hợp enzyme bằng cơ chất cảm ứng phải chú ý hai điểm:  Thứ nhất, muốn thu nhận enzyme cảm ứng nào thì phải cho cơ chất cảm ứng của enzyme đó vào môi trường Ví dụ: muốn thu nhận amylase thì phải cho tinh bột, muốn thu nhận protease thì phải cho protein, muốn thu nhận pectinase thì phải cho pectin, muốn thu nhận cellulase thì phải cho cellulose Tương tự như vậy ta tiến hành thu nhận các enzyme cảm... triển mạnh mẽ trong những năm đầu thế kỉ XX Sau đó, phương pháp lên men chìm được thay thế vào những năm 50-60 của thế kỉ XX Nhưng phương pháp lên men bề mặt lại được phục hồi rất mạnh mẽ từ những năm 1970 đến nay Mỗi phương pháp đều có những thế mạnh và yếu điểm riêng, tùy theo từng mục đích mà ta sẽ chọn phương pháp lên men hiệu quả Phương pháp lên men bề mặt: là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh... 2.11 Một số thiết bị lên men của New Brunswick Co [26] 13 Tổng quan tài liệu 2.3.3.1 Thiết bị có hệ thống thổi khí Thiết bị có hệ thống thổi khí chỉ sử dụng trong các quá trình lên men hiếu khí Hệ thống thổi khí được lắp đặt trong các thiết bị lên men có những tác dụng sau:  Giúp cung cấp oxy trong các trường hợp lên men hiếu khí, đặc biệt là quá trình thu nhận sinh khối (nấm men, nấm sợi hay vi khuẩn) . HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THU T HOÁ HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN VÀ ÁP DỤNG KỸ THU T CLEA ĐỂ THU NHẬN ENZYME CELLULASE CBHD: . năng và hiệu suất của quá trình sản xuất enzyme. Việc áp dụng những kỹ thu t và thiết bị lên men hiện đại, những phương thức cố định enzyme tiên tiến để sản xuất chế phẩm enzyme hữu ích, đa dụng. xuất và kỹ thu t tinh sạch enzyme [2] Lên men chìm Sản xuất enzyme không hòa tan Ứng dụng Ứng dụng Sản xuất VSV cố đ ị nh Ứng dụng lên men Nhân giống Vi sinh vật giống Lên men bề