TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TIỀN XỬ LÝ LÕI BẮP BẰNG ENZYME TRONG SẢN XUẤT BIOETHANOL CBHD: PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG SVTH: TRẦN THỊ THU MSSV: 60604394 i Lời cảm ơn Luận văn tốt nghiệp “Khảo sát tiền xử lý lõi bắp bằng enzyme trong sản xuất bioethanol” đƣợc thực hiện từ tháng 9 -2011 đến tháng 1 – 2011. Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ nhiệt tình và quan tâm từ PGS. TS. Nguyễn Đức Lƣợng. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy - thầy đã gợi ý đề tài cũng nhƣ hƣớng dẫn tôi tận tình các vấn đề có liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất bioethanol. Và tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho tôi những kiến thức làm nền tảng để tôi có thể thực hiện tốt luận văn này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè, các bạn lớp HC06BSH đã giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi trong quá trình làm luận văn này. ii Tóm tắt luận văn Lõi bắp là một loại nguyên liệu tiềm năng trong sản xuất bioethanol. Luận văn đã tiến hành khảo sát tối ƣu trong quá trình tiền xử lý lõi bắp và đƣờng hóa bằng enzyme. Phƣơng pháp tối ƣu sử dụng quy hoạch thực nghiệm cấu trúc có tâm (CCD) tìm điều kiện tối ƣu để nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium tiền xử lý lõi bắp với ba yếu tố khảo sát là nồng độ glucose, (NH 4 ) 2 SO 4 , MnSO 4 .H 2 O và thu đƣợc kết quả lần lƣợt là 4, 0.08, 0.2 g/l. Thời gian tiền xử lý là khá dài, 14 ngày. Kết quả thí nghiệm cho thấy, lõi bắp sau tiền xử lý 10 ngày với Phanerochaete chrysosporium, đƣợc đƣờng hóa bằng enzyme viscozyme cho kết quả tốt hơn sử dụng enzyme bán tinh khiết thu nhận từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger. Sau 24 h đƣờng hóa ở 50 o C, 5% cơ chất (5 g lõi bắp khan trong 100 ml đệm citrate 0.05M, pH 4.8), 10% enzyme viscozyme (ml/g cơ chất) thu đƣợc lƣợng đƣờng tổng là 4.9 g/l, trong khi sử dụng 12% enzyme bán tinh khiết (g enzyme bán tinh khiết/g cơ chất) chỉ thu đƣợc 3.5 g/l. Hiệu suất chuyển hóa rất thấp, chỉ 16% (g đƣờng/ g cellulose và hemicellulose) khi sử dụng enzyme viscozyme làm tác nhân phản ứng. iii Mục lục Lời cảm ơn i Tóm tắt luận văn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Nội dung và mục tiêu của đề tài 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN 4 2.1. Bioethanol 4 2.1.1. Ưu nhược điểm của nhiên liệu bioethanol 4 2.1.2. Tình hình sản xuất và sử dụng bioethanol trên thế giới và Việt Nam 5 2.1.3. Tình hình sản xuất bioethanol từ chất thải công nông nghiệp 6 2.1.4. Phương pháp sản xuất bioethanol 8 2.1.4.1. Phương pháp truyền thống - đường hóa và lên men riêng rẽ (SHF) 8 2.1.4.2. Phương pháp đường hóa và lên men đồng thời (SSF) 8 2.1.4.3. Phương pháp đồng đường hóa và đồng lên men (SSCF) 9 2.1.4.4. Phương pháp chuyển hóa trực tiếp 9 2.1.4.5. Khí hóa và lên men 9 2.1.4.6. Lên men, ester hóa và hydro hóa 9 2.2. Lõi bắp 10 2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng quá trình đƣờng hóa vật liệu lignocellulose 11 2.3.1. Phương pháp tiền xử lý sinh học 12 2.3.1.1. Ảnh hưởng của lignin và hemicellulose lên quá trình đường hóa 12 2.3.1.2. Các phương pháp tiền xử lý vật liệu lignocellulose 12 2.3.1.3. Phương pháp tiền xử lý sinh học 16 2.3.2. Ảnh hưởng nhiệt độ, pH 17 2.3.3. Ảnh hưởng nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất 17 2.3.4. Ảnh hưởng của chất kìm hãm 19 2.3.5. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 19 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng quá trình lên men 20 2.4.1. Nhiệt độ, pH 20 2.4.2. Nồng độ đường, các thành phần dinh dưỡng khác, và các độc tố 20 2.4.3. Thời gian 21 iv 2.4.4. Nồng độ CO 2 21 2.4.5. Nồng độ giống 21 2.5. Trichoderma reesei và Aspergillus niger 22 2.6. Phanerochaete chrysosporium 22 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1. Vật liệu 24 3.1.1. Giống vi sinh vật 24 3.1.2. Lõi bắp 24 3.1.3. Enzyme 24 3.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật và môi trường sản xuất cellulases 24 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 24 3.2.1. Sản xuất enzyme cellulases từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger 24 3.2.2. Phương pháp tủa enzyme 25 3.2.3. Khảo sát thời gian tiền xử lý 25 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng nguồn C, N, Mn trong quá trình tiền xử lý lõi bắp bằng Phanerochaete chrysosporium theo mô hình CCD 26 3.2.5. Khảo sát tỉ lệ giống Phanerochaete chrysosporium 27 3.2.6. Khảo sát tỉ lệ enzyme 27 3.2.7. Khảo sát tỉ lệ enzyme bán tinh khiết 28 3.2.8. Khảo sát tỉ lệ cơ chất 28 3.3. Phƣơng pháp phân tích 28 3.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính cellulases 28 3.3.2. Phương pháp xác định đường tổng số hòa tan 31 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 4.1. Khảo sát thời gian tiền xử lý 33 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng nguồn C, N, Mn trong quá trình tiền xử lý lõi bắp bằng Phanerochaete chrysosporium theo mô hình CCD 36 4.3. Khảo sát tỉ lệ giống Phanerochaete chrysosporium 41 4.4. Khảo sát tỉ lệ enzyme viscozyme 43 4.5. Khảo sát tỉ lệ enzyme bán tinh khiết 45 4.6. Khảo sát tỉ lệ cơ chất 47 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 56 v Danh mục bảng Bảng 1.1: Khả năng sản xuất ethanol từ một vài loại lignocellulose 2 Bảng 2.1: Các dạng bioethanol đƣợc sử dụng phổ biến 6 Bảng 2.2: Nguồn sản xuất ethanol 7 Bảng 2.3: Hàm lƣợng cellulose, hemicellulose, lignin trong một số nguyên liệu lignocellulose 8 Bảng 2.4: Các phƣơng pháp tiền xử lý lignocellulose 14 Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng bổ sung khi lên men bán rắn lõi bắp 26 Bảng 3.2: Tƣơng quan giữa giá trị dạng mã hóa và dạng tự nhiên của các yếu tố trong phƣơng án thực nghiệm trực giao cấp hai. 27 Bảng 4.1: Kết quả tiền xử lý lõi bắp với nấm mục trắng theo thời gian 34 Bảng 4.2: Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo phƣơng án trực giao cấp hai 37 Bảng 4.3: Kết quả R 2 tính toán từ phần mềm Design expert 37 Bảng 4.4: Phƣơng trình hồi quy biểu diễn hàm lƣợng đƣờng thu nhận đƣợc 37 Bảng 4.5: Phân tích ANOVA kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy trong mô hình quy hoạch thực nghiệm thu nhận đƣợc 38 Bảng 4.6: Một số điều kiện tối ƣu dự đoán cho hàm mục tiêu Y đạt cực trị 38 Bảng 4.7: Ma trận quy hoạch thực nghiệm theo thực nghiệm yếu tố toàn phần 39 Bảng 4.8: Kết quả R 2 tính toán từ phần mềm Design expert 39 Bảng 4.9: Phƣơng trình hồi quy biểu diễn hàm lƣợng đƣờng thu nhận đƣợc 40 Bảng 4.10: Phân tích ANOVA kiểm định ý nghĩa các hệ số hồi quy trong mô hình quy hoạch thực nghiệm thu nhận đƣợc 40 Bảng 4.11: Một số điều kiện tối ƣu dự đoán cho hàm mục tiêu Y đạt cực trị 41 Bảng 4.12: Kết quả khảo sát tỉ lệ giống ảnh hƣởng đến quá trình tiền xử lý và đƣờng hóa 41 Bảng 4.13: Kết quả khảo sát tỉ lệ enzyme trong quá trình đƣờng hóa lõi bắp 43 Bảng 4.14: Kết quả xác định hoạt tính enzyme đƣợc thể hiện ở bảng sau. 45 Bảng 4.15: Kết quả đƣờng hóa lõi bắp bằng enzyme bán tinh khiết 45 Bảng 4.16: Kết quả khảo sát tỉ lệ cơ chất trong quá trình đƣờng hóa lõi bắp 47 vi Danh mục hình Hình 4.1: Lõi bắp tiền xử lý với Phanerochaete chrysosporium 33 Hình 4.2: Đồ thị khảo sát thời gian tiền xử lý lõi bắp với nấm mục trắng. 35 Hình 4.3: Đồ thị khảo sát tỉ lệ giống 42 Hình 4.4: Đồ thị khảo sát tỉ lệ enzyme 44 Hình 4.5: Enzyme tủa trong cồn 45 Hình 4.6: Đồ thị khảo sát tỉ lệ enzyme bán tinh khiết 46 Hình 4.7: Đồ thị khảo sát tỉ lệ cơ chất 48 Chương 1: Mở đầu Trang 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hàng triệu năm trƣớc, carbon khí quyển đƣợc thực vật giữ lại nhờ quang tự dƣỡng, và qua thời gian đƣợc chuyển hóa thành dầu thô và than đá. Tuy nhiên vì sự phát triển kinh tế, chúng ta đã sử dụng quá nhiều nguồn năng lƣợng này dẫn đến lƣợng CO 2 thải ra khí quyển tăng cao từ ~280 lên đến ~380 ppm so với 150 năm trƣớc (Mehdi Dashtban và cs, 2009). Điều này gây ra hiện tƣợng ấm lên toàn cầu, con ngƣời phải đối mặt với sự thay đổi khí hậu với những diễn biến bất thƣờng. Nhu cầu tiêu thụ năng lƣợng càng tăng, trong khi nguồn nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, đứng trƣớc tác động môi trƣờng và vấn đề an ninh quốc gia, nhiều nƣớc đã đẩy mạnh nghiên cứu phát triển và sử dụng nhiên liệu sinh học. Dựa vào tính toán của Hội Đồng Năng Lƣợng Thế Giới (WEC), tiêu thụ năng lƣợng toàn cầu xấp xỉ 12 tỉ tấn than đá một năm. Sự tính toán của Liên Hiệp Quốc (UN) cho thấy dân số thế giới tăng lên 10 tỉ ngƣời vào 2050 dẫn đến nhu cầu năng lƣợng tăng lên tối thiểu 24 tỉ tấn than đá một năm (gấp hai lần hiện nay) phụ thuộc vào sự phát triển kinh tế, xã hội và chính trị (Mehdi Dashtban và cs, 2009). Ở Brazil, ethanol đƣợc sản xuất từ đƣờng mía, trong khi ở Mỹ tinh bột (từ bắp) thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất ethanol. Sử dụng đƣờng hay tinh bột làm nguyên liệu chính sản xuất ethanol gây nên sự tranh cãi do ảnh hƣởng sản xuất và giá cả thực phẩm, giảm tính cạnh tranh của ethanol với nhiên liệu hóa thạch. Điều này dẫn đến thế hệ nhiên liệu sinh học mới sử dụng nguồn nguyên liệu mới (bảng 1.1). Công ty Iogen của Canada (http://www.iogen.ca/) dẫn đầu thế giới sản xuất bioethanol từ lignocellulose, sử dụng 30 tấn/ngày rơm rạ lúa mì, lúa mạch, yến mạch để sản xuất 0.52 triệu gallon ethanol một năm. Chương 1: Mở đầu Trang 2 Bảng 1.1: Khả năng sản xuất ethanol từ một vài loại lignocellulose (Mehdi Dashtban và cs, 2009) Chất thải lignocellulose Sản xuất 1 năm Khả năng sản xuất ethanol (tỉ lít/năm) Chất thải nông nghiệp thế giới Ngàn tỉ g/năm Corn stover 203.62 58.6 Rơm rạ lúa mạch 58.45 18.1 Rơm rạ yến mạch 10.62 2.78 Rơm rạ lúa gạo 731.34 204.6 Rơm rạ lúa mì 354.35 103.8 Rơm rạ sorghum 10.32 2.79 Bã mía 180.73 51.3 Tổng 1549.42 442.0 Chất thải rắn đô thị triệu tấn Mỹ (2001) 208 13.7 Trung Quốc (1998) 127 8.3 Canada (2002) 30.5 2 (Corn stover bao gồm lá, thân, lõi bắp) Nƣớc ta có truyền thống sản xuất nông nghiệp lâu đời, hàng năm tạo ra hàng trăm tấn phế phẩm nông nghiệp. Đây là nguồn nguyên liệu rẻ, khối lƣợng lớn, có tiềm năng sản xuất nhiên liệu và khi sử dụng nguyên liệu này cũng góp phần giảm ô nhiễm môi trƣờng do đốt hay thải bỏ. Bắp là cây lƣơng thực phổ biến ở nƣớc ta và các loại phế phẩm của cây bắp (thân, lá, lõi bắp) vẫn chƣa đƣợc tận dụng triệt để. Đặc biệt là lƣợng lõi bắp rất lớn sau khi tách lấy hạt bắp chƣa có giải pháp sử dụng hợp lý (sản lƣợng bắp hàng năm trên thế giới hơn 600 triệu tấn, mà cứ mỗi 100 Kg hạt bắp thu đƣợc, tạo ra khoảng 18 Kg lõi bắp) (Jared Bourke, 2006). Từ thực trạng trên, chúng tôi thực hiện khảo sát khả năng ứng dụng lõi bắp sản xuất bioethanol nhiên liệu. 1.2. Nội dung và mục tiêu của đề tài Các mục tiêu chính của đề tài:  Khảo sát quá trình tiền xử lý lõi bắp bằng nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium. Chương 1: Mở đầu Trang 3  Khảo sát quá trình đƣờng hóa lõi bắp sau tiền xử lý bằng enzyme viscozyme và chế phẩm enzyme bán tinh khiết thu nhận từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger. Các nghiên cứu chính cần thực hiện để đạt đƣợc mục tiêu trên: Quá trình tiền xử lý:  Khảo sát thời gian tiền xử lý  Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ C, N, Mn trong quá trình tiền xử lý lõi bắp bởi Phanerochaete chrysosporium.  Khảo sát tỉ lệ giống Phanerochaete chrysosporium. Quá trình đường hóa  Khảo sát tỉ lệ enzyme viscozyme.  Khảo sát tỉ lệ chế phẩm enzyme bán tinh khiết.  Khảo sát tỉ lệ cơ chất thích hợp. [...]... đƣờng hóa lõi bắp đã xử lý, nồng độ nguyên liệu là 5% (5g lõi bắp khan trong 100 ml đệm citrate 0.05M pH 4.8) và nồng độ enzyme là 10% Điều kiện tiến hành ở 50oC Sau 24h đƣờng hóa, lấy mẫu ly tâm 12000 rpm/20 phút và phân tích hàm lƣợng đƣờng trong dịch đƣờng hóa bằng phƣơng pháp xác đinh nồng độ đƣờng tổng số hòa tan (1) 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nguồn C, N, Mn trong quá trình tiền xử lý lõi bắp bằng Phanerochaete... lên men là 10 ngày Lõi bắp sau tiền xử lý 10 ngày với Phanerochaete chrysosporium, đƣợc đƣờng hóa bằng enzyme viscozyme Thực hiện tƣơng tự (1) xác định lƣợng đƣờng trong mỗi thí nghiệm 3.2.6 Khảo sát tỉ lệ enzyme Lõi bắp sau tiền xử lý 10 ngày với Phanerochaete chrysosporium (môi trƣờng dinh dƣỡng bổ sung và tỉ lệ giống cấy lấy kết quả từ hai thí nghiệm trên), đƣợc đƣờng hóa bằng enzyme viscozyme Thực... tủa chứa enzyme bán tinh khiết Sấy enzyme bán tinh khiết trong tủ sấy chân không ở 40oC, 1.5 ngày, và tủ hút ẩm 1.5 ngày để bảo quản enzyme Độ ẩm cuối enzyme bán tinh khiết < 15% 3.2.3 Khảo sát thời gian tiền xử lý Quá trình tiền xử lý lõi bắp với nấm mục trắng nhằm làm tăng vùng vô định hình của cellulose, giảm sự bao bọc của lignin, hemicellulose với cellulose giúp tăng khả năng tiếp cận enzyme với... lõi bắp đã xử lý, tỷ lệ enzyme bán tinh khiết (g enzyme bán tinh khiết / khối lượng nguyên liệu) thay đổi lần lƣợt là 2, 4, 8 và 12% Điều kiện tiến hành ở 50oC và tỷ lệ nguyên liệu 5% (5 g lõi bắp khan trong 100 ml dd đệm citrate 0.05M pH 4.8) trong 24 giờ Thực hiện tƣơng tự (1) xác định lƣợng đƣờng trong mỗi thí nghiệm 3.2.8 Khảo sát tỉ lệ cơ chất Thực hiện đƣờng hóa 7 mẫu nguyên liệu lõi bắp đã xử. .. về nguồn năng lƣợng dầu Sản xuất ethanol trên toàn thế giới đạt 32x109 lit (2007), với Hoa Kỳ và Brazil là những nhà sản xuất chủ lực (~70%) Gần đây Hoa Kỳ đã qua mặt Brazil để trở thành nhà sản xuất bioethanol lớn nhất thế giới Năm 2009, Hoa Kỳ đã sản xuất 39.5x109 lit ethanol sử dụng bắp làm nguyên liệu (ethanol thế hệ thứ nhất) trong khi nhà sản xuất thứ 2, Brazil chỉ sản xuất 30x109 lit ethanol... chi phí thấp và không hình thành chất ức chế nhƣ trong quá trình nổ hơi và nổ amoni khi xử lý bã mía (Badal C Saha, 2004) Phƣơng pháp tiền xử lý sinh học: yêu cầu điều kiện sinh trƣởng cho vi sinh vật, không gian và thời gian tiền xử lý Bảng 2.4 cho thấy ƣu nhƣợc điểm của các phƣơng pháp tiền xử lý vật liệu lignocellulose Bảng 2.4: Các phƣơng pháp tiền xử lý lignocellulose (Mohammad J Taherzadeh và Keikhosro... đƣợc 2 mol bioethanol Năng lƣợng để tạo ra mol bioethanol thứ ba đƣợc cung cấp bởi hydro đƣợc tạo ra từ quá trình khí hóa biomass (Hans P.Blaschek, Thaddeus C Ezeji) 2.2 Lõi bắp Lõi bắp khá cứng bao gồm rất nhiều loại mô khác nhau Mặt cắt của lõi bắp thể hiện các tế bào nhu mô ở phần lõi mềm ngay ở tâm của lõi bắp Bên ngoài của lõi là vùng tế bào sclerenchyma cứng (Jared Bourke, 2006) Lõi bắp là một... hóa chất  Điều kiện ôn hòa  Tốc độ xử lý chậm  Không ứng dụng thƣơng mại Trang 15 Chương 2: Tổng quan Hướng phát triển trong tương lai của quá trình tiền xử lý i) Giảm sử dụng hóa chất để không gây hại môi trƣờng ii) Tận dụng những loại sản phẩm phụ của quá trình để tăng tính kinh tế cho quá trình sản xuất bioethanol iii) Tận dụng hemicellulose cho sản xuất bioethanol và sử dụng lignin làm nhiên... nguyên liệu lõi Trang 27 Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu bắp đã xử lý, tỷ lệ viscozyme (ml viscozyme/ khối lượng nguyên liệu) thay đổi lần lƣợt là 5, 6, 7, 8, 9, 10 và 12% Điều kiện tiến hành ở 50oC và tỷ lệ nguyên liệu 5% (5 g lõi bắp khan trong 100 ml dd đệm citrate 0.05M pH 4.8) trong 24 giờ Thực hiện tƣơng tự (1) xác định lƣợng đƣờng trong mỗi thí nghiệm 3.2.7 Khảo sát tỉ lệ enzyme bán... vào enzyme mà còn phụ thuộc vào đặc điểm, tính chất hóa lý vật liệu Hiện nay mặc dù ngành công nghiệp enzyme đã sản xuất ra sản phẩm enzyme rẻ hơn, chịu nhiệt, khả Trang 11 Chương 2: Tổng quan năng xúc tác và liên kết cơ chất tốt hơn nhƣng để cải thiện hiệu suất đƣờng hóa cần có phƣơng pháp tiền xử lý cơ chất hiệu quả 2.3.1 Phương pháp tiền xử lý sinh học 2.3.1.1 Ảnh hưởng của lignin và hemicellulose . trên: Quá trình tiền xử lý:  Khảo sát thời gian tiền xử lý  Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ C, N, Mn trong quá trình tiền xử lý lõi bắp bởi Phanerochaete chrysosporium.  Khảo sát tỉ lệ giống. 33 4.1. Khảo sát thời gian tiền xử lý 33 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng nguồn C, N, Mn trong quá trình tiền xử lý lõi bắp bằng Phanerochaete chrysosporium theo mô hình CCD 36 4.3. Khảo sát tỉ lệ. enzyme 25 3.2.3. Khảo sát thời gian tiền xử lý 25 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng nguồn C, N, Mn trong quá trình tiền xử lý lõi bắp bằng Phanerochaete chrysosporium theo mô hình CCD 26 3.2.5. Khảo