Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC - 2014 i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN . Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2014 Tác giả luận văn Nguy ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi đ . - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tậ . . . - - . Tác giả luận văn iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro…………… 22 Bảng 2.2. Thành phần đệm tách DNA tổng số………………………. 25 26 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen CPi 26 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CPi 27 Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá………………………… 31 9-1………………………………………………… 33 iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. ấu trúc hệ gen của SMV 9 Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi 11 in vitro - ……………………………………… 29 3.2. Các mảnh lá đƣợc ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens , mảnh lá sau khi rửa khuẩn đƣợc cấy trên môi trƣờng chọn lọc và các cụm chồi đƣợc tạo thành sau hai tuần nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc…………………………………… 31 , chồi màu xanh đƣợc tách ra trên môi trƣờng chọn lọc và chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trƣờng tạo rễ………… ………………………………… 33 0 …………………………………………………………. 34 Hình 3.5. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ các dòng thuốc lá chuyển gen…………………………………………………………… 35 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc pK7GW-SMV-CPi trong các cây thuốc lá chuyển gen 36 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine BGMV Bean Golden Mosaic Virus bp Base pair (cặp base) CP Coat protein (protein vỏ) cs Cộng sự ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid DNA Deoxyribo Nucleic Acid GA3 Gibberellic acid GM Môi trƣờng tạo chồi hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ RISC RNA-inducing silencing complex RM Môi trƣờng ra rễ RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference dsRNA Double Stranded ribinucleic acid mRNA Messenger siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus TMV Tobacco Mosaic Virus Ti- plasmid Plasmid tạo khối u Vir Virulence Region YEP Yeast extract peptone vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Trang LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………. i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT v MỤC LỤC vii MỞ ĐẦU…………………………………………………………… 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… 3 1.1. BỆNH KHẢM DO SMV TRÊN CÂY ĐẬU TƢƠNG…… 3 …… 3 1.1.2. Bệnh khảm do virus trên cây đậu tƣơng 7 …………………… 8 1.2. KỸ THUẬT RNAi 10 1.2.1. Cơ chế ức chế gen của RNAi 10 1.2.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo cây trồng chuyển gen kháng virus 12 1.3. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ 13 1.3.1. Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens…………………………………… 13 16 18 viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 20 2.1.1. Vật liệu 20 2.1.2. Hóa chất 20 2.1.3. Thiết bị 20 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Phƣơng pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens 21 2.2.2. Phƣơng pháp lây nhiễm và tạo cây thuôc lá chuyển gen 21 2.2.3. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen pK7GW-SMV- CPi bằng phƣơng pháp PCR……………………………… 24 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 in vitro …………………………………………… 28 3.2. Kết quả chuyển cấu trúc pK7GW-SMV-CPi vào thuốc lá 29 3.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 35 …………………………………… 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 40 [...]... trong cây chuyển gen và kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây Nhiều giống cây trồng kháng đƣợc các loại bệnh virus khác nhau đã đƣợc tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV vào giống thuốc lá C9-1 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng virus 2 Mục tiêu nghiên cứu Chuyển. .. chuyển gen kháng virus 2 Mục tiêu nghiên cứu Chuyển đƣợc cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV vào giống thuốc lá C9-1 và tạo đƣợc cây chuyển gen 3 Nội dung nghiên cứu (1) Lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tái tổ hợp vào mảnh lá của giống thuốc lá C9-1; (2) Tái sinh và tạo cây thuốc lá ; (3) Phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –... nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus [8] các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên 1.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY THUỐC LÁ Chuyển gen là biện pháp công nghệ đƣợc ứng dụng để tạo dòng thuốc lá kháng virus Do hệ thống tái sinh cây. .. loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để đƣợc công nhận là giống cây trồng thƣơng mại nhƣ: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển. .. (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus) Năm 2007, Bonfim và cs đã tạo ra đƣợc một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93% Lim và cs (2007) nghiên cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tƣơng đã nhận thấy rằng, cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV... phân tử mRNA Dựa vào hoạt động của cơ chế RNAi, có thể tiến hành thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng ức chế hoạt động của gen ngoại lai, nhằm tạo giống cây chuyển gen kháng bệnh virus Vector mang gen là đoạn cDNA có nguồn gốc từ RNA của virus Chúng đƣợc đƣa vào tế bào vật chủ để khi virus xâm nhiễm, các đoạn cDNA này sẽ bắt cặp bổ sung và cắt phân tử mRNA của virus thành những... hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và đã chuyển đƣợc gen CP mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống C9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ T0 SMV [11 [29 tƣơng [12] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 20 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1 Vật liệu Giống thuốc. .. trong lá Gen cryIII cũng đƣợc chuyển vào cây thuốc lá và cây khoai tây để kháng sâu Colorado potato beetle (leptiontarsa deeecemlineata) (perlak và cs, 1993) [30] Gen crylA(b) và cryA(c) cũng đƣợc chuyển vào cây để phòng trừ côn trùng cánh v y (Van der Salm và cs, 1994) 100% sâu xanh chết khi ăn lá của cây thuốc lá đƣợc chuyển gen cry2Aa2,[27] Selvapandian và cs (1998) chuyển gen crylIa5 vào thuốc lá. .. thống tái sinh cây thuốc lá tƣơng đối đơn giản và thời gian Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 14 phân hóa từ mô đến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trên những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thƣờng chọn cây thuốc lá là cây mô hình Vì vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá đã đƣợc tiến hành khá sớm Cây thuốc lá chuyển gen kháng diệt cỏ đƣợc... (green flourescence protein) và các dẫn xuất của nó [5],… 1.3.3 Trung quốc là quốc gia đã thƣơng mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá) , kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying Chang và cs, 1993) Wong và cs (1992) cũng đã tạo đƣợc cây thuốc lá chuyển gen crylA(c) mRNA có độc tố cao gấp 10-20 lần so với cây thuốc lá chuyển gen dùng CaMV35S promoter, hàm lƣợng protein độc . Nghiên cứu chuyển cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV vào giống thuốc lá C9-1 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng virus . 2. Mục tiêu nghiên cứu Chuyển đƣợc cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của. vào giống thuốc lá C9-1 và tạo đƣợc cây chuyển gen . 3. Nội dung nghiên cứu (1) Lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tái tổ hợp vào mảnh lá của giống thuốc lá C9-1; (2) Tái sinh và tạo cây thuốc. vitro …………………………………………… 28 3.2. Kết quả chuyển cấu trúc pK7GW-SMV -CPi vào thuốc lá 29 3.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 35 ……………………………………