1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 2 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUỐC TUẤN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG FLAVONOID TRONG NỤ VÀ LÁ VỐI Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHƢƠNG THIỆN THƢƠNG Hà Nội – 2012 3 Mục lục Trang MỞ ĐẦU………………………….……….…………… …………………….…1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN………… …………….……………………….… 3 1.1 Tổng quan cây vối………………………….….…………………………… 3 1.1.1 Tên gọi …………………………… ……………………………………3 1.1.2 Đặc điểm thực vật……………………………………………… ………3 1.1.3 Phân bố, sinh thái………………………………………………….…… 3 1.1.4 Thu hái và chế biến………………………………………… ………….4 1.1.5 Thành phần hóa học…………………………………………… ……….5 1.1.6 Flavonoid trong cây vối………………………………………………….7 1.1.7 Tác dụng sinh học……………………………… …………………….13 1.1.8 Ứng dụng………………………………………… ………………… 16 1.2 Các phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid …………………… …17 1.2.1 Phƣơng pháp định tính………………………………………….………17 1.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng……………………………….……………….20 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………………………………………26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………… ……………….26 2.2 Nội dung nghiên cứu ………………………………………… ………… 27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………… …………….27 2.3.1 Chiết xuất, phân lập flavonoid chính………….……………………… 27 2.3.2 Xác định cấu trúc chất phân lập………………………………….…… 28 2.4 Xây dựng phƣơng pháp định tính trong nụ và lá vối………………… … 28 2.4.1 Định tính bằng phƣơng pháp hóa học…………………….…………….28 4 2.4.2 Định tính bằng phƣơng pháp sắc ký……………………… ………… 28 2.5 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối…….…….30 2.5.1 Định lƣợng flavonoid toàn phần bằng phƣơng pháp trắc quang…….…30 2.5.2 Định lƣợng flavonoid chính bằng phƣơng pháp HPLC……….… 30 2.6 Một số đặc trƣng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả…… ……………31 2.7 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất, dung môi……………………………………32 2.7.1 Thiết bị, dụng cụ……………………………………………………… 32 2.7.2 Hóa chất, dung môi…………………………………………………… 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………… 33 3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ cây vối……………… 33 3.1.1 Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn… ………………………………….33 3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat…………….34 3.1.3 Xác định cấu trúc chất phân lập……………… ………………………37 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối…… …… 41 3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học……………………… …………….41 3.2.2 Định tính bằng TLC……………………………………… ………… 42 3.2.3 Định tính bằng HPLC…………………………………………… ……46 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối………… 48 3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang……………… …………… 48 3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng CO-1 bằng HPLC……… ………61 KẾT LUẬN……………………………….………………………………… …74 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 76 PHỤ LỤC 5 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các thành phần chính trong tinh dầu vối ……………………… 6 Bảng 1.2. Thành phần flavonoid trong nụ vối………………………………. 8 Bảng 1.3. Một số hệ dung môi khai triển để phân tích flavonoid bằng TLC 19 Bảng 2.1. Bảng chi tiết mẫu nụ và lá vối……………………………………. 26 Bảng 3.1. Kết quả định tính sơ bộ flavonoid ở cao H và cao E…………… 35 Bảng 3.2. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CO-1………… 40 Bảng 3.3. Kết quả SKLM cao phân đoạn ETOAC…………………………. 46 Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại của phƣơng pháp trắc quang………………… 49 Bảng 3.5. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn theo chất đối chiếu CO-1………. 50 Bảng 3.6. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn theo chất Catechin……………… 51 Bảng 3.7. Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng…………… 52 Bảng 3.8. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất chuẩn CO-1… 53 Bảng 3.9. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất Catechin…… 53 Bảng 3.10. Kết quả xác định độ đúng của phƣơng pháp………………… 54 Bảng 3.11A. Kết quả đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp theo cách 1… 55 Bảng 3.11B. Kết quả đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp theoc cách 2 56 6 Bảng 3.12. Kết quả xác định flavonoid toàn…………………………….… 58 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát pha động …………………………………… 62 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống……………… … 63 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính…………………………… 64 Bảng 3.16. Giá trị hệ số b i …………………………………………… …… 65 Bảng 3.17. Các đại lƣợng thống kê……………………………………….… 65 Bảng 3.18A. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu CO-1 66 Bảng 3.18B. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp bằng mẫu thực… 66 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đứng của phƣơng pháp……………………. 67 Bảng 3.20. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD……………………… 69 Bảng 3.21. Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL……………………… 69 Bảng 3.22. Kết quả đánh giá sai số của phƣơng pháp………………………. 71 Bảng 3.23. Kết quả định lƣợng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối… 72 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1. Hình ảnh cây vối……………………… ………………………… 4 Hình 1.2. Sắc ký đồ hai chất và các thông số đặc trƣng…………….……….23 Hình 3.1. Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối……………… 37 Hình 3.2. Sắc ký đồ HPLC chất CO-1………………………………… … 37 Hình 3.3. Phổ tử ngoại UV chất CO-1……………………………………….38 Hình 3.4. Công thức cấu tạo chất CO-1………………………………….… 41 Hình 3.5A. Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối…………….….44 Hình 3.5B. Sắc ký đồ định tính flavonoid trong cao ETOAC……………….45 Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối………………….48 Hình 3.7. Đƣờng chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1……… …50 Hình 3.8. Đƣờng chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo Catechin……….51 Hình 3.9. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1…………… …53 Hình 3.10. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của Catechin………… 54 Hình 3.11. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng CO-1 trong nụ và lá vối…… 64 Hình 3.12. Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD…………………………… 69 Hình 3.13. Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL………………………….70 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn cao nụ vối……………………… 34 Sơ đồ 3.2: Quy trình định lƣợng flavonoid toàn phần ……………………….57 8 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTPT : Công thức phân tử EtOAC : Ethyl acetat EtOH : Ethanol KLPT : Khối lƣợng phân tử MeOH : Methanol SKLM : Sắc ký lớp mỏng R f : Hệ số lƣu UV : Ultra violet IR : Infrared Spectroscopy MS : Mass Spectroscopy NMR : Cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) TLC : Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) SD : Độ lệch chuẩn (Standard deviation) RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition) LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ : Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation) LOL : Giới hạn tuyến tính (Limit of Linearity) 9 MỞ ĐẦU Cây Vối, một loại cây quen thuộc của làng quê các tỉnh Đồng Bằng bắc bộ, có tên khoa học là Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr. et Perry thuộc họ Sim (Myrtaceae). Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng lá và nụ vối với cách chế biến đơn giản tạo thành loại trà nấu hay hãm lấy nƣớc uống hàng ngày vừa có tác dụng thanh nhiệt vừa có tác dụng kiện tỳ, tiêu thực. Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cây Vối. Thành phần hóa học chính của lá và nụ Vối gồm tinh dầu, triterpenoid và flavonoid. Theo Trung học dƣợc từ hải I (1993), tinh dầu lá vối có 27 thành phần. Vỏ cây chứa một chất triterpen nhóm ursan đã đƣợc nhận dạng là acid ursolic. Nụ vối có nhiều thành phần hóa học đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc hóa học, chủ yếu là các flavonoid. Thành phần hóa học chính trong nụ vối là flavonoid, với khoảng hơn 20 flavonoid khác nhau. Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn có cấu trúc hóa học C 6 -C 3 -C 6 , thƣờng gặp nhiều trong thực vật. Đến nay, số lƣợng flavonoid từ thực vật đã đƣợc tìm thấy lên tới trên 8150 flavonoid khác nhau. Các flavonoid có nhiều tác dụng sinh học quý nhƣ chống ung thƣ, chống dị ứng, chống co giật, giảm đau, nghẽn mạch, nghẽn phế quản, lợi mật, diệt nấm Do đó, chúng đƣợc dùng nhiều trong các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, thực phẩm, và mỹ phẩm, phục vụ lợi ích của con ngƣời. Các flavonoid của lá và nụ vối cũng đã đƣợc chứng minh có nhiều tác dụng sinh học quan trọng nhƣ chống oxy hóa, chống ung thƣ, ức chế một số enzym (xanthin oxydase, α-glucosidase, maltase, acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase). Đặc biệt, một số chất một hợp chất có tác dụng đối với ung thƣ nhƣ 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone, 3,5',3'- trihydroxy-6,7,4'-trimethoxy flavon; 3,3'-dihydroxy-5,6,7,4'-tetramethoxy 10 flavon. Do đƣợc sử dụng nhiều để làm trà uống và làm thuốc trong y học dân gian nên cần thiết phải có tiêu chuẩn cho nguyên liệu lá và nụ vối. Trong dự thảo Dƣợc Điển Việt Nam V (dự kiến xuất bản năm 2013-2014) đã có chuyên luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chƣa có tiêu chí về định tính và định lƣợng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng quan sinh học trọng. Với thực trạng trên, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối”. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu nụ và lá vối phục vụ việc quản lý chất lƣợng dƣợc liệu trên thị trƣờng. Các mục tiêu của đề tài gồm có: • Phân lập đƣợc một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lƣợng flavonoid. • Xây dựng đƣợc quy trình định tính và định lƣợng flavonoid trong dƣợc liệu nụ và lá vối. [...]... acid cinamic [3, 4, 17, 21, 33] 1.1.6 Flavonoid trong cõy Vi Flavonoid l mt nhúm hp cht t nhiờn ln thng gp trong thc vt V cu trỳc húa hc flavonoid cú khung c bn theo kiu C6-C3-C6 (cú 2 vũng benzen A v B ni vi nhau qua mt mch 3 carbon) v c chia lm nhiu nhúm khỏc nhau [16] ó cú nhiu nh khoa hc trong v ngoi nc nghiờn cu v thnh phn húa hc ca cõy vi u ch ra rng flavonoid trong lỏ v n vi cú th dng t do hoc... K: pha loóng ca mu th Hm lng flavonoid ton phn (F%) trong dc liu c tớnh bng cụng thc F(%) = Q(%) x 2,51 2,51: H s chuyn i t flavonol sang flavonol glycosid (flavonoid) Lui Alberto Lia SOARES v cỏc cng s cng ó da trờn phn ng to mu ca flavonoid vi AlCl3 2% v em o hp th quang bc súng 428 nm Xỏc nh c tng hm lng ca flavonoid trong cõy Dip h chõu [38] Hm lng tng flavonoid trong Tabernaemontana heyneana... chit cui cựng ht phn ng ca flavonoid (khụng cho phn ng vi thuc th cyanidin) Cụ dch chit methanol di ỏp sut gim n cn Hũa tan cn trong 100 ml nc ct núng, ngui Lc nhiu ln vi ethyl acetat cho n kit flavonoid Ct thu hi dung mụi c cn, sy 800C n khi lng khụng i, cõn Hm lng flavonoid ton phn trong dc liu c tớnh theo cụng thc sau: [flavonoid] tp(%) = m x100% a.(100% x%) m: khi lng cn flavonoid thu c (g) a: Khi... liu trong cỏc ti liu tham kho 2.4 Xõy dng phng phỏp nh tớnh flavonoid trong n v lỏ vi 2.4.1 nh tớnh bng phng phỏp húa hc nh tớnh flavonoid chớnh bng cỏc phn ng húa hc thụng thng [6] + Phn ng vi hi amoniac + Phn ng cyanidin + Phn ng vi FeCl3 5% + Phn ng vi kim loóng 2.4.2 nh tớnh bng phng phỏp sc ký Dựng cỏc phng phỏp sc ký: Sc ký bn mng (TLC), sc ký lng hiu nng cao (HPLC) nh tớnh nhúm cht flavonoid trong. .. y hc gi l bnh thiu vitamin P (Pavitaminose) Flavonoid c dựng trong cỏc trng hp ri lon chc nng tnh mch, tnh mch suy yu, gión tnh mch, tr, chy mỏu do t vũng trong ph khoa, cỏc bnh trong nhón khoa nh sung huyt kt mc, ri lon tun hon vừng mc Cỏc dn cht anthocyanozid cú tỏc dng tỏi to t bo vừng mc v ó c chng minh cú tỏc dng tng th lc vo ban ờm Tỏc dng chng c ca flavonoid th hin lm gim thng tn gan, bo v c... thng dựng lỏ ti phi khụ [4,10] N vi c thu hỏi, phi khụ dựng pha nc v lm thuc [4, 10] 1.1.5 Thnh phn húa hc Lỏ Vi cha rt ớt tanin, vt alcaloid (nhúm indolic) v tinh du, tinh du lỏ gm nhiu thnh phn trong ú thnh phn chớnh l (Z)--ocimen, myrcen, (E)--ocimen [3, 4, 17] Trong lỏ vi cú cha flavonoid, coumarin, tanin, acid hu c, ng t do v sterol V cõy cha triterpen nhúm ursan l acid usolic [3] N vi cha nhiu flavonoid. .. [28] b) Tỏc dng ca cỏc flavonoid trong lỏ v n vi Trc ht, cỏc cht flavonoid l nhng cht oxy húa chm hay ngn chn quỏ trỡnh oxy húa do cỏc gc t do, cú th l nguyờn nhõn lm cho t bo hot ng khỏc thng Cỏc gc t do sinh ra trong quỏ trỡnh trao i cht thng l cỏc gc t do nh OH, ROO, R, O2-, (l cỏc yu t gõy bin d, hy hoi t bo, ung th, tng nhanh s lóo húa,) Thớ nghim cho thy kh nng dp tt ca mt s flavonoid theo th t:... chng oxy húa ca n vi trong ng nghim v trờn chut tiu ng [14] Vi kt qu ca nghiờn cho thy bt chit tỏch t n vi cú kh nng trit tiờu gc t do l rt mnh vi giỏ tr IC50 nh nht l 22,9 mg/ml V cú hiu qu chng oxy húa, c ch peroxy húa lipid trờn chut ỏi thỏo ng [14] Byung Sun Min cựng vi cỏc cng s ó tỏch c 7 flavonoid (trỡnh by trong bng 1.2) trong n vi c thu hỏi Vit Nam v chng minh ch ra rng cỏc flavonoid u cú tỏc... Nm 2005, L Tao v cng s Trng i Hc Khoa Hc v Cụng Ngh Trung Quc ó dựng HPLC xõy dng c phng phỏp phõn tớch cỏc flavonoid (Galangin v 3-O-methyl Galangin) trong thõn r cõy Ring Vi cỏc iu kin nh sau: S dng ct tỏch ZORBAX, Eclipe SB-C18, pha ng c dựng l MeOH-H2O-H3PO4 vi t l 60:38:2 (v:v:v) Ra ri theo phng phỏp ng dũng vi tc 0,8 ml/phỳt Cỏc flavonoid c phỏt ti bc súng 254 nm, nhit ct tỏch 400C vi th tớch... Nguyờn 23/04/2012 7,85 34 2.2 Ni dung nghiờn cu - Phõn lp mt flavonoid chớnh t n vi Tinh ch hot cht t tinh khit cn thit cho vic nh tớnh, nh lng - Xõy dng phng phỏp nh tớnh flavonoid t lỏ v n vi - Xõy dng phng phỏp nh lng mt flavonoid chớnh t lỏ v n vi 2.3 Phng phỏp nghiờn cu 2.3.1 Chit xut, phõn lp flavonoid chớnh Chit xut: chit c nhúm cht cha trong i tng nghiờn cu, phi xõy dng c cỏc quy trỡnh chit xut . một flavonoid chính trong nụ vối dùng làm chất đối chiếu trong việc định tính, định lƣợng flavonoid. • Xây dựng đƣợc quy trình định tính và định lƣợng flavonoid trong dƣợc liệu nụ và lá vối. . đề tài Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng flavonoid trong nụ và lá vối . Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn và kiểm tra chất lƣợng dƣợc liệu nụ và lá vối phục. chuyên luận về lá và nụ vối. Tuy nhiên, trong các chuyên luận này chƣa có tiêu chí về định tính và định lƣợng flavonoid trong nụ vối, trong khi flavonoid là thành phần chính và có nhiều tác dụng