           TRƢỜNG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƢ ̣ NHIÊN Bi Nguyên Hi NGHIÊN CƢ ́ U XÂY DƢ ̣ NG THANG ALEN CHI ̉ THI ̣ HUNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 V D3S1358 PHC V GIM ĐNH                    TRƢỜNG ĐA ̣ I HO ̣ C KHOA HO ̣ C TƢ ̣ NHIÊN Bi Nguyên Hi NGHIÊN CƢ ́ U XÂY DƢ ̣ NG THANG ALEN CHI ̉ THI ̣ HUNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 V D3S1358 PHC V GIM ĐNH   :    : 60.42.70                : PGS.TS.     BNG CC TỪ VIT TẮT Từ/ chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Acid Deoxyribonucleic APS Amonium persulfate LD Allelic ladder      bp Base pair  dNTP Deoxynucleoside triphosphate dATP Deoxyadenine triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanine triphosphate dCTP Deoxycytozine triphosphate FL Fluorescein  Fluorescein M50 Marker 50bp  OD Optical density  PCR Polymerase chain reaction  PBS Phosphate buffer saline RFLP Restriction fragment length polymophism   STR Short Tandem Repeat  Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Boric acid-EDTA TE Tris-EDTA TEMED -tetramethyl- ethylenediamine VNTR Variable number of tandem repeat  au w/v Weight/volume  MC LC Mở đầu 1 Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu 3 1.1  3 1.1.1 Cơ sở khoa học của phân tích ADN xác định cá thể 3 1.1.2 Các kỹ thuật xác định tính đa hình của ADN 5 1.1.2.1  5 1.1.2.2  6 1.2   6 1.2.3 Các locus STR ứng dụng trong phân tích cá thể người. 8 1.2.4 Các locus sử dụng trong nghiên cứu. 9 1.3  10 1.3.1 Phương pháp nhuộm Ethidum bromide 12 1.3.2 Phương pháp đánh dấu phóng xạ 12 1.3.3 Phương pháp nhuộm bạc 12 1.3.4 Phương pháp đánh dấu huỳnh quang 13 1.4   15 1.4.1 Khỏi niệm về chất huỳnh quang 15 1.4.2 Ứng dụng chất huỳnh quang trong phõn tớch ADN 17 1.5  18 1.5.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trờn thế giới 18 1.5.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trong nước 19 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU V PHƢƠNG PHP NGHIÊN CỨU 21 2.1  21 2.1.1  21 2.1.2  21 2.1.3  21 2.1.4  22 2.2  24 2.2.1  25 2.2.2  25 2.2.3  26 2.2.4  27 2.2.5  29 2.2.5.1  29 2.2.5.2  30 2.2.6  31 2.2.7  34 CHƢƠNG 3: KT QU V THO LUẬN 35 3.1  35 3.2  36 3.3  39 3.4  44 3.5  47 3.6  50 CHƢƠNG 4: KT LUẬN V KIN NGH 55 4.1  55 4.2  55 TI LIỆU THAM KHO 56 PH LC  1 MỞ ĐẦU                                        -                   --  2                               Nam.                                 Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định.     3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TI LIỆU 1.1. Phƣơng pháp xác định cá thể dựa trên chỉ thị ADN 1.1.1. Cơ sở khoa học của phân tích ADN xác định cá thể            ADN (axit               Hình 1. Cấu trúc phân tử ADN 4    , 23]:     - AGACTGCTAG -  - AGCCTGCGAG-       - ATAT ATAT ATAT-    - ATAT ATAT ATAT ATAT ATAT -        nhau.     1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 [...]... sử dụng cho chế tạo thang alen 20 3 Chế tạo thang alen đơn cho mỗi locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358 4 Chế tạo thang alen phức hợp 05 locus trong cùng một phản ứng PCR 21 CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu sử dụng trong đề tài bao gồm các mẫu máu (khoảng 50 mẫu), 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358. .. sử dụng các cặp mồi huỳnh quang trong chế tạo thang alen chỉ thị tại Việt Nam chƣa có một cơ sở nghiên cứu nào tiến hành Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang với mục đích nâng cao năng lực phân tích cho các phòng thí nghiệm ở địa phƣơng có nhu cầu Nội dung nghiên cứu gồm có: 1 Tách chiết, định lƣợng ADN trong các mẫu nghiên cứu 2 Nhân bội và kiểm... Đánh dấu đồng vị phóng xạ tự ghi Gắn huỳnh quang/ Bechman CE Nhuộm bạc Gắn huỳnh quang/ Scaner Gắn huỳnh quang/ mao quản Gắn huỳnh quang/ LICOR Gắn huỳnh quang/ ALF Sequencer Gắn huỳnh quang/ FMBIO Scaner Gắn huỳnh quang/ ABI 310 Gắn huỳnh quang/ ABI 3100 và ABI 3100 advant Thành phần Sản phẩm PCR đƣợc đánh dấu với 04 màu huỳnh quang khác nhau Các băng ADN đƣợc đọc tự động trong quá trình điện di khi... 615 497 520 Mỗi bộ thuốc nhuộm huỳnh quang đƣợc sử dụng phải phù hợp với các thiết bị quang học, nguồn kích thích đi kèm Vì vậy, không linh động nhƣ phƣơng pháp nhuộm bạc, các bộ KIT phân tích STR sử dụng mồi gắn huỳnh quang có yêu cầu chặt chẽ về các thiết bị sử dụng đi kèm hơn 1.5 Tình hình nghiên cứu chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang 1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Budowle et al... scan huỳnh quang Pharos FXTM Plus Molecular Imager - Micropipette các loại: 1-10 l, 10 -100 l, 20- 200 l, 100 - 1000 l - ống eppendorf chuyên dùng cho PCR các loại: 1,5 ml; 0,5 ml và 0,2 ml - Đầu tip các loại: 10 l, 200 l, 1000 l và đầu tip có lọc 200 l 2.1.3 Mồ i cho các locus nghiên cưu ́ Trong đề tài , chúng tôi sử dụng các bộ mồi cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358. .. ADN trong xác định cá thể ngƣời và huyết thống đã có nhiều bƣớc phát triển và thành tựu Tại trung tâm công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội [13, 17], các tác giả đã nghiên cứu việc sử dụng xét nghiệm chỉ thị phân tử dựa trên PCR để nghiên cứu tần suất alen của hai locus D1S80 và D17S5, đồng thời với các nghiên cứu về locus gen đa hình nằm trên NST giới tính Y Các nghiên cứu của trƣờng... Promega để làm mẫu đối chứng dƣơng trong các thí nghiệm và để xác định các alen của thang alen sau khi chế tạo hoàn chỉnh Mẫu khuôn K562 có hàm lƣợng 10ng/µl, có độ tính sạch cao, có kiểu gen đã đƣợc xác định ở tất cả các locus, kể cả 05 locus sử dụng trong nghiên cứu 2.1.2 Thiết bị, vật tư nghiên cứu - Các máy móc cần thiết cho pha hóa chất, Tách chiết, PCR và điện di - Hệ thống điện di Sequi-Gen... gồm 6 locus là TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51 và D21S11 với xác suất hai cá thể trùng nhau là 1/50.000.000 Những locus nêu trên đều sử dụng các phƣơng pháp huỳnh quang để phát hiện Từ năm 1996 phòng thí nghiệm của FBI đã đỡ đầu cho việc nghiên cứu và xây dựng cơ sở dữ liệu từ 13 đoạn FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, D18S51, CSF1PO, D8S1179 và D21S11 13 locus đánh... tích Thang alen chỉ thị để định danh alen khi điện di Trình tự mồi và thang chỉ thị alen thuộc bản quyền của hãng sản xuất, chúng đƣợc giữ bí mật và đƣợc bán kèm với bộ KIT khuếch đại PCR Sử dụng các bộ KIT phân tích cá thể, trên thế giới có hàng triệu các phân tích STR đƣợc tiến hành hàng năm tại các viện nghiên cứu trực thuộc chính phủ, các trƣờng đại học, các phòng xét nghiệm tƣ nhân phục. .. thứ hai: Một vài trình tự có những alen không đồng nhất: TH01, D18S51, D7S820 - Nhóm thứ ba: Cấu trúc kép với các alen khác nhau:vWA, FGA, D3S1358, D8S1179 - Nhóm thứ tƣ: Cấu trúc dạng lặp dạng phức: D21S11 1.2.2 Cỏc locus sử dụng trong nghiên cứu Bảng 1 Thông tin về các locus trong nghiên cứu TT Locus Vị trớ Đơn vị lặp Số đoạn lặp Kích thƣớc sản phẩm PCR 1 Penta E Cỏnh dài NST số 15 [AAAGA] 5 .        Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định.    . TƢ ̣ NHIÊN Bi Nguyên Hi NGHIÊN CƢ ́ U XÂY DƢ ̣ NG THANG ALEN CHI ̉ THI ̣ HUNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 V D3S1358 PHC V GIM ĐNH   :. TƢ ̣ NHIÊN Bi Nguyên Hi NGHIÊN CƢ ́ U XÂY DƢ ̣ NG THANG ALEN CHI ̉ THI ̣ HUNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 V D3S1358 PHC V GIM ĐNH       