iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến tận tình của quý thầy cô trƣờng Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh. Trƣớc hết em xin cảm ơn đến quý thầy cô trƣờng Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh đặc biệt các thầy cô thuộc bộ môn Công nghiệ sinh học đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng và tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện và hoàn thành luận văn. Em xin giửi lời biết ơn sâu sắc đến thạc sĩ Hoàng Mỹ Dung đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp HC06BSH đã luôn sát cánh giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng và quá trình làm luận văn. Cuối cùng xin cảm ơn gia đình yêu quý luôn bên cạnh, theo sát từng bƣớc đi trong quá trình học tập và trƣởng thành của em. Mặc dù em đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn. iv TÓM TẮT Enzyme cellulase đƣợc ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, thực phẩm, thức ăn gia súc, các ngành công nghiệp giấy, bột giấy. Nấm Trichoderma reesei đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong việc sản xuất enzyme cellulase. Việc nghiên cứu cải tiến giống nguyên thủy là một bƣớc quan trọng trong mọi quy trình lên men. Sự cải tiến có thể đạt đƣợc bằng cách tạo đột biến, lựa chọn hoặc tái tổ hợp gen. Đề tài “Khảo sát khả năng sản xuất cellulase ở một số chủng Trichoderma reesei sau xử lý đột biến” cũng nhằm mục đích nghiên cứu cải tiến giống nguyên thủy bằng phƣơng pháp đột biến gen. Chủng Trichoderma reesei đƣợc xử lý đột biến bằng tác nhân vật lý là tia UV và vi sóng. Sau khi sàng lọc và khảo sát hoạt tính CMCase, bƣớc đầu đã khẳng định tạo đƣợc chủng T3 có hoạt tính CMCase cao hơn chủng nguyên thủy. v MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG ix MỞ ĐẦU x CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1 1.1. Giới thiệu enzyme cellulase 1 1.1.1. Phân loại và danh pháp quốc tế 1 1.1.2. Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase 3 1.1.3.1. Giới thiệu cellulose cơ chất của cellulase 3 1.1.3.2. Cấu tạo cellulose 4 1.1.3.3. Tính chất chung của cellulose 5 1.1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase 6 1.2. Giới thiệu chung về nấm mốc Trichoderma reesei 7 1.2.1. Vị trí phân loại 7 1.2.2 Nguồn gốc 7 1.2.3. Đặc điểm hình thái 7 1.2.4. Đặc điểm sinh lý 8 1.3. Giới thiệu các phƣơng pháp xử lý đột biến 11 1.3.1. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân hóa học 11 1.3.2. Phƣơng pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lý 12 1.3.3. Gây đột biến bằng tác nhân sinh học 12 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên liệu 15 2.1.1. Giống vi sinh vật 15 2.1.2. Thành phần môi trƣờng 15 2.1.3. Hóa chất sử dụng 15 2.1.4. Dụng cụ và thiết bị 16 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 16 vi 2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 16 2.2.1.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và giữ giống 16 2.2.1.2. Phƣơng pháp gieo cấy nấm mốc 16 2.2.1.3. Phƣơng pháp xác định số tế bào vi sinh vật 17 2.2.1.4. Phƣơng pháp trải đĩa 17 2.2.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính CMCase 18 2.3. Phƣơng pháp thiết kế thí nghiệm 20 2.3.1. Tạo chủng đột biến Trichoderma reesei 21 2.3.1.1. Xử lý đột biến bằng tia UV 21 2.3.1.2. Xử lý đột biến bằng microwave 22 2.3.2. Khảo sát khả năng phân giải cellulose 22 2.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc 23 2.3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của trên môi trƣờng bán rắn các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 24 3.1. Xử lý đột biến 24 3.1.1. Xử lý đột biến bằng tia UV 24 3.1.1.1. Tỷ lệ sống sót sau khi xử lý đột biến bằng tia UV 24 3.1.1.2. Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV. 25 3.1.2. Xử lý đột biến bằng microwave 25 3.1.2.1. Tỷ lệ sống sót sau khi xử lý đột biến bằng microwave 25 3.1.2.2. Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave 26 3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng Trichoderma reesei thu nhận đƣợc 27 3.3. Kiểm tra tính ổn định của chủng đột biến 31 vii 3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase của chủng đột biến trên môi trƣờng bán rắn 33 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian của cellulase 2 Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc cellulase 3 Hình 1.3: Cấu tạo phân tử D-glucose 4 Hình 1.4: Liên kết β-1,4 glucozit giữa các gốc glucose 4 Hình 1.5: Hình ảnh 3D hợp chất cao phân tử cellulose 5 Hình 1.6: Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 6 Hình 1.7: Sơ đồ cơ chế hoạt động của cellulase 7 Hình 1.8: Trichoderma reesei dƣới kính hiển vi 8 Hình 1.9: Tính đối kháng với nấm bệnh của Trichoderma reesei 9 Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm 21 Đồ thị 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV 25 Đồ thị 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave . ……………………………………………………………………………………… 26 Hình 3.1: Đƣờng kính vòng phân giải của chủng T3 và Tc 27 Đồ thị 3.3: Lƣợng sinh khối thu đƣợc sau 7 ngày nuôi cấy 28 Hình 3.2: Dịch enzyme thô thu đƣợc khi nuôi trên môi trƣờng lỏng 29 Đồ thị 3.4: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng 31 Hình 3.3: Canh trƣờng lên men sau 2 ngày 31 Hình 3.3: Dịch enzyme thô thu đƣợc từ môi trƣờng lên men bán rắn 33 Hình 3.4: Sự phát triển cuả Trichoderma reesei môi trƣờng bán rắn sau 2 ngày lên men. 33 Đồ thị 3.5: Hoạt tính CMCase của Tc, T3 trên môi trƣờng bán rắn 34 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Bảng phân loại cellulase 1 Bảng 1.2: Tác động của việc xử lý đột biến lên sự phát triển của chủng nấm 13 Bảng 1.3: Một số chủng đột biến Trichoderma reesei 14 Bảng 2.1: Môi trƣờng sử dụng 15 Bảng 2.2: Dụng cụ và thiết bị 16 Bảng 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV 24 Bảng 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave………… 26 Bảng 3.3: Kết quả thu sinh khối lên men lần 1 (mg/ml) 28 Bảng 3.4: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng (UI/g) 30 Bảng 3.5: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 4 32 Bảng 3.6: Hoạt tính CMCase của Trichoderma reesei thế hệ thứ 9 32 Bảng 3.7: Hoạt tính CMCase (UI/g) của Tc, T3 trên môi trƣờng bán rắn 34 x MỞ ĐẦU Trichoderma reesei là loài nấm mốc đã có lịch sử lâu đời trong nền công nghiệp sản xuất enzyme. Các ứng dụng của enzyme cellulase, xylanlase sản xuất bởi enzyme này đƣợc tìm thấy trong thực phẩm, thức ăn gia súc, dệt may, dƣợc phẩm và các ngành công nghiệp giấy và bột giấy. Nấm Trichoderma reesei không gây bệnh cho ngƣời. Trong những năm gần đây các kỹ thuật di truyền cũng đã đƣợc sử dụng để cải thiện các chủng sản xuất công nghiệp của nấm Trichoderma reesei và ngoài ra nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng an toàn chủng tái tổ hợp Trichoderma reesei đã đƣợc tích lũy. Vì vậy T. reesei có thể đƣợc coi không chỉ là một sinh vật sản xuất an toàn enzyme tự nhiên của nó mà còn là chủng an toàn cho sản xuất các gen vô hại khác. Khóa luận nhằm mục đích tạo đƣợc chủng Trichoderma reesei đột biến có khả năng sản xuất enzyme cellulase cao hơn chủng gốc. Chƣơng 1: Tổng quan 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu enzyme cellulase Trong thiên nhiên enzyme cellulase nằm trong một phức hệ các enzyme hemicellulase, pentozanase và có một tên chung là xitolase. Enzyme này đƣợc vi sinh vật tổng hợp đặc biệt là nấm mốc sản sinh hệ enzyme có hoạt lực cao. Cho tới nay ngƣời ta vẫn chƣa tách đƣợc riêng cellulase ra khỏi hệ enzyme để sản xuất theo quy mô công nghiệp. Đây là một loại enzyme có ý nghĩa thực tiễn rất lớn trong công nghiệp rƣợu bia và các thức uống lên men từ dịch chiết trái cây, trong công nghiệp sản xuất thức ăn cho gia súc và một hƣớng sử dụng mới trong xử lý rác thải, phế phụ liệu nông nghiệp. 1.1.1. Phân loại và danh pháp quốc tế Bảng 1.1: Bảng phân loại cellulase [17, 8] Cellulase Cơ chất Cơ chế Sản phẩm Endo-cellulase: E.C.3.2.1.4: CAS 9012-54-8 Cellulose kết tinh Cellulose vô định hình Cắt liên kết giữa các chuỗi cellulose Chuỗi đơn cellulose Exo-cellulase (cellobiohydrolase): E.C.3.2.191: CAS 37329-65-0 Chuỗi đơn cellulose Cellulose kết tinh Cắt liên kết nội chuỗi (1 vị trí cắt sau 2-4 glucose) Tetrasaccharides, disaccharides Cellobiase: E.C.3.2.1.21: CAS 9001-22-3 Tetrasaccharides, disaccharides Cắt liên kết glycoside giữa 2 glucose Monosaccharide Ban đầu enzyme cellulase đƣợc phân chia thành 2 loại dựa trên khả năng phân hủy cellulose của enzyme: endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiohydrolase (EC Chƣơng 1: Tổng quan 2 3.2.1.91). Trong đó, cellobiohydrolase có khả năng phân hủy mạnh cellulose kết tinh so với endoglucanase [20]. Tuy nhiên hiện nay tồn tại một hệ thống phân loại cellulase thành 3 nhóm theo cơ chế xúc tác của enzyme [17]. 1.1.2. Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian Hình 1.1: Cấu tạo hóa học và cấu trúc không gian của cellulase [26] Cellulase có bản chất là protein đƣợc cấu tạo từ các đơn vị axit amin bởi liên kết peptit –CO-NH, tuy nhiên trong cấu trúc có gắn kết những phần phụ khác. Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhƣng đƣợc gắn thêm vùng glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose. Vùng gắn kết cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thƣờng –CO-NH- của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hƣởng đến hoạt tính xúc tác của ezyme. Trung tâm xúc tác là vị trí diễn ra hoạt động phản ứng xúc tác tạo phản ứng. Thông thƣờng cellulose chứa duy nhất 1 trung tâm xúc tác, ngoại trừ một số trƣờng hợp đặc biệt. Trung tâm tạo liên kết với cellulose tạo liên kết bền vững với cellulose. Đơn vị chức năng này giữ vai trò chủ đạo trong quá trình định hƣớng cơ chất là cellulose đến trung tâm xúc tác của cellulase. Bên cạnh đó, một số cellulose cũng tham gia vào quá trình xúc tác bằng cách cắt những chuỗi cellulose liên kết dạng tinh thể. Một số khác lại có xu hƣớng liên kết với cellulose vô định hình thay vì cellulose dạng tinh thể [4]. [...]... xạ Kết quả tỷ lệ sống sót thể hiện qua đồ thị 3.1: 24 Chƣơng 3: Kết quả Tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến bằng 120 tia UV Tỷ lệ sống 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 Thời gian (phút) Đồ thị 3.1: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV 3.1.1.2 Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng tia UV Từ kết quả tỷ lệ sống sót thu đƣợc,... 275mm, năng lƣợng tối đa 1,6 Kw, tần số 2450 MHZ Dịch bào tử sau khi xử lý đƣợc pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3… sau đó đƣợc trải trên môi trƣờng thạch đĩa PGA, nuôi ở nhiệt độ phòng sau 48h để kiểm tra khả năng sống sót 2.3.2 Khảo sát khả năng phân giải cellulose Các trƣờng hợp xử lý đột biến có tỷ lệ sống sót nhỏ hơn so với mẫu đối chứng (không xử lý) ... 10.71% Ở thời gian chiếu xạ 30s tỷ lệ sống chỉ còn 1.8% Các bào tử sống sót sau khi chiếu xạ 30s đƣợc chọn để xác định khả năng phân giải cellulose 26 Chƣơng 3: Kết quả 3.1.2.2 Xác định khả năng phân giải cellulose của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave Từ kết quả tỷ lệ sống sót thu đƣợc ở trên, chọn trƣờng hợp chiếu xạ 30s (T30) để tiếp tục khảo sát khả năng phân giải cellulose Sau. .. Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave Kết quả thí nghiệm cho thấy tỷ lệ sống sót tỷ lệ nghịch với thời gian chiếu xạ Tác động gây chết của bức xạ vi sóng càng lớn chứng tỏ ảnh hƣởng của nó lên bộ gen nấm lớn, do đó khả năng gây đột biến trên bộ gen của Trichoderma reesei cao Vi sóng tác động rất lớn đến khả năng sống của Trichoderma reesei, chiếu xạ 10s tỷ lệ sống sót... hàm lƣợng sinh khối MT3 Khảo sát tính ổn định Khảo sát hoạt tính CMCase MT2, MT3 MT4 Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm 2.3.1 Tạo chủng đột biến Trichoderma reesei 2.3.1.1 Xử lý đột biến bằng tia UV Mục tiêu của thí nghiệm là tạo đƣợc giống có khả năng tổng hợp enzyme cellulase cao Chủng nấm Trichoderma reesei đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch nghiêng 7 ngày, cho 10ml nƣớc muối sinh lý vô trùng vào ống nghiệm... tính CMCase qua các thế hệ Chủng đột biến sau đó đƣợc khảo sát hoạt tính trên môi trƣờng bán rắn để so sánh khả năng sản xuất cellulase giữa hai môi trƣờng Qúa trình thí nghiệm đƣợc tóm tắt dƣới sơ đồ 3.1 20 Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu Chủng T reesei Hoạt hóa giống MT PGA Thu dịch huyền phù Xử lý đột biến Tia UV Microwave Xác định tỷ lệ sống sót Xác định khả năng phân giải cellulose... base Biến đổi cấu trúc, mất plasmid Thay thế base, gãy đoạn Mất đoạn, nhân đôi, sự chèn vào Cao Cao Cao Tác nhân intercalating 10 Ethydium bromide, Thấp acrydinedys Sinh học 11 Phage, plasmid, đảo đoạn DNA 13 cao Chƣơng 1: Tổng quan Một số chủng đột biến Trichoderma reesei sản xuất enzyme cellulase cao đã đƣợc nghiên cứu: Bảng 1.3: Một số chủng đột biến Trichoderma reesei [16,18, 24] Chủng gốc – xuất Chủng. .. máy đo mật độ quang ở các thời gian khác nhau ở bƣớc sóng 260nm: 0, 10, 15, 17, 20, 30, 40 (phút) Dịch bào tử sau khi xử lý đƣợc pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý vô trùng ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3… sau đó đƣợc trải trên môi trƣờng thạch đĩa PGA, nuôi ở nhiệt độ phòng sau 48h để kiểm tra khả năng sống sót 2.3.1.2 Xử lý đột biến bằng microwave Chủng nấm Trichoderma reesei đƣợc nuôi trên... Chƣơng 3: Kết quả môi trƣờng PGA, sau 3 ngày đếm số lƣợng khuẩn lạc tạo thành có kết quả nhƣ bảng 3.2 Bảng 3.2: Tỷ lệ sống sót của Trichoderma reesei sau xử lý đột biến bằng microwave Thờigian (s) (%) 10 15 20 30 100% Tỷ lệ sống sót 0 10.71 7.14 4.46 1.8 Kết quả tỷ lệ sống sót bằng microwave thể hiện qua đồ thị sau: Tỷ lệ sống sót sau xử lý đột biến bằng microwave Tỷ lệ sống (%) 120 100 80 60 40 20 0... học, y học Đột biến gây bởi kỹ thuật phân tử là đột biến có tính chọn lọc, hiệu quả cao nhƣng đòi hỏi máy móc, trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật cao Để nâng cao khả năng sản xuất cellulase, ngƣời ta dựa vào hệ gen quy định sản xuất cellulase có sẵn trong Trichoderma reesei, tăng số bản sao gen biểu hiện và chèn promotor mạnh vào gen đó Có thể tóm tắt các tác nhân gây đột biến, các đột biến mà nó . đột biến bằng microwave 22 2.3.2. Khảo sát khả năng phân giải cellulose 22 2.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng Trichoderma. thể đạt đƣợc bằng cách tạo đột biến, lựa chọn hoặc tái tổ hợp gen. Đề tài Khảo sát khả năng sản xuất cellulase ở một số chủng Trichoderma reesei sau xử lý đột biến” cũng nhằm mục đích nghiên. 3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase của chủng đột biến trên môi trƣờng bán rắn 33 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO