ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Ngọc NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Hồng Ngọc NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Trịnh Đình Đạt Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên 2. PGS.TS. Hồ Đình Trung Viện sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ƣơng Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trịnh Đình Đạt, PGS.TS. Hồ Đình Trung, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này. Tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện giúp cho tôi nghiên cứu và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm tạ các thầy cô, anh chị trong bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, phòng Đào tạo sau đại học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ tôi bảo vệ luận án. Tôi gửi lời cảm ơn tới các cô chú, bạn bè đồng nghiệp trong khoa Sinh học Phân tử, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, những người đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin gửi lòng biết ơn sâu sắc tới dự án hợp tác Song phương Việt – Bỉ, Quỹ toàn cầu phòng chống sốt rét Việt Nam và trường đại học Nagasaki Nhật Bản đã hỗ trợ tôi các phương tiện, công cụ, máy móc, hoá chất để hoàn thành các thí nghiệm trong luận án. Cảm ơn bạn bè thân thiết luôn là nguồn cổ vũ động viên tôi phấn đấu. Với tất cả lòng biết ơn sâu nặng, tôi xin dành cho gia đình, bố mẹ những người đã dắt dìu, cổ vũ động viên yêu thương và cảm thông sâu sắc. Tác giả Nguyễn Thị Hồng Ngọc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các số liệu, kết quả trong luận án này là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình hoặc tài liệu nào. Tác giả Nguyễn Thị Hồng Ngọc MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa LỜI CẢM ƠN iii LỜI CAM ĐOAN iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ xi MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS TRÊN THẾ GIỚI 5 1.2. TỔNG QUAN NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM 10 1.3. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỀN Ở MUỖI SỐT RÉT 12 1.3.1. Đa hình enzyme và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 13 1.3.2. Các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 16 1.4. TỔNG QUAN SỰ KHÁNG HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG Ở VECTOR TRUYỀN BỆNH 22 1.4.1.Cơ sở di truyền của tính kháng hóa chất diệt côn trùng 22 1.4.2. Các cơ chế kháng hóa chất diệt côn trùng 23 1.4.3. Tình trạng đáp ứng với hóa chất diệt của một số loài Anopheles tại Việt Nam. 33 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 35 2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 35 2.2.1. Thời gian nghiên cứu 35 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu 36 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu 36 2.3.2. Mẫu nghiên cứu 36 2.3.3. Phƣơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa 37 2.3.4. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 38 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1.1. Phân bố, đặc điểm sinh học và vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 53 3.1.2. Đa hình di truyền isozyme của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 69 3.1.3. Đa hình di truyền của nhóm loài Anopheles leucosphyrus dựa vào các chỉ thị phân tử 76 3.1.4. Kết quả tạo chủng muỗi An. dirus kháng với permethrin chủng phòng thí nghiệm 82 3.1.5. Kết quả thử nghiệm sinh học đối với hai quần thể muỗi thu thập tại thực địa 84 3.1.6. Kết quả xác định gen kháng ngã gục muỗi An. dirus bằng PCR-RFLP 86 3.1.7. Kết quả xác định sự biểu hiện quá mức của gen P450 88 3.2.BÀN LUẬN 89 3.2.1. Phân bố của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 89 3.2.2. Đặc điểm sinh học, vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 92 3.2.3. Tính đa hình của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 94 3.2.4. Tính kháng hóa chất của An. dirus 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102 KẾT LUẬN 102 KIẾN NGHỊ 103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO 105 PHỤ LỤC 120 Phụ lục 1: Đạo đức nghiên cứu 120 Phụ lục 2: Đọc kết quả điện di và đặt tên cho các locus, các elen kiểm soát phổ hoạt tính các enzyme 121 Phụ lục 3: Các bƣớc tiến hành kỹ thuật ELISA 126 Phụ lục 4: Bảng nồng độ thử nghiệm trong tạo chủng muỗi kháng với permethrin từ muỗi An. dirus chủng nuôi phòng thí nghiệm 128 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ABTS: 2,2' – azino – bis (3-ethylbenzothiazoline-6sylphonic acid) ADN: Acid Deoxyribonucleic ALDOX: aldehyde oxidase An. : Anopheles ATP: Adenosine triphosphate bp: Base pair (cặp bazơ ) COI: Cytochrome C oxidase I gene COII: Cytochrome C oxidase II gene cs: Cộng sự D N : Genetic distance (Khoảng cách di truyền ) D3: Dopamine receptor gene DDT: Diclo- diphenyl- triclo- ethane dATP: deoxyadenosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dNTP: deoxynucleoside triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate (E.C): Enzyme code (Mã số enzyme ) EC: European commission (Cộng đồng Châu Âu ) EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay (Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme ) EST: Esterase et al: và những ngƣời khác EtBr: Ethidium bromide FUM: Fumerate hydratase HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase HK: Hexokinase GABA: Gama aminobutyric acid GPI: Glucosephosphate isomerase GPDH: Glycerophosphate dehydrogenase GOT: Glutamate oxaloacetate transminase GST: Glutathion S transferase HAD: D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase IGS: Intergenic spacer (Vùng đệm nội gen) ITS: Internal transcripbed spacer (Vùng đệm nội phiên mã) IDH: Isocitrate dehydrogenase I N : Genetic Identity (Hệ số tƣơng đồng di truyền ) KST: Ký sinh trùng KST SR: Ký sinh trùng sốt rét LAP: Leucine aminopeptidase LC 50 : Lethal concentration 50% (Nồng độ chết 50%) LDH: Lactate dehydrogenase mAB: Monoclonal antibody (Kháng thể đơn dòng ) MP: Maximum parsimony (Hà tiện tối đa) MDH: Malate dehydrogenase ME: Malic enzymee MPI: Manose phosphate isomerase NAD: 1-Naphthaleneacetamide NBT: Nitroso Blue Tetrazolium NJ: Neighbor joining ND5: NADH dehydrogenase 5 gene ND6: NADH dehydrogenase 6 gene nAchR: Nicotine acetylcholine receptor NST: Nhiễm sắc thể ODH: Octanol dehydrogenase P.: Plasmodium PCR: Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp ) PGM: Phosphate glucomutase 6 PGD: 6 Phosphogluconate dehydrogenase QT: Quần thể qRT-PCR: Quantitative reverse transcriptase - PCR RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên) RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình các đoạn phân cắt giới hạn) Rf: Tốc độ chuyển dịch tƣơng đối của cấu tử điện di r ARN: Acid ribonucleic Ribosome SSCP: Single Strand Conformational polymorphism (Đa hình cấu tạo sợi đơn) SDS: Sodium dodecyl sulfate TBE: Tris-Borate-EDTA TE: Tris-EDTA Viện SR-KST-CTTƢ: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ƣơng WHO: World Health organization (Tổ chức y tế thế giới ) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự mồi để xác định KST trong muỗi 41 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR lần 1 nhân bản đoạn gen chung của giống Plasmodium 42 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR đa mồi phát hiện 4 loài KST SR 43 Bảng 2.4. Trình tự mồi nhân bản đoạn COI và ND6 44 Bảng 2.5. Trình tự mồi nhân bản đoạn CYP6P4, CYP6P9 và RSP7 50 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng qRT-PCR 52 Bảng 3.1. Các điểm điều tra có muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus 54 Bảng 3.2. Tần số alen của các quần thể nghiên cứu 71 Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền và hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các quần thể nghiên cứu 75 Bảng 3.4. Giá trị LC 50 của permethrin sử dụng trong phòng thí nghiệm để lựa chọn chủng An. dirus kháng (Tháng 6/2009- 6/2011) 83 Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm sinh học của muỗi An. dirus thu thập tại xã Eachrang, Sơn Thành, Phú Yên (Tháng 10/ 2010) 85 Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm sinh học của muỗi An. dirus thu thập tại Đảo lớn Côn Đảo, Bà Rịa Vũng Tàu (Tháng 10/2009 và 11/2011). 85 [...]... loài, đặc điểm di truyền và đề xuất những ý kiến đóng góp vào việc lựa chọn những biện pháp phòng chống thích hợp với vector truyền sốt rét nguy hiểm này, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, đa hình di truyền và tính kháng với hóa chất di t côn trùng của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam Với Mục tiêu nhƣ sau: 1 Xác định đƣợc đặc điểm sinh học và sự đa hình di. .. di truyền của các thành viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 2 Xác định tính kháng hóa chất di t côn trùng của loài An dirus ở Việt Nam 2 Nội dung nghiên cứu của luận án: 1 Điều tra đặc điểm sinh học, thu thập mẫu vật tại thực địa 2 Phân tích isozyme và ADN để đánh giá tính đa hình di truyền của các thành viên trong nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam 3 Phân tích tính kháng. .. của hóa chất di t - Thay đổi trong quá trình trao đổi chất - Kháng do biến đổi vị trí đích 23 - Kháng tập tính 1.4.2.1 Kháng giảm thẩm thấu hóa chất di t Kháng giảm thẩm thấu hóa chất di t là cơ chế mà trong đó hóa chất di t không bị phân hủy trực tiếp, song tính kháng hình thành là do giảm khả năng thấm Nhiều loại hoá chất di t côn trùng thâm nhập vào cơ thể côn trùng qua lớp biểu bì Những thay đổi ở. .. tiến hóa cũng nhƣ mối quan hệ di truyền và chủng loại phát sinh của các loài trong phức hợp loài Dirus nói riêng và nhóm loài Anopheles leucosphyrus nói chung vẫn chƣa có những kết luận chính xác và cần phải có những nghiên cứu sâu hơn 9 1.2 TỔNG QUAN NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM Trƣớc năm 1962, ở Việt Nam đã phát hiện ra loài muỗi thuộc nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở vùng đồi núi và. .. đó đa số các cá thể trong một quần thể bình thƣờng của loài đó sẽ bị chết” [56] Khả năng phát triển kháng phụ thuộc vào các yếu tố sinh học, sinh thái học của côn trùng, mức độ trao đổi dòng gen giữa các quần thể, độ bền của hoá chất và cƣờng độ sử dụng hoá chất bao gồm liều lƣợng và thời gian [65] 1.4.1.Cơ sở di truyền của tính kháng hóa chất di t côn trùng Hiện tƣợng kháng hóa chất không phải là một. .. An dirus ngoài thực địa và chủng kháng phòng thí nghiệm Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:  Ý nghĩa khoa học: Luận án ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào nghiên cứu đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của nhóm loài Anopheles leucosphyrus cho kết quả chính xác, sâu sắc và toàn di n hơn so với các nghiên cứu trƣớc Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc số loài, số dạng của nhóm loài. .. thuộc nhóm loài này [16] Ngoài 2 loài trên, theo Peyton còn có dạng Côn Sơn và một mẫu muỗi cái ở Quảng Ninh chƣa đƣợc phân loại đến loài [84] Tuy nhiên, những nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử của Manguin và cs 1 (2002) lại kết luận rằng ở Việt Nam chỉ có một loài là An dirus A (An dirus s.s)? Nhƣ vậy thành phần loài của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam là chƣa rõ ràng Các nghiên cứu tại Việt. .. hết các loài muỗi truyền sốt rét trƣớc đây đƣợc định loại đều là các phức hợp loài hoặc nhóm loài đồng hình, trong đó có nhiều loài đƣợc xác định là vector truyền bệnh sốt rét quan trọng Các loài trong các nhóm loài này có vai trò truyền bệnh khác nhau, tính 12 kháng hóa chất di t côn trùng cũng khác nhau, do đó việc phân loại chính xác và mối quan hệ di truyền giữa các loài trong một nhóm loài hoặc... giữa những năm 80 Một trong những nhóm loài truyền bệnh sốt rét chính ở Đông Nam Á cũng nhƣ ở Việt Nam đƣợc nghiên cứu khá rõ là nhóm loài An minimus Những nghiên cứu về An minimus ở Việt Nam chỉ ra rằng isozyme Octanol dehydrogenase (ODH) ở loài muỗi này biểu hiện tính đa hình ở các quần thể khác nhau Các quần thể muỗi An minimus C phân bố chủ yếu ở những sinh cảnh thích hợp đó là sinh cảnh rừng rậm,... trên 50 loài thuộc phân họ muỗi sốt rét (Anophelinae) Kháng hóa chất là sự chọn lọc đặc điểm có tính kế thừa của một quần thể côn trùng gây ra thất bại một sản phẩm hóa chất mong đợi khi sử dụng theo qui định Sự kháng hoá chất di t côn trùng theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) là: “Sự phát triển khả năng sống sót của một số cá thể sau khi tiếp xúc với nồng độ nào đó của một hoá chất mà với . NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DI T CÔN TRÙNG CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: . Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, đa hình di truyền và tính kháng với hóa chất di t côn trùng của nhóm loài Anopheles leucosphyrus ở Việt Nam Với Mục tiêu nhƣ sau: 1. Xác định đƣợc đặc điểm. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, ĐA HÌNH DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG VỚI HÓA CHẤT DI T CÔN TRÙNG CỦA NHÓM LOÀI ANOPHELES LEUCOSPHYRUS Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC