MỤC LỤC Trang Mỏ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 í PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Họ Cúc và chi Eupatorium 3 1.1.1. Vàì nét về thực vật học và hoá học các cây họ Cức 3 1.1.2. Vài nét về thực vật học và hoá họơ chi Eupatorium 4 1.2. Đại cương về các hợp chất cumarin 10 1.3. Vài nét về các hợp chất thymol 18 1.4. Đại cương về các hợp chất flavonoit 20 1.5. Vài nét về các phương pháp sắc ký đã sử dụng trong nghiên cưủ 27 1.5.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 27 1-5.2. Phương pháp sác ký cột và sắc ký cột nhanh 28 1.5.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao âp 34 PHẦN 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 2.1. Cây Mần tưới tía 37 2.1.1. Vài nét chung về cây Mần tưới tía * 37 2.1.2. Tác dụng sinh học của cây Mần tưới tía 38 2.1.3. Các hợp chất đã được phát hiện trong cây Mần tưới tía 38 2.1.4. Nghiẻn cúm các dản xuất cumarin và thymoquinon trong cây Mần tưới tía Việt Nam 40 2.2. Cây Mần tưới tráng 47 2.2.1. Vài nét chung về cây Mần tưới trắng 48 2.2.2, Tác dụng sinh học của cây Mần tưới trắng 48 2.2.3, Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Mần tưới trắng 49 2.2.4. Nghiên cứu các dẫn xuất axetophenon và thymol trong cây Mần tưới trắng Việt Nam 49 2.3. Cây Cỏ lào 60 2.3.1. Vài nét chung về cây Cỏ lào ỐI 2.3.2. Tác dụng sinh học của cày c ỏ lào 61 2.3.3. Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây c ỏ lào 61 2.3.4. Nghiên cứu các dẫn xuất ĩlaconoit trong cây c ỏ lào Việt Nam 62 PHẨN 3: THỰC NGHIỆM 66 3.1. Các phương pháp tách sắc ký 66 3.1.1. Phương pháp sắck ý lớp mỏng 66 3.1.2. Phương pháp sác ký cột và sác ký cột nhanh 67 3.1.3. Phương pháp sác ký lỏng cao áp 68 3.2. Các phương pháp phân tích chất tinh khiết 70 3.2.1. Phổ hồng ngoại 70 3.2.2. Phổ tử ngoại 70 3.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhủn proton 70 3.2 .4. Phổ công hưởng từ hạt nhân 71 3.2.5. Phổ khối lượng 71 3.2.6. Một sô' phản ứng dịnh tính 72 3.2.7. Điểm chảy 72 3.3. Chuẩn bị mẫu 72 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu 72 3.3.2. Địa điểm lấy mẫu . , 73 3.3.3. Tời điểm thu hái 73 3.3.4. Xử lý sơ bộ * 73 3.4. Chiết nguyên liệu 73 3.5. Cây Mần tưới tía 74 3.5.1. Xử lý dịch chiết cloroform 74 3-5.2. Tách ayapanin s 75 3.5.3. Tách ayapin 78 3.5.4. Tách thymoquinon 78 3.5.5. Tách thymoquinol dimetylete, metylthymylete và 1-nitronaphthalen 80 t 3.6. Cây Mần tưới trắng 82 3.6.1. Xử lý dịch chiết cloroíorm 82 3.6.2. Tách cumarin 83 3.6.3. Tách ayapin 83 3.6.4. Tách axetophenon 84 3.6.5. Tách 8,10-epoxi-9-axetoxi-thym ol angelat 85 MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐỂ Hỏa học các hợp chất tự nhiên nói chung và các hợp chất cố hoạt tính sinh học nói riêng ngày càng thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học vì những ứng dụng võ cùng quí giá trong các linh vực y học, nông nghiệp, công nghiệp Các công trình nghiên cứu điều tra cây thuốc ở Việt Nam cho thấy số lượng các loại cây dùng làm thuốc lên tới 1850 loài, phân bố trong 244 họ thực vật [lb]. Đã có một chương trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật cấp nhà nước tiến hành 10 năm nay là: "Tạo nguồn nguyẽn liệu từ củy thuốc eho công nghiệp dược". Các tài liệu cho thấy 1/4 số thuốc đang lưu hành tại Mỹ có hoạt chất nguổn gốc từ thảo mộc [2]. Trong hệ thực vật Việt Nam, các cây họ Cúc (Cornpositae) rất phong phú, đa dạng về măt chủng loại và chiếm một phần đáng kể trong toàn bộ thảm thực vạt, do đó nó là đối tượng được nhiều người quan tâm. Trong cay họ Cúc cố tới 100 loài được dùng làm thuốc chữa bệnh dưới dạng các chế phẩm thô sơ như thuốc sắc, rượu thuốc, cao [7]. Dùng nước để sắc thuốc chữa bệnh hiện đang là phương thức đơn giản và phổ biến trong dân gian. Bởi vạy, các thành phần tan trong nước của củc loại cay thuốc chắc chắn tiểm ẩn khá phong phú các chất có hoạt tính sinh học mà các công trình nghiên cứu về đối tượng này trẻn thế giới cũng như trong nước hiện còn ít ỏi. Trong chi Eupatorium (họ Cúc) đã phát hiện được ba cây: Mần tưới tía (Eupatoriurn ayapana Vent.) . Mần tưới tráng (.Eupatorium stoechadosmum Hance) và cỗ lào {Eupatorỉum odoratum L.) Các cây này được trổng trong các vườn cây thuốc cũng như mọc ở mọt số vùng đổi núi Việt Nam, Nhan đủn sử dụng chúng làm thuốc chữa bệnh và đôi nơi đùng để diệt côn trùng [7]. Xuất phát từ tình hình thực tiễn và tầm quan trọng của các hợp chất tự nhiên nói chung và của các hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng, đề tài luận án có tiêu để: "Đóng góp vào việc nghiên cứu hoá học một số cây thuốc chi Eupatorium (họ Cức) ở Việt Nam" nhằm giải quyết các mục tiêu sau: - Xảc định thành phần tan trong nước của Mần tưới tía cE.ayapana Vent.), Mần tưới trắng (E.stoechadosm um Hance) và cỏ lào (E.odoratum L.). Phân lập các chất tinh khiết có trong thành phán này. - Xác định cấu trúc và hoạt tính của các chất phân lập được. - Đóng góp vào việc nghiên cửu và tổng hợp các chất cố hoạt tính sinh học. Cũng như đóng góp vào việc phân loại thực vật, một vấn để hiện đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. 3 PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. HỌ CỨC VÀ CHI EUPATORIUM 1.1.1. Vài nét về thực vật học và hoá học các cây họ Cúc Họ Cúc {Compositae hay Asteraceae) là một trong những họ lớn nhất của ngành thực vật hạt kín. Đó là một họ quan trọng của hệ thực vật thế giới cũng như của hệ thực vật Việt Nam. Theo M.E.BCirpiczniJtov (1981), họ Cúc có khoảng 1150-1300 chi với hơn 20000 loài, phan bố rộng rãi trôn toàn thế giới, nhất là vùng khí hạu Á nhiệt đới và ôn đới. Họ Cúc ở Việt Nam có 2 phủn họ, 13 tông, 114 chi và 336 loài [2]. Trong 336 loài thì 161 ioài đã biết giá trị kinh tế, chiếm gần 50% số loài: cây thuốc 96 loài, cây cảnh 28 loài, củy làm rau ăn 30 loài, củy cho tinh dẩu và dầu béo 12 loài, cây làm phủn xanh 5 loài, củy có tác dụng trừ sâu diệt cổn trùng 5 loài. Các củy họ này thường thuộc thảo, ít khi là cay to, rẽ củy thường phổng lên thành củ, lá đơn và thường mọc so le, ít khi mọc đối, có khi thành hình hoa thị, không có lá kèm. Phiến ít khi nguyên, thường khía răng hay chia thuỳ. Cụm hoa: đầu gổm nhiểu hoa mọc ở kẽ những vảy và bao bọc bởi một tổng bao lá bắc - Hoa có thể đếu, hình ống hay không đều, hình lưỡi nhỏ. Năm cánh hoa liển nhau thành một tràng hình ống hay hìnH lưỡi nhỏ. Năm nhị dính liền nhau bởi bao phấn thành một ống. Hai ná noãn, bầu hạ một ổ đựng ruột noãn vòi dài, đáu nhụỵ xẻ đôi, có lông thu. Một số cây có ống nhựa mủ, một số loài khác có ống tiết. Chất dự trữ trong củ là inulin [3]. F.Bohlman và các cộng tác viôn [17] đã phủn iộp được từ họ Cúc trên 2500 hợp chất mới và xác định cấu trúc của chúng. 4 Trong công việc nầy, ỏng đã nghièn cứu các loài thực vạt thuộc họ Cúc có ở chau Âu, ở Trung và Nam Mỹ cũng như ở vùng Nam Phi. sử dụng các phương pháp phan lap hiẻn đại kết hợp với các phương pháp khảo sát phổ, người ta có thể xác định được cấu trúc của các thùnh phán chủ yếu lấy ra từ 50-200g nguyên liệu thực vật, nếu hàm ỉượng của chúng chiếm trên 0,001%. Đặc trưng cho họ Cúc là các hợp chất : sesquitecpen, sesquitecpen lacton, cumarin, ancaloit 1.1.2. Vài .nét về thực vật học và hoá học chi Eupaíorium (tông Eupatoriae họ Cúc). Các cây họ Cúc được chia làm 13 tông. Trong mỗi tông chia ra thành nhiều chi và mỗi chi lại gổm nhiểu loài khác nhau. Có những tồng gổm nhiều chi như tông H elianthae, có 23 chi ngược lại có những tông chỉ gồm một số rất ít chi như tông Eupatoriae, chỉ có 4 chi [2], Cụ thể các chi của tông Eupatoriae được phủn biệt như sau: 1 - Chi Aảenostemma Forst - Cúc dính gồm 3 loài mọc ở ven rừng ẩm, vùng núi thấp. 2 - Chi Agératum L. - c ỏ hôi gồm 2 loài, mọc phổ biến từ đổng bằng đến miển núi. 3 - Chi Eupatorium L. - Mẩn tưới gồm 9 loài, mọc từ đồng bằng đến núi cao. 4 - Chi M ikania Willd. - Cúc leo chỉ có 1 loài, gặp ở ven rừng vùng núi thấp. Tổng Eupatoriae tổng cộng có 15 loài, trong đó có 9 loài thuộc chi Eupatorium. 5 3 Loài: Mán tưới tía (Eupatorium ayapana Vent.), Mán tưới trắng (Eupatorìttm stoechadosmum Hance) và c ỏ lào (Eupatorium odoratum L.) có thể thu hái ở địa phạn Hà Nội. Hai loài khác đã được phát hiện ở các tỉnh phía bdc như: Eupatorium chinensis L. tại Hữu lũng, Lạng Sơn, Lạng Giang, Hà Bác. Eupatorium Linđleyanum Bl. tại Hữu Lũng, Lạng Sơn, Hà Trung, Thanh Hóa và địa phận Ninh Bỉnh. Các cây thuộc chi Eupatorìum phan bô' rải rác ở chùu Âu, Bắc Phi, châu Á. Vào những năm 30, 40 loài này lan rộng ra các vùng ồn đới ở chùu Á, châu Âu song tạp trung chủ-yếu ở vùng nhiệt đới châu Mỹ [21]. Theo Dodomaeus xuất xứ tên Eupatorium íà Hepatorium (hepar tiếng la tinh là gan) bởi vì hoạt tính hữu ích của loài thực vật này là chữa các bệnh vể gan [22]. Nhiều loài thực vạt trong chi này được sử dụng để chữa các bệnh gan, lá lách, chống khối u, làm liền vết thương, làm thuốc lợi tiểu, hạ sốt và nhiều ứng dụng khác [52]. Các nhóm chất tạp trung chủ yếu .là p-hydroxiaxetophenon, dãn xuất thymol và flavon [18]. Ngoài ra có thể kể thêm một loạt sesquitecpen lacton, trong đó chủ yếu là germacrolid, một số sesquitecpen và trong vài trường hợp có ditecpen. Những kết qủa nghiôn cứu gán đay có phân biệt hai nhóm chất: Một là nhóm sesquitecpen lacton và hai là nhóm p-hydroxiaxetophenon và các dản xuất thymol. Eupatorium m ohrii là một đại diện cho nhóm 1, đã tách được từ phàn rễ hai dãn xuất nerolidol 1 và 2 ( hình 1). u OH :o 5 : R =■ CH,OH, R1 = CH,OH 6. R = CHjOAc, R' = CHịOAc 7 : R =s R' = CHO 8 : R = CHjOH, R‘ = CHO 6 21: R = H 22: R - Ac 9 : R - R* - H 10: R =. R' = Ae 11: k = Acv Rl = H 23 24 25 R1 H OH OH R1 H Ac H RJ Ang* Ang* Tigl.* 28 29 30(10) (10-epi) R‘ H H OH H Ac Ac R Tigl Tigl Ang Ang = COC(Me) = CHM e(cií); Tigl = trans; iBii = COCH (Mc): ; MeBũ = COCH (Me) Hình 1: Các chất đã được phát hiện trong chi EupatorĨLim 7 1 R 10 33 : R - K 34 : R = o H 35 : R = OM e 36: R. — ÎBÜ (11) R2 H H R3 H H 44 H H H OMc H H H OCO Ph OTigl - y y V ' 45 ^O ^C«H j OH 47(14) 48 49(15) 50(12) R1 H H H OH R2 H OAng OM ebû H RJ H H H OH HeO ' 0 ' 53(16) 59(17) ' X X H „ o y C p ’ ' 1 - Y S 54(17) 55(17) 56Í1S) 57(19) 58(2) R' H R! H RJ H OH « O M c H H H H OM e OMe H H H OH 2.55 USAS d d 7 " H _ 151 Ú = 8.2) ư 6.97 61 ^ v 0y v 0 ° 64(22) OH R C H ^ C ^ C j j C H ^ C H j 65 : R = H (23) 66 : R = o Ac Me[C=C]j [CH=CH]j (CHj)3 OAc 67(23) Hình 1 : Các chất đã được phát hiện trong chi Eupatorium (tiếp theo) [...]... iu ny chng t cỏc hp cht C 9 ca dng (99) l ngun gc ca cỏc flavonoit (Hỡnh 6), axit cinnamic v cỏc H ỡnh 6: Tng hp sinh hc ca axit cinnamic v cumarin Nu cỏc axit cinnamic cú lin quan n qỳa trỡnh tng hp sinh hc ca flavonoit thỡ vic bóo ho 3 n v axetat cú th i qua bc trung gian (108), tng t chalcon (109) Cỏc axit cinnamic tham gia trong tng hp sinh hc ca flavonoit cng tng t nh trong qỳa trỡnh tng hp sinh... vi 3 gc axetat Nh vy axit cinnamic ng vai trũ quan trng trong tng hp sinh hc ca flavonoit b/ Tng hp sinh hc ca axit cinnamic v cumarin Cỏc axt p-cumaric (105), catfeic (106) v sinapic (107) cựng vi cỏc nhỏnh cú nhan oxi húa ó khng nh rng chỳng cú quan h v mt sinh hc vi phn C (B) - C 3 ca cu trỳc tỡavonoit (101) Cỏc nghiờn cu gỏn ay v ngun gc cỏc hp cht flavonoit v axit cinnamic thụng qua cacbon ỏnh du... trớ 7 S hỡnh thnh 7 - hydroxi cumarin qu;i qỳa trỡnh oxi húa t 4 - hyroxi cinnamic axit ó sỏng t iu ny Cỏc kt qa nghiụn cu v tng hp sinh hc ca cumarin ó ch ra rng phenylalanin, axit cinnamic v axit shikimic ó cú nhng kt hp hiu qa, trong khi axit axetic khụng cú mt trung qỳa trỡnh ny Qỳa trỡnh oxi húa ỳng vũng ca cỏc axit cinnamic (110) to thnh cumarin ( 112 ) cú th i qua bc trung gian to thnh quinol... 136 H nh 14: Chalcon Tờn tng hỗrp cht thng c c bng cỏch da vo tờn chi hoc loi thc vt, ú l tờn thụng thng, cũn ng v mt húa hc thỡ da vo nhỳn c bn lm gc c Flavonoit c chia thnh cỏc nhúm khỏc nhau nh ớlavanon, flavon, flavonol, tlavonon, chalcon v cỏc nhúm khỏc, da vo mc oxi húa ca mch 3C Flavonoit 1 nhúm cú mc ụ oxi húa cao nht, catechin lự nhúm cú mc oxi húa thp nht M t s nhúm cỡi dc trng ca ò... Chalcon (hỡnh 14) Chalcon thng cú mu vng sm (do ch chalcos cú ngha l ng) Khi tỏc dng vi kim cho mu Chalcon un vi HC1 s ng phn húa thnh flavanon 142 H ỡnh 19: Phn t cathechin Khỏc vi cỏc nhm cht trn, catechin khụng cú nhúm -C=0 C4 Catechin cú nhiu trong qiia T ớnh cii ca cỏc hp cht Javonoic lO Tớnh cht c trnớ! ca cỏc hp cht Aavonoit l phan ng xianidin (hn hp Mg + HC1 trong mi trnii cn etlic) hng H+... sesquitecpen lacton thỡ tỡm thy ch yu l germacrolid v hp cht gỏn gi vi nú l guajanolid Hai dng ny thng cha khỏ nhiu nhúm oxi Nhúm cht th 2 l thymol v dón xut hydroxi axetophenon xut kin khỏ ph bin trong chi Eupatorium song li ớt khi cú mt ng thi cựng vi sesquitecpen lacton (Hỡnh 1) 10 1.2 I CNG V CC HP C H T C UM AR IN Trụn 150 nm, k t khi Vogel vo nm 1820 tỏch c hp cht d vũng cha oxi mang tờn cumarin... dihydropyrano cumarin Thụng thng ngi ta c gng nhn bit cỏc hp cht cumarin ngay trong dch chit trc khi cú x lý húa hc t c iu ny, sỏc ký lp mng v sc ký giy c coi l bin phỏp hu hiu, bi VI hỏu ht cỳc hp cht cumarin u phỏt quang di ốn t ngoi i vi nhng cumarin ó bit cú th dựng sc ký giy v sc ký lp m ng phỏt hin chỳng trong dch chit, thừng qua giỏ tr R f v tớnh cht phỏt quang ca cỏc vt sc ký 13 Sc ký khớ-lng... axit cinnamic Ngi ta gi thit rng axit shikimic v cc hp cht C 9 ny ó qua cỏc bin i sinh hc to nụn C 9 khi im (99) ca flavonoit (101) Trong nhiu trng hp c s chuyờn húa t flavonoit ny sang flavonoit khỏc ngay trong t nhiờn m ực bit l s oxi húa cỏc nhúm hydroxil Nu coi tng hp sinh hc ca flavonoit theo kiu 99-100-101 thi bc trung gian 100 c xem l hỡnh thnh hoc trc tip hoc giỏn tip t mt phõn t axit cinnamic... etyl C A [19] Cỏc kt qa nghiờn cu phn trờn t ca Eupatorium hyssopifolium L cho bit bờn cnh cỏc lacton 3,4 v 13 germacren D (12) cng nh lacton 5 v 9 cũn cú m etylen lacton 1 1 V trớ nhúm axetoxi C-14 c phn ỏnh qua s chuyn dch cỏc tớn hiu i vi 5-H Trong r ca Eupatorum hyssopifoiium cú dammadienyl axetat (14), 1 v 1 dón xut 1 - oxolongipinen 15 Trong r ca Eupatorium pefoliatum L cú isohumulen (16), sesquitecpen... dũn v tớnh thm ca thnh mch Nhng cht cú tỏc dng vitnmin p cú th thuc cỏc nhúm nh Aavon, ớlavonol, ớlavanon, catechin v mtoxianidin 1.5 T R O N G N G H Iấ N V I NẫT V CC PHNG PH P SC Kí s DNG cu 1.5.1 Phng phỏp sc ký lp m ng (SK LM ) Vi mc ớch kho sỏt s b thnh phn húa hc ca cỏc cht thu c t cn chit thụ, la chn h dung mụi tỏch v Theo dừi qỳa trnh tỏch trờn ct, sc ký lp m ng c coi l phng phỏp thc nghim . các hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng, đề tài luận án có tiêu để: " ;Đóng góp vào việc nghiên cứu hoá học một số cây thuốc chi Eupatorium (họ Cức) ở Việt Nam& quot; nhằm giải quyết các. phân lập được. - Đóng góp vào việc nghiên cửu và tổng hợp các chất cố hoạt tính sinh học. Cũng như đóng góp vào việc phân loại thực vật, một vấn để hiện đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. 3 PHẦN. ỐI 2.3.2. Tác dụng sinh học của cày c ỏ lào 61 2.3.3. Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây c ỏ lào 61 2.3.4. Nghiên cứu các dẫn xuất ĩlaconoit trong cây c ỏ lào Việt Nam 62 PHẨN 3: THỰC NGHIỆM