Lu Nguyn Th Lan 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Lan NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU NHIỆT ĐỘ VÀ ẨM ĐỘ CAO CỦA TẰM DÂU BOMBYX MORI L. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2013 Lu Nguyn Th Lan 2 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Lan NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU NHIỆT ĐỘ VÀ ẨM ĐỘ CAO CỦA TẰM DÂU BOMBYX MORI L. Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình 2. TS. Đinh Nho Thái Hà Nội – Năm 2013 Lu Nguyn Th Lan 3 Lời cảm ơn                    ,               ,  ,  , ,  .          : PGS.TS. Nguyn Th  Gen ng vt - Vi Sinh hc ting dn, ch b trong suc tc t   ng vt - Vi Sinh h, ch bi c tp t Ti c gi li c thi hc Khoa hc T - ng d bt thc. Cui li cc t  ng nghing h t thi gian hc t vic.  H Nguyn Th Lan Lu Nguyn Th Lan 4 MỤC LUC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 1.1. Một số nét khái quát về tằm dâu 13 1.1.1. Vị trí phân loại 13 1.1.2. Nguồn gốc 13 1.1.3. Một số đặc điểm sinh học 14 1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới năng suất và khả năng chống chịu nóng ẩm của tằm dâu 19 1.2. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa kinh tế của tằm dâu 21 1.2.1. Ý nghĩa khoa học 21 1.2.2. Ý nghĩa kinh tế 21 1.3. Phương pháp truyền thống đánh giá sức sống, năng suất chất lượng tơ kén của giống tằm 23 1.4. Một số kỹ thuật phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa hình 23 1.4.1. Kỹ thuật PCR 24 1.4.2. Kỹ thuật RAPD 25 1.4.3. Kỹ thuật RFLP 26 1.4.4. Kỹ thuật AFLP 27 1.4.5. Kỹ thuật SSR 29 1.4.6. Kỹ thuật ISSR 30 1.4.7. Phần mềm NTSYSpc 31 1.5. Tình hình nghiên cứu đa hình phân tử tằm dâu trên thế giới và ở Việt Nam . 33 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 33 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 35 Lu Nguyn Th Lan 5 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1. Vật liệu 39 2.1.1. Các giống tằm 39 2.1.2. Mồi sử dụng 41 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 41 2.2. Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 43 2.2.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế 45 2.2.3. Điện di trên gel Agarose 46 2.2.4. Phương pháp PCR – ISSR 47 2.2.5. Xử lý số liệu 48 2.2.6. Phương pháp thôi gel 49 2.2.7. Tạo plasmid tách dòng 50 2.2.8. Biến nạp sản phẩm vào  50 2.2.9. Chọn lọc và nuôi dòng tế bào có khả năng mang đoạn gen biến nạp 51 2.2.10. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 51 2.2.11. Cắt plasmid bằng enzym giới hạn 52 2.2.12. Tinh sạch plasmid 53 2.2.13. Phương pháp xác định trình tự gen 53 2.2.14. Phương pháp thiết kế mồi 54 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1. Phân tích đa hình phân tử 55 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 55 3.1.2. Phân tích đa hình phân tử của các giống tằm 57 Lu Nguyn Th Lan 6 3.1.3. Phân tích quan hệ di truyền giữa các giống tằm 59 3.1.4. Xây dựng sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm 60 3.2. Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của giống 61 3.2.1. Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao 61 3.2.2. Khuếch đại và dòng hóa phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và độ ẩm cao 62 3.2.3. Xác định trình tự liên quan tới khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao 65 3.2.4. So sánh trên ngân hàng gen và bản đồ genome tằm 66 3.2.5. Thiết kế mồi, tối ưu điều kiện khuếch đại phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nóng ẩm cao của tằm 70 3.2.6. So sánh tần số khuếch đại và khảo sát mồi đặc hiệu 73 KẾT LUẬN 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC Lu Nguyn Th Lan 7 DANH MỤC BẢNG STT Bảng Chú thích Trang 1 Bảng 1 u ging t 29 2 Bảng 2 ng t trin ch th 30 3 Bảng 3  i ISSR 31 4 Bảng 4 t b  dng c s dng 32 5 Bảng 5  33 6 Bảng 6  ISSR 37 7 Bảng 7 -ISSR 38 8 Bảng 8 Phn ng gn sn ph 40 9 Bảng 9 Phn ng ct hn ch plasmid  hp 42 10 Bảng 10 N  sch DNA cu 46 11 Bảng 11 S n, t l  s PIC 47 12 Bảng 12 H s ng di truyn ging tm 49 13 Bảng 13  mt s cp mc thit k 61 14 Bảng 14 n ca phn ng PCR  c hiu 62 15 Bảng 15 t ca phn ng PCR  c hiu 62 16 Bảng 16 n s khui cn 1500bp khi s dng hai loi mi (%) 63 17 Bảng 17 Tn s sut him 64 Lu Nguyn Th Lan 8 DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Hình Chú thích Trang 1 Hình 1 Trng tm 5 2 Hình 2 T 6 3 Hình 3 Nhng tm 6 4 Hình 4  7 5 Hình 5  phn ng ISSR 20 6 Hình 6 Kt qu n di DNA tng s ca mt s ging tm  45 7 Hình 7 n di sn phm PCR 48 8 Hình 8 n di sn phm PCR 48 9 Hình 9 n di sn phm PCR 48 10 Hình 10 n di sn phm PCR 48 11 Hình 11 n di sn phm PCR 49 12 Hình 12 n di sn phm PCR 49 13 Hình 13  quan h di truyn ging tm 51 14 Hình 14 n di sn phm PCR 52 15 Hình 15   53 16 Hình 16 n di sn pht DNA plasmid 53 17 Hình 17 n di kim tra kt qu bin np 54 Lu Nguyn Th Lan 9 18 Hình 18 n di kt qu tinh sch Plsamid 55 19 Hình 19  n 1500bp 56 20 Hình 20   gen 57 21 Hình 21 V  Genome tm - GBrowse (chromosome) 60 22 Hình 22 Vị trí của phân đoạn 1500 trên bản đồ Genome tằm – Pgmap 60 23 Hình 23 n di sn phm PCR 64 24 Hình 24 n di sn phm PCR 65 Lu Nguyn Th Lan 10 BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT (Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành) Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism DNA Đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuyếch đại Bp Base pair Cặp bazo CTPT Chỉ thị phân tử DNA Deoxyribonucleic acid Axit đeoxyribonucleic HSTĐDT Hệ số tương đồng di truyền ISSR Inter simple sequence repeat Trình tự các đoạn lặp lại đơn giản Kb Kilo base 1000 cặp bazơ LB Luria-Bertani OD Optical Density Giá trị mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase PĐ, PDĐH Phân đoạn, Phân đoạn đa hình RAPD Random Amplified Polymorphism DNA Đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism DNA Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic SSRs Simple Sequence Repeats Khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản TLĐH Tỷ lệ đa hình TSPĐ Tổng số PĐ được nhân lên với mồi đó TAE Tris - Acetic acid - Ethylen Diamin Tetra Acetic [...]... phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu Bombyx mori L. ” Công trình được thực hiện tại phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học Mục tiêu: Tìm kiếm chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu Bombyx mori L Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu đa hình phân tử của các giống tằm  Nghiên cứu. .. Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu Nguyễn Thị Lan 12 Luận văn thạc sĩ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số nét khái quát về tằm dâu 1.1.1 Vị trí phân loại Ban đầu, tằm dâu có tên l Phalaena mori Đến năm 1758 Linnaeus xếp loài tằm này vào bảng hệ thống phân loại với tên khoa học l Bombyx mori L Hệ thống phân loại của tằm dâu như... Tác động xấu: Gió l m l dâu mau héo ảnh hưởng đến khả năng ăn dâu của tằm, l m tiêu hao nhiệt l ợng trong cơ thể tằm đặc biệt khi nhiệt độ thấp và ẩm độ thấp Khi tằm ngủ, gió mạnh sẽ l m tằm không l t xác hoặc l t xác một nửa Khi tằm l n né gặp gió mạnh tằm sẽ l m kén phân tầng, l m giảm chất l ợng kén Tốc độ gió thích hợp với tằm nhỏ l 0,02m/s, với tằm l n l 0,1-0,3m/s [12]  Ánh sáng Mức độ ảnh... nhiệt độ thấp hơn [12]  Độ ẩm Độ ẩm tác động tới sinh trưởng, phát dục của tằm thông qua tác động trực tiếp và tác động gián tiếp [12] - Tác động trực tiếp: Ẩm độ ảnh hưởng tới mọi hoạt động sinh l của tằm như tiêu hoá, tuần hoàn, trao đổi chất … [12] - Tác động gián tiếp: Ẩm độ quá cao l môi trường thuận l i cho vi khuẩn phát triển, tăng nguy cơ phát sinh bệnh cho tằm Ẩm độ quá thấp sẽ l m l dâu. .. suất chất l ợng cao [21] Nguyễn Thị Lan 19 Luận văn thạc sĩ Khả năng thích nghi với điều kiện nhiệt độ thay đổi tuỳ thuộc vào giống tằm, tuổi tằm và điều kiện nuôi dưỡng Các giống tằm đa hệ thích hợp với nhiệt độ cao hơn các giống l ỡng hệ và độc hệ, giống tằm lai thích hợp với nhiệt độ cao hơn giống nguyên 10C-20C Tằm con thích hợp với nhiệt độ cao hơn tằm l n Nuôi tằm ở điều kiện ẩm độ cao, thông... biến nhiệt vì vậy nhiệt độ tác động trực tiếp tới mọi hoạt động sinh l của tằm Tằm có thể phát dục được trong khoảng nhiệt độ 7,5 – 370C Trong đó nhiệt độ thích hợp nhất cho phát dục của tằm l 20 – 300C Trong phạm vi nhiệt độ này, khi nhiệt độ càng tăng thì quá trình sinh trưởng phát dục của tằm càng tăng [12] Đảm bảo nhiệt độ thích hợp tương đối cho tằm l biện pháp quan trọng để có l a tằm năng. .. và l vấn đề cấp thiết Các công bố hiện tập trung vào nghiên cứu đa dạng phân tử giống tằm Việt Nam, xác định quan hệ di truyền, tìm hiểu ưu thế lai Việc phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến việc đánh giá giống nhằm nâng cao hiệu quả chọn tạo giống tằm cao sản và có khả năng chịu nóng ẩm cao đang mang tính thời sự Từ tình hình thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu phát. .. protein trong l dâu [12] Ngoài ra, trong l dâu có chứa chất dẫn dụ có thể l i cuốn tằm, chất vị giác kích thích hành vi nhai của tằm, chất nuốt trôi giúp tằm nuốt l dâu Chất dẫn dụ này có mùi vị đặc trưng riêng biệt, l i cuốn tằm đến ăn Do vậy mà loài côn trùng này không ăn những l cây khác [8] 1.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng tới năng suất và khả năng chịu nóng ẩm của tằm dâu  Nhiệt độ Tằm dâu l loài côn... ngài Hệ tính và tính ngủ Hai đặc tính này thể hiện rõ sự thích nghi của tằm đối với môi trường * Hệ tính (voltinism): L khái niệm chỉ số thế hệ trải qua trong một năm của một giống tằm Hệ tính phụ thuộc vào giống tằm và các điều kiện môi trường như ánh sáng, độ ẩm, độ thoáng khí… đặc biệt l nhiệt độ [12] Theo cách phân loại này người ta chia tằm dâu ra l m 3 loại: Tằm độc hệ, tằm l ỡng hệ, tằm đa hệ... truyền ở cấp độ phân tử giữa các cá thể trong quần thể Nghiên cứu đa hình phân tử dựa trên cơ sở các chỉ thị phân tử (CTPT), so với các quan sát, nghiên cứu truyền thống - chủ yếu l các chỉ tiêu về hình thái và một số chỉ tiêu sinh hoá, các CTPT có một số ưu điểm vượt trội: - CTPT phản ánh mức độ biến động rất cao trong phân tử DNA, chính vì thế nghiên cứu đa hình phân tử không cần phải gây đột biến - . chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm độ cao của tằm dâu Bombyx mori L. Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu đa hình phân tử của các giống tằm.  Nghiên cứu phát triển. nhiệt độ và ẩm độ cao của giống 61 3.2.1. Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao 61 3.2.2. Khuếch đại và dòng hóa phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nhiệt. Nguyễn Thị Lan NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU NHIỆT ĐỘ VÀ ẨM ĐỘ CAO CỦA TẰM DÂU BOMBYX MORI L. Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN