1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG XÁC ĐỊNH TÊN MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI TRE (Bambusa Schreb.) DO BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ADN    2  TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG “XÁC ĐỊNH TÊN MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI TRE (Bambusa Schreb.) DO BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ADN”      - 2012 3 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1. Giới thiệu tổng quát về một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) 14 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Bambusa Schreb. 14 1.1.2. Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị sử dụng một số loài tre14 1.1.2.1. Tre Bụng phật 15 1.1.2.2. Tre Vàng sọc 16 1.1.2.3. Tre Đùi gà 17 1.1.3. Sự biến đổi hình thái do điều kiện sống của ba loài tre nghiên cứu 19 1.1.4. Tình hình phân bố tre trên thế giới và Việt Nam 20 1.1.4.1. Trên thế giới 20 1.1.4.2. Việt Nam 21 1.2. Giới thiệu một số phƣơng pháp phân loại thực vật 22 1.2.1. Phƣơng pháp hình thái học (phân loại học truyền thống) 22 1.2.2. Phƣơng pháp giải phẫu so sánh 23 1.2.3. Phƣơng pháp hoá học 24 1.2.4. Phƣơng pháp phân loại phân tử 24 1.3. Một số thành tựu nghiên cứu về phân loại học phân tử 25 1.4. Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật 27 1.4.1. Cấu trúc hệ gen lục lạp 27 1.4.2. Vùng gen nhân 29 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31 4 2.2. Vật liệu nghiên cứu 31 2.2.1. Vật liệu 31 2.2.2. Hóa chất 32 2.2.3. Thiết bị và dụng cụ 32 2.2.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 33 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.3.1. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số 33 2.3.2. Thiết kế cặp mồi 34 2.3.3. Nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR 34 2.3.5. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 35 2.3.6. Giải mã trình tự nucleotide các đoạn ADN 35 2.3.7. Phân tích số liệu 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Kết quả tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ các mẫu tre 36 3.2. Kết quả nhân bản trình tự ADN đích ở 01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp 36 3.2.1. Kết quả nhân bản gen PIF 27 3.2.2. Kết quả nhân bản gen psbA-trnH 37 3.2.3. Kết quả nhân bản gen matK 38 3.2.4. Kết quả nhân bản gen trnL - trnF 39 3.3. Kết quả gia ̉ i trình tự 4 vùng gen nghiên cứu 29 3.3.1. Kết quả giải trình tự gen PIF 39 3.3.2. Kết quả giải trình tự vùng psbA - trnH 41 3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng gen matK 43 3.3.4. Kết quả giải trình tự vùng gen trnL-trnF 45 3.4. Mức độ tƣơng đồng nucleotide giữa các mẫu trong một loài tre nghiên cứu 48 5 3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa loài tre Bụng phật, tre Vàng sọc và loài B. vulgaris đã công bố trình tự trên Genbank 51 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide giữa loài tre Đùi gà với loài B. ventricosa và loài B. tuldoides đã công bố trình tự trên Genbank 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 6 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1.    c  tre tr  th  10 Bảng 1.2.  trng tre   Nam nh   12/2004 11 Bảng 2.1.               21 Bảng 2.2.           23 Bảng 2.3.  24 Bảng 2.4.      24 Bảng 3.1.  trnL-trnF, psbA-trn 38 Bảng 3.2.    2 trnL-trnF  psbA-trnH 39 Bảng 3.3.  2 mat 40 Bảng 3.4. trnLF/trn         B. vulgaris    41 Bảng 3.5. psbA3trn         B. vulgaris    42 Bảng 3.6. psbtrn      B. ventricosa    43 7 Bảng 3.7. trnLF/trn      B. tuldoides    44 Bảng 3.8. psbtrn      B. tuldoides    44 Bảng 3.9. matK19F/mat       B. tuldoides    45 8 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Bambusa vulgaris) 5 Hình 1.2. Bambusa vulgaris) 6 Hình 1.3. Bambusa vulgaris) 7 Hình 1.4. Bambusa ventricosa) 8 Hình 1.5. Bambusa ventricosa) 8 Hình 1.6. Jasminum nudiflorum 18 Hình 3.1.  26 Hình 3.2  27 Hình 3.3 psbtrnH 28 Hình 3.4 matK19F/matKR 28 Hình 3.5 trnL/trnF 29 Hình 3.6.  31 Hình 3.7. psbA-trn 33 Hình 3.8.  gen mat 35 Hình 3.9. trnL-trn  37 Hình 3.10.        -        Bambusa vulgaris          trnL-trnF (A)   psbA-trnH (B) 42 Hình 3.11.        -        Bambusa ventricosa          gen psbA-trnH 43 Hình 3.12.        -       Bambusa tuldoides         ng gen trnL-trnF (A), psbA-trn 45 9 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit Ribonucleic Barcode  bp  BTTNVN  CNSH  cpDNA Choloroplast Deoxyribonucleic Acid. (Axit Deoxyribonucleic ) cs  CTAB Cetyl Trimethyl Amonium Bromide cv  dNTP  ddNTP  EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide Genbank  ITS Internal Transcribed Spacer kb ) MEGA Software of Molecular Evolution Genetics Analysis ( ) MP Maximum Parsimony NCBI National Center for Biotechnology Information ( ) Nxb  10 NJ Neighbor Joining OD  PCR Polymerase Chain Reaction (gen) psbA   PIF P instability factor (  tARN Transfer-ARN () trnF ARN  trnH ARN Histidine trnL ARN  TE Tris  EDTA TEs Transpoable elements TAE Tris - Acetate - EDTA Tm  UV  [...]... 12 pháp phân tích ADN góp phần làm sáng tỏ tên khoa học cho một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do có sự biến đổi hình thái ở Việt Nam Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Xác định tên một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) do biến đổi hình thái ở Việt Nam bằng kỹ thuật phân tích ADN” Với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau: - Giải trình tự nucleotide 01... dụng khác nhau Tre trúc phân bố ở nhiều châu lục, trừ châu Âu Châu Á là nơi có số lượng loài nhiều nhất với 65 chi và 900 loài Việt Nam nằm ở vùng nhiệt đới châu Á, với 25 chi và 216 loài trong đó chi tre (Bambusa Schreb.) có 67 loài [51], có thể nói tre ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng Những nghiên cứu về tre đã được bắt đầu từ lâu nhưng việc phân loại và định loại tên loài cho chi tre vẫn chưa thống... biến danh của loài Bambusa tuldoides (tên Việt Nam là Hóp nhỏ) Khó khăn này không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả trên thế giới Vì vậy việc định loại tên loài ở chi tre vẫn còn rất nan giải, cần có sự hỗ trợ của kỹ thuật phân tích ADN Phương pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) là phương pháp phân loại chủ yếu dựa trên các kỹ thuật phân tích ADN và đã cho những kết quả khá chính xác, giúp cho... thì Việt Nam có khoảng 92 loài tre trúc của 16 chi (Bảng 1.1) Những nghiên cứu gần đây cho thấy số lượng loài tre trúc phân bố ở Việt Nam lớn hơn rất nhiều Theo Lê Viết Lâm (2005) [42] thì Việt Nam có trên 140 loài của 29 chi và có thể còn tìm thấy các loài mới Năm 2006, Nguyễn Hoàng Nghĩa đã rà soát các kết quả nghiên cứu về phân loại tre trúc ở Việt Nam kết hợp với một số nghiên cứu, khảo sát ở thực... 19 mẫu của ba loài tre Bụng phật (Bambusa vulgaris Schr cv Wamin McClure), tre Vàng sọc (Bambusa vulgaris Schr ex Wendland cv Vittata McClure) và tre Đùi gà (Bambusa ventricosa McClure ) có sự biế n đổi hình thái ở Việt Nam - Các dạng biến đổi hình thái giữa các mẫu trong loài có phải là của cùng một loài tre Bụng phật hoặc tre Vàng sọc hoặc tre Đùi gà không ? - Tre Bụng phật và tre Vàng sọc có... thể cùng loài với Hóp nhỏ (Bambusa tuldoides) [15] A B C Hình 1.4 Loài tre Đùi gà dạng lóng thẳng (Bambusa ventricosa) số hiệu K.3006 (A: đoạn thân; B: lá và C: mo) A B C Hình 1.5 Loài tre Đùi gà dạng lóng phồng (Bambusa ventricosa) số hiệu K.3006 (A: đoạn thân; B: lá và C: mo) 18 1.1.3 Sự biến đổi hình thái do điều kiện sống của ba loài tre nghiên cứu Tre Bụng phật và tre Vàng sọc cùng có tên khoa... tự một số vùng gen giúp cho việc định loại tên loài ở nhiều đối tượng sinh vật [12, 22, 25], nhưng đối với các loài tre mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm (2006) [21] đã sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam Mặc dù các kết quả thu nhận chưa được nhiều nhưng cũng là cơ sở để ứng dụng phương 12 pháp phân tích ADN góp phần làm sáng tỏ tên khoa học cho một số loài thuộc chi tre. .. sọc có phải là cùng loài B vulgaris ? - Tre Đùi gà (B ventricosa) có phải là sự biến danh của loài Hóp nhỏ (B tuldoides) hay không ? 13 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quát về một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb.) 1.1.1 Vị trí phân loại của chi Bambusa Schreb Cây tre được phân bố rộng rãi trên nhiều vùng ở nước ta Tre rất quen thuộc đối với người Việt Nam vì tre được sử dụng rất... Nay khoảng hơn 200 loài 20 Số chi 6 8 7 10 11 20 4 Số loài 23 20 26 14 13 40 40 45 4 Diện tích (ha) (ha) 6.000.000 140.000 1.1.4.2 Việt Nam Là đất nước nằm ở trong vùng nhiệt đới gió mùa châu Á, Việt Nam có một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, trong đó có các loài tre trúc Ở Việt Nam có thể gặp tre từ độ cao ngang mực nước biển ở các làng xóm thuộc vùng Tây Nam Bộ, trên các đảo thuộc Vịnh Hạ Long... này để phân tích sự tiến hóa phân tử và phát sinh chủng loại của một số loài thú, bò sát quý hiếm của Việt Nam [26] Nhóm tác giả Vũ Thị Thu Hiền (2009) [12] đã sử dụng vùng gen tRNA-leu để phân loại cho hai loài gỗ quý thuộc chi Dalbergia….Tuy nhiên, đối với các loài tre, Việt Nam mới chỉ có tác giả Nguyễn Minh Tâm (2006) [21] sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam, . NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG XÁC ĐỊNH TÊN MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI TRE (Bambusa Schreb. ) DO BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ADN . NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG “XÁC ĐỊNH TÊN MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI TRE (Bambusa Schreb. ) DO BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ADN” .  tre (Bambusa Schreb.   Xác định tên một số loài thuộc chi tre (Bambusa Schreb. ) do biến