Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 1 ĐA ̣ I HO ̣ C QUÔ ́ C GIA HA ̀ NÔ ̣ I TRƯƠ ̀ NG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƯ ̣ NHIÊN TRẦN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH THUỐC KHÁNG SINH HỌ β – LACTAM TRONG CÁC MẪU SINH HỌC VÀ DƯỢC PHẨM LUÂ ̣ N VĂN THA ̣ C SI ̃ KHOA HO ̣ C Hà Nội - 2011 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 3 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1. Tổng quan 2 1.1. Giới thiệu chung về chất kháng sinh 2 1.1.1. Lịch sử ra đời 2 1.1.2. Phân loại 2 1.1.3. Đánh giá tác dụng 2 1.2. Kháng sinh β – Lactam 3 1.2.1. Định nghĩa 3 1.2.2. Cấu trúc và phân loại 3 1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học 7 1.2.4. Tác dụng 7 1.2.5. Điều chế 8 1.2.6. Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 9 1.3. Các phương pháp định lượng β – Lactam 11 1.3.1. Các phương pháp quang học 11 1.3.2. Các phương pháp điện hóa 12 1.3.3. Các phương pháp điện di mao quản 12 1.3.4. Sắc kí bản mỏng 13 1.3.5. Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14 Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 17 2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 17 2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 17 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu – Phương pháp RP- HPLC 18 2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC 18 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 4 2.2.2. Sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC 20 2.2.3. Detector huỳnh quang 22 2.2.4. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 23 2.2.5. Phân tích định lượng bằng HPLC 25 2.3. Kỹ thuật dẫn xuất hóa các β- Lactam với thuốc thử NBD-F 26 2.4. Dụng cụ và hóa chất 28 2.4.1. Máy móc và dụng cụ 28 2.4.2. Hóa chất 28 Chương 3: Kết quả và thảo luận 30 3.1. Khảo sát các điều kiện tạo dẫn xuất giữa β- Lactam và thuốc thử NBD-F 30 3.1.1. Khảo sát nhiệt độ phản ứng dẫn xuất hóa 30 3.1.2. Khảo sát thời gian phản ứng dẫn xuất hóa 33 3.2. Khảo sát các điều kiện chạy sắc ký 36 3.2.1. Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop) 36 3.2.2. Chọn bước sóng của detector 37 3.3. Chọn pha tĩnh 37 3.4. Chọn pha động 38 3.4.1. pH dung dịch đệm 38 3.4.2. Tỉ lệ thành phần pha động 40 3.4.3. Nồng độ đệm acetat của pha động 44 3.4.4. Tốc độ pha động 47 3.5. Đánh giá phương pháp phân tích 50 3.5.1.Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 50 3.5.2.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 54 3.5.3. Độ đu ́ ng của phép đo 55 3.5.4. Độ lặp lại của phép đo 57 3.6. Phân tích mẫu thực 58 3.6.1. Phân tích mẫu dược phẩm 58 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 5 3.6.2. Phân tích mẫu sinh học 63 3.7. Kết quả một số phương pháp khác xác định kháng sinh cùng loại 68 3.8. Hướng phát triển của đề tài 70 KẾT LUẬN 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 79 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 6 DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số Penicillin 4 2 Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số Cephalosporin 5 3 Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu 7 4 Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của S píc vào nhiệt độ phản ứng 32 5 Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của S píc vào thời gian phản ứng 35 6 Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất vào pH pha động 38 7 Bảng 3.4. Sự phụ thuộc k’ vào pH pha động 39 8 Bảng 3.5. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa dung môi hữu cơ và đệm 41 9 Bảng 3.6. Sự phụ thuộc của thời gian lưu vào tỉ lệ giữa ACN và MeOH 43 10 Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của k’ vào tỉ lệ giữa ACN và MeOH 43 11 Bảng 3.8. Thời gian lưu của chất phụ thuộc vào nồng độ đệm 44 12 Bảng 3.9. Diện tích píc chất phân tích tại nồng độ đệm khác nhau 45 13 Bảng 3.10. Thời gian lưu của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 47 14 Bảng 3.11. Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 47 15 Bảng 3.12. Sự phụ thuộc của S pic vào nồng độ chất phân tích 51 16 Bảng 3.13. Các giá trị F tính , F bảng và phương trình đường chuẩn của các kháng sinh β - Lactam 53 17 Bảng 3.14. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các chất chuẩn kháng sinh β - Lactam 55 18 Bảng 3.15. Độ đu ́ ng của phép đo tại nồng độ các chất 0,15ppm 56 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 7 19 Bảng 3.16. Độ đu ́ ng của phép đo tại nồng độ các chất 0,40ppm 56 20 Bảng 3.17. Độ đu ́ ng của phép đo tại nồng độ các chất 0,80ppm 57 21 Bảng 3.18. Khảo sát độ lặp lại của phép đo theo diện tích pic 58 22 Bảng 3.19. Thông tin mẫu thuốc phân tích 59 23 Bảng 3.20. Kết quả độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc 61 24 Bảng 3.21. Kết quả tính nồng độ C x và sự sai khác hàm lượng so với kết quả in trên nhãn thuốc 63 25 Bảng 3.22. Hiệu suất thu hồi của mẫu nước tiểu 64 26 Bảng 3.23. Hiệu suất thu hồi của mẫu máu 66 Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 8 MỞ ĐẦU Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm, đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe con người. Trong y học hiện đại, các β - Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Nhờ các thuốc kháng sinh mà y học có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, thương hàn, và điều trị hiệu quả nhiều bệnh gây ra bởi vi khuẩn. Nhưng, nếu liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị càng khó khăn. Ngoài ra, còn gây lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do vi rút không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh. Đối với những người cao tuổi , lươ ̣ ng dư kha ́ ng sinh trong nư ớc tiểu nhiều, còn gây ra các bệnh về thn . Đồng thời, lươ ̣ ng dư na ̀ y tha ̉ i ra môi trươ ̀ ng se ̃ gây lên như ̃ ng hâ ̣ u qua ̉ vô cu ̀ ng nghiêm tro ̣ ng . Vì vy, kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng. Có rất nhiều phương pháp tách khác nhau. Trong đó, phương pháp tách sắc ký là phương pháp tách chọn lọc có độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít, thời gian phân tích ngắn. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β - Lactam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detector huỳnh quang trong mẫu sinh học và dược phẩm là một hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm của nó ngày càng được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn đề tài là: “Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ β - Lactam trong các mẫu sinh học và dƣợc phẩm ”. Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 9 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Kháng sinh β - Lactam 1.1.1. Định nghĩa Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin. Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). Các cephalosporin tự nhiên được phân lp từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên [1]. 1.1.2. Cấu trúc và phân loại * Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β- Lactam N S CH 3 CH 3 N H O CO R COOM 2 3 4 1 56 7 Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H. Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau [1]. Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 10 Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin Tên kháng sinh R Hoạt tính Nhóm penicillin tự nhiên PenicillinG (PENG) Benzathin CH 2 - Benzyl Gồm các Penicillin tự nhiên và dẫn chất.Phổ hẹp: vi khuẩn gram(+). Không kháng β- lactamase Nhóm penicillin kháng penicilliiase Oxacillin (OXA) N C- O CH 3 6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4- carbonyl)amino] Là các Penicillin bán tổng hợp. Phổ hẹp như nhóm I. Kháng penicilliiase, không tác động vào vòng β – Lactam được. Cloxacillin (CLO) Cl N O C- CH 3 6-{[3-(2-chlorophenyl )-5-methyl- oxazole-4-carbonyl]amino} Nhóm penicillin phổ rộng Ampicillin (AMP) CH- NH2NH2 6-([(2R)-2-amino-2- phenylacetyl]amino) Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-). Không kháng β- lactamase và penicilliiase Amoxicill (AMO) CH- NH2NH2 HO 6-{[(2R)-2-amino-2-(4- hydroxyphenyl)-acetyl]amino} Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 11 * Các cephalosporin Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R N H O CO R1 N S R3 R2 COOM 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5- thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau [1]. Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc của các cephalosporin Kháng sinh R1 R2 R3 I: tác dụng mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+), yếu nhất trên gram (-). Không bền và dễ bị β- lactamase phá hủy Cephalexin (CEP) CH- NH 2 H -CH 3 Cephapirin SCH 2 - H -CH 2 -OCOCH 3 Cephazolin N N N N CH 2 - H N N CH 3 S-CH 2 [...]... tĩnh - Tối ưu hoá pha động: pH, thành phần, tốc độ và các điều kiện khác,… 3 Điều kiện định lượng - Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Độ đúng và độ l p lại của ph p đo Chuyên ngành Hoá Phân tích 23 Luận văn Thạc sĩ 4 Trần Thị Dung Phân tích mẫu thực, đánh giá khả năng p dụng của phương ph p - Phân tích mẫu dược phẩm (mẫu thuốc) - Phân tích mẫu sinh học. .. nghiên cứu các vấn đề sau: 1 Tối ưu hóa các điều kiện để điều chế dẫn xuất giữa các chất phân tích và thuốc thử 7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) - Chọn nhiệt độ của phản ứng dẫn xuất hóa - Chọn thời gian của phản ứng dẫn xuất hóa 2 Tối ưu hóa điều kiện tách bằng phương ph p sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo sử dụng detector huỳnh quang (RP-HPLC) - Chọn bước sóng của detector - Chọn pha... 420nm có giới hạn phát hiện thu được 4.1 0-7 M (0,16 mg/l) Phương ph p này kết h p phương ph p dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh… Theo [30], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng phương ph p phổ h p thụ phân tử Phương ph p cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M Kết quả... 1.2.1 Phương ph p quang học Phương ph p đo quang là phương ph p phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính h p thụ quang, tính phát quang… Các phương ph p này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định lactam, đặc biệt trong dược phẩm Các β -lactam h p thụ UV nhưng không nhiều cực đại h p phụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại gi p nâng cao... chất theo cả hai phương ph p đường chuẩn và thêm chuẩn - Phương ph p đường chuẩn Nguyên tắc của phương ph p này là: pha một dãy mẫu chuẩn của chất phân tích có nồng độ từ Co đến C5 và mẫu phân tích Cx trong cùng một điều kiện phân tích Sau đó tiến hành chạy sắc ký để ghi sắc đồ của dãy mẫu chuẩn và mẫu phân tích Xác định chiều cao H hay diện tíc S của pic sắc ký trong tất cả các mẫu trên rồi tiến... nhất trong quá trình tách phân tích và điều chế các h p chất đang được quan tâm trong các đối tượng sinh học, hoá học, dược học và y học Hệ RP-HPLC có các ưu điểm nổi trội sau: 1 Có độ linh động và độ chọn lọc cao 2 Có khả năng cân bằng cột nhanh, cột có hiệu lực cao, các pic cân đối 3 Pha động là nước hay hỗn h p nước và dung môi hữu cơ thân thiện với môi trường Nói chung, hệ RP-HPLC có độ linh hoạt và. .. (mẫu nước tiểu và mẫu máu) - So sánh với một số phương ph p khác 2.2 Phƣơng ph p nghiên cứu – Phƣơng ph p RP-HPLC 2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng ph p HPLC Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ h p của nhiều quá trình vừa có tính chất hoá học lại vừa có tính chất lý học Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân. .. phân tích thực tế chúng ta phải nghiên cứu, khảo sát chọn pha tĩnh có cỡ hạt, chiều dài cột tách như thế nào để đạt được độ phân giải theo yêu cầu phân tích Thông thường đối với một hỗn h p chất phân tích nhất định, yếu tố quyết định đến hiệu quả tách ở đây là các điều kiện về bản chất của pha tĩnh và thành phần pha động trong hệ HPLC Sắc ký h p phụ pha ngược (RP-HPLC) là phương ph p được dùng phổ biến... hoá, hoá dầu, hoá học h p chất thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh  -lactam bằng phương ph p HPLC Theo [50], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN –... độ nhạy của ph p đo Trong nhiều trường h p, các β -lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích Các phương ph p phát quang có thể dùng xác định các β -lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β -lactam A Fernández-González và cộng sự [17] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm . Các phƣơng ph p phân tích định lƣợng β -lactam 1.2.1. Phương ph p quang học Phương ph p đo quang là phương ph p phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính h p thụ. phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh… Theo [30], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng phương ph p phổ h p thụ phân tử. Phương ph p. phân tích thuốc kháng sinh họ β - Lactam trong các mẫu sinh học và dƣợc phẩm ”. Luận văn Thạc sĩ Trần Thị Dung Chuyên ngành Hoá Phân tích 9 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Kháng sinh β - Lactam