ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Mai PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2 TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Mai PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2 TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN Hà Nội – Năm 2012 MỤC LC Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các bảng Danh mục các hình Bảng ký hiệu các chữ viết tắt Lời nói đầu 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Những nét khái quát về ung thƣ, bệnh ung thƣ và gen ung thƣ 3 1.1.1. Ung thư và bệnh ung thư 3 1.1.2. Gen ung thư (oncogene) 4 1.2. Những hiểu biết về ung thƣ đại trực tràng 5 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu ung thư đại trực tràng 5 1.2.2. Sơ lược về bệnh ung thư đai trực tràng 6 1.2.3. Cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng di truyền 12 1.3. Hệ thống gen MMR và đột biến gen MSH2 với hội chứng ung thƣ đại trực tràng 17 1.3.1. Hệ thống gen MMR 17 1.3.2. Gen MSH2 và đột biến gây ung thư đại trực tràng 21 1.4. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng 24 1.4.1. Kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR 25 1.4.2. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn RFLP 25 1.4.3. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn SSCP 26 1.4.4. Kỹ thuật phân tích sợi đôi dị hợp HET 27 1.4.5. Kỹ thuật điện di gel gradient biến tính DGGE 28 1.4.6. Các phương pháp giải trình tự ADN 28 1.5. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 29 1.5.1. Mục tiêu nghiên cứu 29 1.5.2. Nội dung nghiên cứu 29 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Vật liệu, địa điểm, hoá chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu30 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 30 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 30 2.1.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 30 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu 31 2.2.2. Tách ADN tổng số 31 2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số 31 2.2.4. Nhân bản các exon nhờ phản ứng PCR 32 2.2.5. Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gây ung thư đại trực tràng 34 2.2.6. Giải trình tự ADN 37 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số 39 3.2. Kết quả nhân bản 09 exon gen MSH2 40 3.2.1. Kết quả nhân bản exon 2 40 3.2.2. Kết quả nhân bản exon 3 41 3.2.3. Kết quả nhân bản exon 6 42 3.2.4. Kết quả nhân bản exon 7 43 3.2.5. Kết quả nhân bản exon 8 44 3.2.6. Kết quả nhân bản exon 12 45 3.2.7. Kết quả nhân bản exon 13 46 3.2.8. Kết quả nhân bản exon 14 47 3.2.9. Kết quả nhân bản exon 15 48 3.3. Kết quả phân tích đột biến trên 09 exon gen MSH2 50 3.3.1. Kết quả phân tích đột biến exon 2 51 3.3.2. Kết quả phân tích đột biến exon 3 53 3.3.3. Kết quả phân tích đột biến exon 6 55 3.3.4. Kết quả phân tích đột biến exon 7 56 3.3.5. Kết quả phân tích đột biến exon 8 57 3.3.6. Kết quả phân tích đột biến exon 12 59 3.3.7. Kết quả phân tích đột biến exon 13 60 3.3.8. Kết quả phân tích đột biến exon 14 61 3.3.9. Kết quả phân tích đột biến exon 15 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 Kết luận 66 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Tài liệu tiếng Việt 68 Tài liệu tiếng Anh 68 Các trang Web 72 DANH MC CÁC BNG Bảng 1: Thống kê các bệnh ung thư liên quan đến HNPCC Bảng 2: Tiêu chuẩn Amsterdam I và Amsterdam II trong chẩn đoán lâm sàng HNPCC Bảng 3: Các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng Bảng 4: Tỷ lệ các đột biến thường gặp trong hai gen MLH1 và MSH2 Bảng 5: Nguy cơ mắc một số bệnh ung thư ở người có đột biến gen liên quan đến HNPCC so với các cá thể bình thường Bảng 6: Trình tự các cặp mồi dùng để nhân bản 09 exon quan tâm Bảng 7: Thành phần và chu trình nhiệt cho một phản ứng PCR Bảng 8: Tỷ lệ các thành phần của PAGE 12% trong kỹ thuật SSCP Bảng 9: Quy trình nhuộm bạc và thành phần các dung dịch nhuộm Bảng 10: Kết quả tối ưu điều kiện nhiệt độ gắn mồi trong nhân bản các exon nghiên cứu DANH MC CÁC HÌNH Hình 1: Sơ đồ cấu tạo ruột kết và sự hình thành polyp bên trong Hình 2: Cơ chế MMR ở E. Coli Hình 3: Cơ chế MMR ở người Hình 4: Sơ đồ cấu tạo NST số 2 và vị trí gen MSH2 Hình 5: Vị trí gen MSH2 trên NST số 2 Hình 6: Sơ đồ gen MSH2 Hình 7: Sơ đồ các phần của phân tử protein được mã hóa bởi gen MSH2 Hình 8: Tỷ lệ các dạng đột biến thường gặp trên gen MSH2 Hình 9: Kỹ thuật SSCP trong phân tích đột biến gen MSH2 Hình 10: Kết quả tách chiết ADN tổng số Hình 11: Kết quả nhân bản exon 2 Hình 12: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 3 Hình 13: Kết quả nhân bản exon 6 Hình 14: Kết quả nhân bản exon 7 Hình 15: Kết quả nhân bản exon 8 Hình 16: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 12 Hình 17: Kết quả nhân bản exon 13 Hình 18: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 14 Hình 19: Điều kiện thử nghiệm (a) và kết quả nhân bản (b) exon 15 DANH MC CÁC HÌNH (tip theo) Hình 20: Kết quả SSCP exon 2 Hình 21: Mô hình sợi đơn sai khác của mẫu 35 so với đối chứng exon 2 Hình 22: Kết quả giải trình tự mẫu số 35 exon 2 Hình 23: Kết quả SSCP exon 3 Hình 24: Kết quả giải trình tự mẫu 14 exon 3 Hình 25: Kết quả SSCP exon 6 Hình 26: Kết quả SSCP exon 7 Hình 27: Kết quả SSCP exon 8 Hình 28: Mô hình điện di sai khác của các mẫu 31, 34, 36 exon 8 Hình 29: Kết quả SSCP exon 12 Hình 30: Kết quả SSCP exon 13 Hình 31: Kết quả SSCP exon 14 Hình 32: Kết quả SSCP exon 15 Hình 33: Mô hình sợi đơn sai khác của mẫu 19 exon 15 Hình 34: Kết quả giải trình tự mẫu 19 exon 15 gen MSH2 BNG KÍ HIU CÁC CHỮ VIT TT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADN Deoxiribonucleic Acid Axit deoxiribonucleic APS Amonipersulphate Amonipersulphate ARN Ribonucleic Acid Axit ribonucleic bp Base paire Cặp bazơ CRC Colorectal Cancer Ung thư đại trực tràng DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Điện di gel Gradient biến tính dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotide triphosphate FAP Familial Adenomatous Polyposis Polyp tuyến theo dòng họ HET Heteroduplex Analysis Phân tích sợi kép dị hợp HNPCC Hereditary Non-polyposis Colorectal Cancer Ung thư ruột kết không polyp di truyền HPV Human Papilloma Virus Virut gây ung thư cổ tử cung ở người IHC Immunohistochemistry Hóa mô miễn dịch Kb Kilobase 1000 bazơ nitơ LOH Loss of Heterozygosity Mất tính dị hợp tử MMR Mismatch Repair Sửa chữa bắt cặp sai MSI Microsatellite Instability Bất ổn vi vệ tinh MSH2 MutS Homolog 2 Gen MSH2 [...]... nhân tố truyền gen ung thư mà còn trực tiếp làm biến đổi môi trường mà ở đó các gen ung thư có thể được nhân lên nhanh chóng và được phát tán rộng rãi 1.2 NHỮNG HIỂU BIẾT VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng Ung thư đại trực tràng là bệnh lý khá phổ biến trong các bệnh ung thư có liên quan đến hệ tiêu hóa Trong đó, ung thư đại trực tràng không polyp di truyền được... khá cao nhưng những nghiên cứu về gen liên quan đến căn bệnh này chưa nhiều, đặc biệt là những nghiên cứu về gen MSH2 Chính vì thế, chúng tôi tiến hành Phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai MSH2 từ bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng nhằm đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MSH2 ở các bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam, nghiên cứu mới về các gen MMR khác nhằm phục vụ có hiệu... về tình trạng ung thư tại Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, ung thư đại trực tràng xếp thứ 4 ở nam giới (sau ung thư gan, phổi, dạ dày) và xếp thứ 3 ở nữ giới (sau ung thư cổ tử cung và ung thư vú) Hiện nay, y học chưa biết chính xác nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, có những yếu tố dẫn đến nguy cơ chắc chắn làm dễ mắc bệnh hơn tuổi tác Vì trên 9% bệnh nhân ung thư đại trực tràng là trên... chất di truyền của ung thư đại trực tràng và khẳng định, hội chứng này do một số gen xảy ra các đột biến khác nhau, được di truyền qua các thế hệ và biểu hiện rõ rệt ở một số dòng họ Ngoài ra, tính hỗn tạp của các gen gây ung thư ở các bệnh nhân ung thư ruột kết di truyền cũng được biết đến như là một tác nhân gây khó khăn trong chẩn đoán và phát hiện bệnh [20] 1.2.2 Sơ lƣợc về bệnh ung thƣ đại trực tràng. .. di n các lỗi sai hỏng trong tái bản ADN Khoảng 40% các trường hợp mắc hội chứng Lynch với một đột biến được xác định có liên quan đến đột biến gen MSH2 Hàng trăm đột biến gen này có khả năng dẫn đến ung thư đại trực tràng cũng như các loại ung thư khác liên quan đến HNPCC [22] Mặc dù ung thư đại trực tràng, trong đó có ung thư đại trực tràng mang khuynh hướng di truyền là một trong những dạng ung thư. .. thành nên các nguyên lý di truyền học ung thư Tuy nhiên, mãi tới đầu thế kỉ XIX ung thư mới thật sự được ghi nhận [4] 1.1.2 Gen ung thƣ (oncogene) Gen ung thư là một dạng đột biến làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy quá trình phát sinh ung thư Ngoài ra, gen ung thư cũng có thể được coi như các dạng alen đặc biệt do các gen bình thư ng xuất hiện các đột biến [4] Còn gen gây ung thư được coi là một... viêm đại trực tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có người bị ung thư đại trực tràng thì nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng xảy ra cao hơn Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, một bộ phận ung thư đại trực tràng có xu hướng chung di truyền theo dòng họ liên quan đến các gen gây đột biến (mutator gene) [4] Học viên Khóa 2010 – 2012 1 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hồng Vân Trong ung. .. sở phân tử của ung thƣ đại trực tràng di truyền Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh được xác định là di truyền ngoài những nguyên nhân lối sống và tuổi tác Do hội chứng này liên quan đến đột biến xảy ra tại một trong các gen thuộc hệ thống nhận biết và sửa chữa các bazơ bắt cặp sai MMR Hiện nay, tính bất ổn vi vệ tinh MSI và cơ chế MMR được coi là cơ sở phân tử giải thích sự hình thành ung. .. khối u đại trực tràng là mô hình lí tưởng để nghiên cứu các gen đóng góp vào quá trình phát sinh ung thư Hơn nữa, độ tuổi mắc ung thư đại trực tràng cũng sớm hơn so với các dạng ung thư khác và thư ng nằm trong độ tuổi Học viên Khóa 2010 – 2012 8 Nguyễn Thị Mai Luận văn Cao học Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hồng Vân 40 – 42 Trong một nhóm các bệnh nhân HNPCC cũng như các bệnh nhân ung thư đại trực tràng. .. chứng biểu hiện ung thư đại trực tràng Ung thư đại trực tràng là căn bệnh có những triệu chứng ban đầu không rõ rệt, nó có thể khởi phát ở bất cứ vị trí nào của đại trực tràng, từ phía trong ra phía ngoài qua các lớp khác nhau của thành ruột Ung thư ở mỗi vị trí sẽ có những biểu hiện triệu chứng khác nhau và thông thư ng là có máu trong phân khi người bệnh đi đại tiện Đại đa số trường hợp, bệnh phát triển . hành Phân tích di truyền gen sửa chữa bắt cặp sai MSH2 từ bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng nhằm đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MSH2 ở các bệnh nhân ung thư đại trực tràng. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Mai PHÂN TÍCH DI TRUYỀN GEN SỬA CHỮA BẮT CẶP SAI MSH2 TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Di. cứu ung thư đại trực tràng 5 1.2.2. Sơ lược về bệnh ung thư đai trực tràng 6 1.2.3. Cơ sở phân tử của ung thư đại trực tràng di truyền 12 1.3. Hệ thống gen MMR và đột biến gen MSH2 với