Kỹ thuật miccroarray TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG Báo cáo seminar: MICROARAYS Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Dung Nhóm sinh viên thực hiện: 1.Phùng Văn Dũng 61303045 2.Nguyễn Võ Kỳ Duyên 61303052 3. Cao Chí Thủy Tiên 61303328 1 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray MỤC LỤC I. Đặt vấn đề II. Giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarray III. Khái niệm về Microarray IV. Cấu tạo và phân loại Microarray V. Nguyên lý VI. Qúa trình thực hiện DNA Microarray VII. Cách tiến hành VIII. Ứng dụng IX. Kết luận X. Câu hỏi trắc nghiệm XI. Tài liệu tham khảo 2 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray I. Đặt vấn đề Trừ một vài ngoại lệ thì mọi tế bào trong cơ thể đều chứa hệ gen đồng nhất và bộ nhiễm sắc thể đầy đủ.Chỉ một phần nhỏ những gen này được bật,tuy nhiên,nó biểu thị những thuộc tính đặc trưng của mỗi loại tế bào.Sự biểu hiện gen là một quá trình chặt chẽ và phức tạp cho phép tế bào trả lời những kích thích của môi trường và những nhu cầu thay đổi của chính mình.Cơ chế này đóng cả hai vai trò bật và tắt của sự chuyển đổi để kiểm soát thông tin của những gen nào được biểu hiện trong một tế bào để có thể tăng cường hoặc giảm bớt sự biểu hiện của các gen.Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của gen trong một thí nghiệm giản đơn và hiệu quả Trong quá khứ, các nhà khoa học chỉ có thể tiến hành các phân tích di truyền của một vài gen cùng một lúc. Với sự phát triển của kỹ thuật microarrays các nhà khoa học giờ đây có thể kiểm tra hàng ngàn gen hoạt động như thế nào, ở bất kỳ thời điểm nào. Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người. II. Giới thiệu lịch sử của phương pháp Microarray Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA microarray vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên phải kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy DNA có thể bị biến tính, phân tách thành hai mạch đơn khi xử lý bằng nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình 3 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử. Điều này gợi ra cách phân tích mối liên hệ trình tự của axit nucleic và các phương pháp phân tích dựa trên lai phân tử phát triển nhanh chóng. Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson đã tìm ra phương pháp lai in situ có sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang, FISH. Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính (sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò) ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray. Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979. Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra. Với kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên vật đỡ và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu. Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991). Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu. Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ. Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể. Phương pháp tự động hoá này làm tăng tốc độ quá trình, giảm các sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí, tăng tính đồng hình của các spot mẫu. 4 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray Hình 1: Quá trình phát triển của kĩ thuật di truyên Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay. Người ta đánh giá rằng, kỹ thuật này có thể sẽ phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay. III. Khái niệm về Microarray Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của nhiều gen trong một thí nghiệm đơn giản và hiệu quả.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người. Nói về microarray, hiện nay đa số ai cũng liên tưởng đến DNA microarray vì kỹ thuật này đã được biết đến từ cuối thập niên 80, do nhóm khoa học dưới sự chủ trì của tiến sĩ Stephen P.A. Fodor phát minh. Sau đó được hãng Affymetrix (Mỹ) phát triển và phổ biến rộng khắp ở Mỹ và thế 5 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray giới. Protein microarray mới chỉ bắt đầu được để ý trong khoảng vài năm trở lại đây và chưa phổ biến như DNA microarray. Mỗi điểm trên một microarray chứa nhiều sợi giống hệt nhau của DNA.Trình tự DNA trên mỗi điểm là duy nhất.Hàng ngàn điểm được dàn trận trong hàng và cột trật tự trên một bề mặt rắn (thường là thủy tinh). Vị trí chính xác và trình tự của từng vị trí được ghi lại trong một cơ sở dữ liệu máy tín. Mỗi vị trí đại diện cho một gen. IV. Cấu tạo và phân loại Microarray 1. Cấu tạo DNA microarray hay còn gọi là DNA chip, được chế tạo trên bề mặt thủy tinh hoặc nylon hoặc silicone. Trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất . Bằng kĩ thuật tự động tốc độ cao, gồm vô số các probe (đoạn dò) đã biết trước trình tự. Probe để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo mục đích sử dụng, có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50- 120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) các chấm trên microarray thường có đường kính 200 μm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner). Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 μm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 μm. 6 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray Hình 2: kích thước cDNA 2. Phân loại a. Theo mật độ mẫu dò (mật độ thấp,cao,vừa) b. Theo loại mẫu dò (cell array, glycan array,DNA array,protein array…. V. Nguyên lý Dựa trên cơ sở kĩ thuật lai axit nucleic. Trong đó một mảnh DNA đã biết được sử dụng làm mẫu dò để tìm kiếm trình tụ bổ sung của nó. Mẫu dò được cố định trên một giá thể rắn (thủy tinh, nylon, silicone). Một hỗn hợp lỏng chứa các DNA và RNA cần dò tìm được cho chạy qua giá thể rắn. Ở điều kiện lý tưởng các axit nucleic có trình tự bổ sung sẽ bắt cặp chính xác với nhau. Trước đó mẫu DNA hay RNA đã được đánh dấu bằng : đồng vị phóng xạ , chất phát huỳnh quang . . .Khi quan sát dưới máy dò tìm đặc hiệu dễ dàng nhận diện cặp mẫu dò nào đã gắn với mẫu DNA hay RNA nào. VI. Qúa trình thực hiện DNA Microarray 7 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray Hình 3: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật microarray Qúa trình thực hiện DNA microarray gồm hai bước chính : 1. Chế tạo mảng Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ liệu cao . Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon , trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất . Giá thể thường được biến đổi 8 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò. Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine, amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò . Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò. Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo mục đích sử dụng. Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này. Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100- 3000 bp) . Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách:  cố định (cDNA) Hình 4: Mẫu dò cDNA  tổng hợp in situ (oligonucleotide). 9 Báo cáo tốt nghiệp Kỹ thuật miccroarray Hinh 5: Mãu dò tổng hợp insitu Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing (μCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (μFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai. Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (μWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ. • In kim (Contact-tip deposition printing):Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất ,Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc . 10 Báo cáo tốt nghiệp [...]... 1,28x1,28cm Báo cáo tốt nghiệp 13 Kỹ thuật miccroarray Hình 10: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt • In áp điện (Piezoelectric printing) In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in bình thường Đầu áp điện tạo ra các giọt trên đầu phân phối Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000 chấm/cm2 Báo cáo tốt... tính chất hóa học bền đồng nhất C: A&B đều đúng Báo cáo tốt nghiệp 24 Kỹ thuật miccroarray Báo cáo tốt nghiệp 25 Kỹ thuật miccroarray Báo cáo tốt nghiệp 26 Kỹ thuật miccroarray Báo cáo tốt nghiệp 27 Kỹ thuật miccroarray http://luanvan.net.vn/luan-van/de-tai-ung-dung-cac-ky-thuat-array-tronglinh-vuc-moi-truong-36635/ Báo cáo tốt nghiệp 28 ... trên các trình tự đã biết và tổng hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như PCR, tách dòng Do đó , tránh được sai số thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai dòng, cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot − Nhược điểm Báo cáo tốt nghiệp 21 Kỹ thuật miccroarray o Các trình tự được chon dưa ngân hàng gene nên có thể phải... sự phát triển và khả năng ứng dụng thần kỳ của kỹ thuật PCR X Câu hỏi trắc nghiệm Câu 1: Nguyên lý cơ bản của phương pháp Microarray A: Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung Báo cáo tốt nghiệp 23 Kỹ thuật miccroarray B:Dựa trên cơ sở kĩ thuật lai nucleic acid trong đó, một mảnh DNA đã biết... phương pháp Microarray dễ tiến hành hơn các phương pháp Southern blot, Northern blot, Western blot A: Do sử dụng chất mảng rắn B: Do quá trình thực hiện đơn giản C: Do mẫu dò đa dạng( có thể DNA, RNA, Protein, Hóa chất, Peptit) Câu 3: Tính chất cơ chất dùng để tạo mảng là? A: Gắn ổn định với mẫu dò, chất lượng dữ liệu cao B: Tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hóa học bền đồng nhất C: A&B đều đúng Báo. .. dụng chất mảng rắn nên phương pháp microarry dễ tiến hành hơn các phương pháp blot Trong quá trình lai, cho dung dịch đích đã đánh dấu đi qua mảng Ở đó mẫu dò bắt cặp bổ sung (nếu có) với đích Nếu dùng chất mảng thủy tinh, có thể úp một phiến kính thủy tinh lên trên sau đó cho dung dịch đích đi qua khe trống giũa chúng bởi lực mao dẫn Một cách đơn giản khac là đặt b) Báo cáo tốt nghiệp 18 Kỹ thuật... hóa dữ liệu o Không có khả năng định lượng o Cần lượng lớn đích −  Màng chứa mẫu dò oligonucleotide Báo cáo tốt nghiệp 20 Kỹ thuật miccroarray Các con chíp tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gen khác nhau, mỗi gen được đại diện bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 cặp mẫu dò khác nhau Do phương pháp này không sử dụng mẫu đối chứng và mẫu dò có trình tự ngắn (25-60 base) nên để tăng tính chính... deposition printing Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch Phương pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm2 In vi tiếp xúc (μCP- Micro-contact printing): Phương pháp μCP có nguyên lý tương tự in kim Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit... in vi lỏng 2 Tiến hành thí nghiệm Báo cáo tốt nghiệp 16 Kỹ thuật miccroarray CHUẨN BỊ MẪU TIẾN HÀNH LAI XÁC ĐỊNH TÍN HIỆU VÀ CHUẨN HÓA DỮ LIỆU a) Chuẩn bị mẫu Hiệu quả phân tích bằng microarray phụ thuộc đáng kể vào khâu chuẩn bị mẫu Mẫu để lai có thể là DNA hoặc RNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau khi lai Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát... trực tiếp chúng sau khi lai Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của Báo cáo tốt nghiệp 17 Kỹ thuật miccroarray các nhóm hoạt động hóa học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích Các chất chỉ thị phát . THẮNG Báo cáo seminar: MICROARAYS Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Dung Nhóm sinh viên thực hiện: 1.Phùng Văn Dũng 61303045 2.Nguyễn Võ Kỳ Duyên 61303052 3. Cao Chí Thủy Tiên 61303328 1 Báo. phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm. Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của 17 Báo. axit nucleic và các phương pháp phân tích dựa trên lai phân tử phát triển nhanh chóng. Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson đã tìm ra phương pháp lai in situ có sử dụng