TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  ĐỖ THỊ HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG THÂN RỄ CÂY NGẢI TIÊN BOUSIGON (HEDYCHIUM BOUSIGONIANUM PIERRE EX GAGN) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI − 2012 TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  ĐỖ THỊ HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG THÂN RỄ CÂY NGẢI TIÊN BOUSIGON (HEDYCHIUM BOUSIGONIANUM PIERRE EX GAGN) Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Văn Ngọc Hƣớng HÀ NỘI − 2012 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Khái quát về chi Hedychium 2 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 2 1.1.2. Thành phần hóa học của chi Hedychium 4 1. 1.2.1.Tecpenoid và tinh dầu chi Hedychium 4 1. 1.2.2. Sesquiterpenoid và diterpenoid 8 1.1.2.3. Các hợp chất C 6 – C 3 18 1.1.2.4. Các hợp chất C 6 – C 3 – C 6 19 1.1.2.5. Các hợp chất Steroids 20 1. 1.3. Các hợp chất có hoạt tính sinh học trong chi Hedychium 21 1. 1.4. Tác dụng của các loài thuộc chi Hedychium 23 1.1.4.1. Tác dụng của tinh dầu 23 1.1.4.2. Tác dụng của các chất được chiết từ thân rễ 25 1. 1.5. Tình hình nghiên cứu về chi Hedychium tại Việt Nam 29 1.2. Tổng quan về cây ngải tiên bousigon 30 1.2.1. Xuất xứ 30 1.2.2. Một số đặc điểm thực vật 30 CHƢƠNG 2: ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 31 2.1. Đề tài, mục tiêu và nhiệm vụ 31 2.1.1. Tên đề tài 31 2.1.2. Mục tiêu của đề tài 31 2.1.3. Nhiệm vụ của đề tài 31 2.2. Các phƣơng tiện nghiên cứu 32 2.2.1. Thiết bị nghiên cứu 32 2.2.2. Dụng cụ 32 2.2.3. Các hóa chất 33 2.3. THỰC NGHIỆM 33 2.3.1. Mẫu thực vật và phƣơng pháp xử lí: 33 2.3.2. Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon. 34 2.3.3. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon 34 2.3.4. Chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ ngải tiên bousigon 35 2.3.5. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity) 36 2.3.6. Khảo sát các cặn chiết bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) 36 2.3.7. Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các chất trong các cặn chiết 37 2.3.8. Các hằng số vật lí và các số liệu phổ của các chất thu đƣợc 39 2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc: 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. Đối tƣợng và đề tài nghiên cứu 42 3.2. Nghiên cứu tinh dầu của thân rễ cây ngải tiên bousigon 42 3.2.1. Điều chế tinh dầu 43 3.2.2. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu 43 3.3. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon 45 3.3.1. Chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ ngải tiên bousigon 45 3.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết của thân rễ ngải tiên bousigon 47 3.3.3. Phân lập các hợp chất trong cặn chiết H và C của thân rễ ngải tiên bousigon 48 3.3.3.1. Khảo sát các cặn chiết H và C bằng SKLM. 48 3.3.3.2. Phân lập các chất tinh khiết trong các cặn chiết C và H 49 3.3.4. Xác định cấu trúc phân tử của các chất phân lập đƣợc. 50 3.3.4.1. Xác định cấu tạo phân tử của hợp chất HB3 50 3.3.4.2. Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất HB5 52 3.3.4.3. Xác định cấu trúc phân tử HB7 54 3.3.5. Khảo sát hoạt tính chống ung thƣ của hợp chất HB5 phân lập đƣợc từ thân rễ ngải tiên bousigon. 57 KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng (SKLM, SKBM) EI-MS (Electron Impact-Mass Spectrocopy): Phổ khối lƣợng va chạm điện tử ESI-MS (Electron Sprayionisation-Mass Spectrocopy):Phổ khối lƣợng phun bụi điện tử 1 H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR (Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon - 13 DEPT (Disstortionless Enhancement by Polarition Transfer) HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation) HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ CÁC HÌNH Bảng 1.1: Công thức hóa học các chất đƣợc nhận dạng trong tinh dầu các cây thuộc chi Hedychium Bảng 1.2: Các terpennoid đã đƣợc phân lập từ chi Hedychium. Bảng 3.1: Các thành phần chính của Tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon vùng Vĩnh Phúc Bảng 3.2: So sánh một số thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên SaPa và tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon Vĩnh Phúc. Bảng 3.3 : Hoạt tính kháng VSVKĐ của các sản phẩm của thân rễ ngải tiên bousigon. Bảng 3.4: Kết quả khảo sát cặn H bằng SKLM Bảng 3.5: Kết quả khảo sát cặn C bằng SKLM Bảng 3.6: Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất HB3 Bảng 3.7. Số liệu phổ 1 H& 13 C-NMR của hợp chất HB5 Bảng 3.8: Số liệu phổ 1 H& 13 C-NMR của hợp chất HB7 Bảng 3.9. Hàm lƣợng tế bào ung thƣ sống sót sau khi thử Bảng 3.10. Cƣờng độ gây độc tế bào ung thƣ. Sơ đồ 3.1: Qui trình chiết các hoạt chất sinh học trong thân rễ ngải tiên bousigon. Sơ đồ 3.2. Các phân đoạn phân lập các chất tinh khiết trong cặn H bằng SKLM. Hình 2.1: Thiết bị cất cuốn hơi nƣớc hồi lƣu. Hình 3.1: Công thức cấu tạo HB3. Hình 3.2: Công thức cấu tạo của HB5. Hình 3.3: Cấú tạo của agycon. Hình 3.4 Công thức cấu tạo của HB7 Ảnh 1.1: Thân rễ cây ngải tiên bousigon. 1 LỜI MỞ ĐẦU Nƣớc ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên hệ thực vật vô cùng đa dạng và phong phú đặc biệt là cây có tinh dầu và cây làm thuốc. Theo thống kê bƣớc đầu, nƣớc ta có hơn 600 loài cây có tinh dầu, nhƣng phần lớn chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ, hệ thống và triệt để. Hệ thực vật phong phú và đa dạng của mỗi vùng, mỗi quốc gia đƣợc xem là một trong những nguồn tài nguyên quí giá, có quan hệ trực tiếp tới đời sống con ngƣời. Hóa học các hợp chất thiên nhiên với vai trò nghiên cứu thành phần hóa học và tìm hiểu hoạt tính sinh học của cây thuốc mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây thuốc dân tộc là vấn đề không những hấp dẫn về khoa học mà còn đóng góp cho việc sử dụng cây thuốc có hiệu quả hơn, chính xác hơn. Góp phần phong phú cho hệ thực vật Việt Nam, lại rất gần gũi với đời sống nhân dân phải kể đến họ gừng (Zingiberaceae). Nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ các cây họ gừng làm thuốc và hƣơng liệu trên thế giới và trong nƣớc ngày càng tăng. Các nghiên cứu về các cây họ gừng đến nay là rất nhiều nhƣng nó luôn là điều hấp dẫn với các nhà nghiên cứu. Trong họ gừng có một chi mà ở Việt Nam chƣa đƣợc nghiên cứu rộng rãi đó là chi ngải Hedychium. Trong khi đó thế giới với rất nhiều các nghiên cứu báo cáo rằng đây là một chi rất hấp dẫn bởi hƣơng thơm của hoa và những hợp chất có hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy các  - lacton diterpen ,  không no. Đây là những hợp chất có hoạt tính chống ung thƣ, chống viêm rất mạnh đang đƣợc các nhà khoa học thế giới quan tâm một cách đặc biệt. Với định hƣớng nhƣ vậy chúng tôi đã chọn đề tài: “ Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon (Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ” 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về chi Hedychium 1.1.1 Đặc điểm thực vật học Hedychium (chi ngải) là một chi thuộc họ gừng (Zingiberaceae) gồm những cây lâu năm phổ biến với chiều cao khi phát triển khoảng 120 – 180 cm. Chi này thƣờng đƣợc gọi với cái tên là chi của những cây hoa loa kèn gừng và chi của các loại cây thân thảo, thân rễ mập và phân nhánh. Chi này có nguồn gốc từ những vùng đất nhiệt đới ở Châu Á và dãy Himalaya. Các loài của chi này thƣờng có hoa rất đẹp, rực rỡ và hấp dẫn bởi mùi hƣơng. Tại Nam Á, chi Hedychium đã có hơn 80 loài. Các nghiên cứu gần đây báo cáo có 41 loài ở Ấn Độ, trong đó có 17 loài đặc hữu của Ấn Độ [29]. Ba loài mới của chi Hedychium từ Thái Lan mới đƣợc nhận dạng và phân lập năm 1995 là H. samuiense, H. tomentosum và H. biflorum.[30] Theo cuốn ―Cây cỏ Việt Nam‖ của Phạm Hoàng Hộ thì ở Việt Nam chi Hedychium có 12 loài, phân bố ở hầu hết các tỉnh từ Bắc chí Nam [4] 1) Hedychium coronarium Koen. Thƣờng gọi là ngải tiên. Địa thực vật: Dạng giống gừng, lá thơm, phiến to, không lông, mép cao 2-3 cm. Phát hoa ở chót thân, có nhiều lá hoa xanh, hoa trắng rất thơm. Đài là ống dài; vành có 3 tai hẹp, dài; tiểu nhụy lép dạng cánh hoa to; 1 tiểu nhụy thụ; môi to, 2 thùy. Nang cao 2,5 cm; mảnh vàng; hột đỏ. Phân bố ở Lào Cai, Đà Lạt, Hà Giang. 2) Hedychium coronarium var. flavescens (Lodd.) Hook. Gọi là ngải tiên vàng vàng. Cành ngắn, có sợi; thân cao đến 2m, đáy đo đỏ. Lá có phiến thon dài, mặt trên láng, mặt dƣới có lông; mép cao 3-4 cm. Phát hoa hơi thông; đài có ống có lông; vành có ống dài đến 10 cm; phiến vàng lợt; môi có bớt vàng sẫm. Hoa thơm ngọt, màu vàng. 3) Hedychium coronarium var. flavum K.Schum. Gọi là ngải tiên vàng. 3 Thân cỏ cao, cành ngắn; thân đo đỏ ở dƣới. Lá có phiến thon, chót có đuôi dài 4- 6 cm; mép cao đến 5cm. Phát hoa hình bắp cao đến 15cm, lá hoa có lông ở chót, mang 3 – 4 hoa; hoa vàng; ống vành dài 5 cm, môi to, chẻ ở chót. 4) Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn. Gọi là Ngải tiên Bousigon. Thân cỏ, cao 1-1,2 m. Căn hành to 6 – 7 mm. Lá có phiến thon hẹp, nhọn, dài 30 – 50 cm, rộng 7 cm, không lông. Gié thƣa, dài 20 cm; lá hoa có lông, dài 2,5 cm; hoa to, vàng; tiểu nhụy lép hẹp, dài 4cm; môi xoan, chẻ đến ½; noãn sào có lông. Thƣờng mọc trong rừng ở Đà Lạt. 5) Hedychium coccineum Hamilt. Ngải tiên đỏ. Địa thực vật: cao 1,5 – 2m. Lá có phiến dài 25 – 50 cm, rộng 3- 5 cm, đáy tà, có khi hình tim; mép cao 1- 2,5 cm; hoa đỏ; đài dài 3 cm, cánh hoa 3 cm; môi 2 thùy, noãn sao có lông. Thƣờng mọc ở những nơi đất ẩm lầy, vùng núi cao. 6) Hedychium ellipticum Sm. , Ngải tiên bầu dục. Cỏ cao 1 m. Lá có phiến bầu dục, to 20 – 40 x 10-15 cm, mỏng, có điểm trong; mép nâu, cao 1 cm; bẹ không lông. Phát hoa nghiên, dày, to 12x3-4 cm; lá hoa không lông, cao 3 cm; hoa trắng, cao 8 cm; vành có lông nhung; noãn sào có lông. Mọc ở những nơi triền núi. 7) Hedychium gardnerianum Roscoe. Ngải tiên Gardner. Kanili Ginger, Ginger Lily Địa thực vật: Cao đến 1 m, dạng nhƣ gừng. Lá có phiến bầu dục, không cuống; mép cao. Phát hoa đứng cao; lá hoa xanh, 2x1 cm; đài là 2 vảy; hoa vàng bua; ống hoa dài 5-6 cm; cánh hoa hẹp, dài 3 cm, rộng 3 – 4 mm; tiểu nhụy lép dẹp, vàng tƣơi; môi vàng chanh, xoan có 2 thùy; tiểu nhụy thụ màu cam đậm, chi tía, chứa nuốm ở giữa, lục; noãn sào không lông. Thích hợp với đất cầm thủy: Đà Lạt. 8) Hedychium forresti Diels var. latebracteatum K. Lars. Ngải tiên lá hoa rộng. Địa thực vật: cao 1,2 m, thơm. Lá có phiến thon nhọn, to 40 x 10 cm; mép cao 2,5 – 3 cm; bẹ không lông. Phát hoa cao 15 cm; lá hoa dài 3 -4 cm; hoa vàng tƣơi; môi tam giác, có 2 thùy xoan thon, sống ở những nơi cao 1500 m. 9) Hedychium poilanei K. lars. Ngải tiên Poilane [...]... có hoạt tính sinh học trong chi Hedychium Vì thân rễ các loài hedychium đều có tinh dầu, nên nghiên cứu hoạt chất sinh học của các chất trong thân rễ trƣớc hết là nghiên cứu hoạt tính sinh học của tinh dầu Sabulal và các cộng sự có những bƣớc tiên phong trong vấn đề này Các hoạt động kháng khuẩn của tất cả các loại dầu thân rễ của bốn loài Hedychium từ miền Nam Ấn Độ: Hedychium venustum, Hedychium spicatum... nhau Đối với các loài thuộc chi Ngải (Hedychium) đều có đặc điểm chung là các bộ phận thân rễ và hoa có mùi thơm đặc biệt Vì vậy ngƣời ta chú 4 ý trƣớc tiên là các chất dễ bay hơi, các chất có mùi, đó chính là thành phần của tinh dầu hai bộ phận này Tinh dầu là hỗn hợp của các chất thu đƣợc bằng chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, vì vậy chúng là các chất không phân cực hay kém phân cực, không tan trong nƣớc... đốt [14] Tuy vậy tinh dầu chỉ là một phần nhỏ của thành phần thân rễ các loài Hedychium, vì tinh dầu là phần có nhiệt độ sôi thấp, ít phân cực, hàm lƣợng trong thân rễ không lớn từ 0,1 – 0,3% theo nguyên liệu mẫu tƣơi Vì vậy, ngƣời ta chú ý nghiên cứu các thành phần khác đặc biệt là các  - lacton α, β không no khung 21 labdan diterpen, đó là những hợp chất sinh học nổi tiếng Theo hƣớng này, Sharma... hóa học của chi Hedychium 1 1.2.1.Tecpenoid và tinh dầu của chi Hedychium: Trong thiên nhiên có các loại hợp chất : Terpenoit, Steroit, Flavonoit, ancaloit, cacbohidrat, lipit, protit… Nhƣng không phải loài thực vật nào cũng có chứa đủ các loại trên mà tùy loài thực vật mà hợp chất này là chủ yếu mà lại không có loại hợp chất kia Trong mỗi loại thực vật, các bộ phận khác nhau cũng có thành phần hóa học. .. loại hợp chất chính trong chi ngải, đó là các tecpenoid, steroid, các hợp chất C6 – C3 và các hợp chất C6 – C3 – C6 7 1 1.2.2 Sesquiterpenoid và diterpenoid: Bằng các phƣơng pháp chiết và sắc kí, cho đến nay ngƣời ta đã phân lập đƣợc ba dẫn xuất chứa oxi của sesquiterpen và rất nhiều dẫn xuất chứa oxi của diterpen từ thân rễ chi ngải Các sesquiterpen đều ở dạng mạch thẳng, còn các diterpen đều có nhân... công bố nghiên cứu mới nhất về các hợp chất đƣợc phân lập từ thân rễ ngải tiên ở Sapa – Việt Nam Trong báo cáo này, họ đã phận lập đƣợc ba labdane loại diterpenes mới, đặt tên là coronarins G,H,I và 7 hợp chất đã đƣợc biết đến là: coronarin D, coronarin D methyl ether, hedyforrestin C, (E)-nerolidol, -sitosterol, daucosterol, và stigmasterol Các hợp chất từ cây có tác dụng ức chế sản xuất các cytokine... thể ở mắt Tại Thái Lan, lá luộc đƣợc áp dụng để giảm các khớp cứng và đau Ở khắp nơi, những bông hoa thơm phổ biến trong việc tạo ra vòng hoa và bó hoa cô dâu.[28] 28 1 1.5 Tình hình nghiên cứu về Hedychium tại Việt Nam Về thành phần tinh dầu mới chỉ có một công trình của Nguyễn Thị Thủy và cộng sự nghiên cứu thân rễ cây Ngải tiên Cây Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig) mọc tự nhiên tại huyện Sapa,... nấm Nghiên cứu gần đây cho thấy hợp chất chính trong tinh dầu của Hydechium là 1,8-cineol hoạt động chống lại vi khuẩn Gram(+) và nấm men Candida albicans (Jirovetz et al, 2005) Tóm lại sự có mặt của các thành phần kháng khuẩn hoạt động trong các loại tinh dầu từ Hedychium là phù hợp với việc sử dụng của các bột thân rễ nhƣ một vị 24 thuốc sắc giải nhiệt và thuốc bổ Sự hiện diện của 1,8 – cineole có. .. của các chất được chiết từ thân rễ Gần đây, trên thế giới đã có rất nhiều sự chú ý tập trung vào chi Hedychium để nghiên cứu hoạt động sinh học đa dạng của chúng nhƣ khả năng chống viêm, chống khối u, giảm đau, chống dị ứng, antihelmintic và quan trọng nhất là gây độc tế bào Những cây thuộc chi Hedychium là nguồn giàu sesquiterpenes, diterpenes với khả năng hoạt động rộng trong sinh học và dƣợc học. .. xuất hiện dƣới dạng hỗn hợp epimer [34] 17 1.1.2.3 Các hợp chất C6 – C3: Xuất xứ của dãy các hợp chất C6 – C3 (phenylpropanoid) là axit Shikimic – rất phổ biến trong thiên nhiên nhƣ eugenol, safrol… Do đó việc tìm thấy các hợp chất loại này trong chi ngải cũng là điều dễ hiểu F.N Taveira và cộng sự đã cô lập đƣợc eugenol benzoyl trong cặn Dichloromethane chiết xuất từ thân rễ của Hydechium [34] eugenol . biết các thành phần của tinh dầu 43 3.3. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon 45 3.3.1. Chiết chọn lọc các chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ. dầu thân rễ ngải tiên bousigon. 34 2.3.3. Phân tích và nhận biết các thành phần của tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon 34 2.3.4. Chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ ngải tiên. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  ĐỖ THỊ HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG THÂN RỄ CÂY NGẢI TIÊN BOUSIGON (HEDYCHIUM BOUSIGONIANUM