ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Trung Thành Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Trung Thành, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Nguyễn Quang Thạch, TS. Nguyễn Hạnh Hoa và toàn thể tập thể cán bộ, nhân viên trong Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện về cơ sở vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ và góp ý cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Thu Thủy DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurin CT Công thức CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) ĐC Đối chứng IBA indol-3-acetic acid MS Murashige và Skoog, 1962 LSD 0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P - 0,5 (Leant Significant Difference) ND Nước dừa αNAA α-naphthylacetic acid MỤC LỤC Trang DANH MỤC BẢNG Trang DANH MỤC HÌNH Trang MỞ ĐẦU Lan huệ (Hippeastrum equestre) là một trong những loài hoa được yêu thích và rất có tiềm năng phát triển trong những năm gần đây. Lan huệ được trồng khá phổ biến để làm cảnh do màu sắc đa dạng, khả năng thương mại cao khi là hoa cắt cành hoặc được trồng trong chậu cảnh hay vào các dịp lễ, tết. Bên cạnh đó, đây còn là cây thuốc chữa bệnh vì theo đông y trong củ của nó có chứa các thành phần biệt dược có giá trị như các ankaloids (Funganti, 1975), các lectins có khả năng chống ung thư, cầm máu, chữa lành vết thương… Lan huệ ở Việt Nam hiện nay còn nghèo nàn về màu sắc (chủ yếu là màu đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại khá muộn (khoảng từ giữa tháng 3 đến cuối tháng 5) nên khả năng phát triển loài hoa này còn rất nhiều hạn chế. Bằng con đường thu thập nguồn gen, lai hữu tính và chọn lọc có thể làm phong phú bộ giống hoa Lan Huệ ở nước ta. Năm 2009 – 2010, Nguyễn Hạnh Hoa và cs đã chọn tạo ra hàng loạt con lai có màu sắc lạ, đẹp, đa dạng, hoa có độ bền lâu và có thời gian ra hoa đáp ứng đúng thị trường. Điển hình là các dòng H2, H4, H9, H10, H18. Tuy nhiên các dòng lai này lại có nhược điểm là sinh sản vô tính kém (trong điều kiện tự nhiên), đặc biệt là các dòng lai H2, H4 và H18. Do vậy, những cá thể lai có đặc điểm ưu tú được chọn lọc cần phải nhân giống vô tính nhằm duy trì được tính trạng ban đầu.Từ nhiều năm nay, để nhân giống vô tính cây Lan huệ có thể sử dụng các phương pháp: Tách chồi hoặc củ nhỏ từ cụm cây mẹ (Siddique và cs., 2007); kỹ thuật cắt lát (Chipping); nhân giống bằng hạt hoặc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro (Husey, 1975; Seabrook và cs., 1976; De Buruyn, 1992; Chieh Li Huang và cs., 2005). Mặc dù đơn giản nhưng hiệu quả khi nhân giống bằng phương pháp truyền thống không cao do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp, cây không đồng nhất cũng như không tạo được cây sạch bệnh. Phương pháp nhân giống in vitro đã khắc phục được những nhược điểm đó tạo được cây con sạch bệnh, thời 7 gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất, do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao và tính di truyền ổn định. Để đánh giá và duy trì nguồn vật liệu thì việc nghiên cứu nhân giống vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết. Ở nước ta, Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2009,2010) đã bước đầu xác định được một số kết quả nhất định để xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro hoa Loa kèn đỏ nhung (H. equestre Herb.) và cây Lan huệ mạng (H. reticulatum var. striatifolium). Bên cạnh việc kế thừa một số kết quả trên cần phải có những nghiên cứu tiếp theo nhằm bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây hoa Lan huệ để nhân nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống. Xuất phát từ những yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề tài:“Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ lai (Hippeastrum equestre)”. 8 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây Lan huệ 1.1.1 Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ Lan huệ có tên khoa học: Hippeastrum esquetre Herb, thuộc họ Liliaceae, bộ Hành ( Liliales), phân lớp Hành ( Liliidae), lớp thực vật một lá mầm (Liliopsida) [3],[4]. Tên của loài hoa này có rất nhiều cách để Việt hóa như: Loa kèn đỏ nhung, Lan huệ, Huệ đất, Lan tứ diện, Tứ diện, Tứ diện xích lan, Huệ loa kèn, Mạc chu lan Người châu Âu gọi là Valentine Flower bởi vì Lan huệ nở hoa trong khoảng đầu năm vào dịp lễ hội tình yêu (14/2). 1.1.1.1 Đặc điểm thực vật học của cây Lan huệ ở Việt Nam: Lan huệ có dạng thân hành, hình cầu, có áo mỏng bao ở ngoài [5]. a. Lá cây Lá tập trung ở gốc gần như thành 2 dãy, phiến lá hình dải, màu xanh đậm, kích thước (30)45-50(60) x 2-4(5)cm, hình kiếm hoặc hình dải mác, hơi khum thành hình máng, dai, cứng, có nhiều gân sọc song song và gân phụ ngang song song, mép hơi cong xuống, chóp tù. Gốc lá dạng bẹ ôm lấy nhau. Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm 2 cái, mỏng, kích thước 6-7 x 3-4 cm, màu trắng xanh, mỏng, 2 chiếc, tồn tại. b. Hoa Cụm hoa tán, 2- 4 hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, dài 30- 50 cm, đường kính 1,5-2 cm ,thẳng đứng và rỗng, mặt ngoài phủ phấn trắng. Hoa to khi nở đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ, màu đỏ hoặc đỏ cam, có cuống dài 4-5 cm, gốc màu xanh hoặc xanh vàng hoặc vàng trắng. Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh, dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5 cm, họng có 1 vòng vảy ngắn hoặc 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình trứng xếp 2 vòng, các thùy bằng nhau hoặc các thùy vòng trong hẹp hơn. Nhị 6; chỉ nhị rời nhau, hình trụ dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống 9 bao hoa, nghiêng về một phía; bao phấn hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng ngà,2 ô, đính lưng , hướng trong, mở bằng khe dọc. Bầu hoa, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhụy dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy, màu trắng. Hình 1.1: Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) c. Củ và rễ Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ mẹ, chu vi của củ con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây. Rễ:cây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ tương đối đồng đều về kích thước. d. Quả Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh. Hạt nhiều, dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ. 1.1.1.2 Yêu cầu ngoại cảnh Cây Lan huệ mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, được nhập vào Việt Nam, trồng trong vườn hoa, trong chậu. Cây ra hoa vào mùa xuân- hè, do đó để hoa nở vào đúng dịp Tết thì các yếu tố ngoại cảnh là điều kiện vô 10 [...]... biệt, chưa có nghiên cứu nào nhằm xây dựng quy trình nhân giống chuẩn cho các dòng Lan huệ lai nhập ngoại và nội Do đó, việc nghiên cứu nhân giống in vitro các dòng Lan huệ lai để làm cơ sở xây dựng quy trình nhân giống từ các nguồn vật liệu nuôi cấy khác nhau là rất cần thiết 35 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1 Đối... là tái sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương thức chung cho tất cả các thực vật 19 1.2.3.3 Các phương thức nhân giống in vitro Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính Trong nhân giống in vitro, cây con có thể được tái sinh từ các điểm sinh trưởng... một phương pháp nhân giống vô tính Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do: Các phương pháp nhân giống hữu tính... sinh ở các nồng độ chất điều tiết sinh trưởng khác nhau Thậm chí một số cây con cũng phát sinh trong trường hợp không có chất điều tiết sinh trưởng Cây con cũng cảm ứng phát sinh rễ ngay vào trong môi trường tổng quát mà không cần tới chất đặc biệt nào được yêu cầu [13] Hussey G., 1975 cũng đã nghiên cứu nhân giống in vitro trên một số giống cây trong đó có Hippeastrum, ông chỉ ra rằng có thể nhân in. .. Chồi và củ in vitro tiếp tục được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh và cũng thu được kết quả rất tốt Các cây con in vitro sau đó được đưa ra môi trường, tỷ lệ sống sót cao, cây con sinh trưởng khoẻ mạnh Qua đó ta thấy, dù có rất nhiều thuận lợi trong nghiên cứu nhân giống nhưng chưa có nhiều nghiên cứu sâu về nhân giống Lan huệ để duy trì nguồn gen chọn lọc, ưu tú phục vụ công tác chọn tạo giống Đặc... cây Lan huệ 1.2.3 Phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp này có ưu điểm là tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên cây có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao Đồng thời, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất do 15 vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định, có thể cung ứng cho sản xuất trên quy mô rộng Đã có một số nghiên cứu. .. tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như: - Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào - Tính... CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng Đối tượng nghiên cứu: 05 dòng lai cây Lan huệ (Hispeastrum esquestre) Kí hiệu các dòng lai lần lượt là: H2, H4, H9, H10, H18 Các dòng lai là kết quả của phép lai hữu tính giữa các dòng bố mẹ sau: Ký hiệu dòng Nguồn gốc Lan Huệ lai tổ hợp lai H2 ♂ Đỏ nhung X Màu sắc ♀ Đỏ sọc trắng H4 ♂ Đỏ Nhung X ♀ Trắng 36 ... quả cao hơn nhiều so với sử dụng các bộ phận khác [6] Năm 2009, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Hạnh Hoa, Nguyễn Thị Phương Thảo đã bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro cây hoa loa kèn đỏ nhung (Hippeastrum equestre Herb) nhằm tìm ta các thông số kỹ thuật thích hợp cho quy trình nhân giống in vitro loài này Nghiên cứu cho những kết quả bước đầu khi xác định bộ phận vào mẫu tốt nhất... cho hệ số nhân chồi cao nhất Trên môi trường chứa 0,2 mg/l α- NAA, 91,67% các chồi ra rễ, sốlượng rễ nhiều, chất lượng tốt [10] 34 Nguyễn Hạnh Hoa, Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự năm 2010 đã nghiên cứu nhằm tìm ra các thông số thích hợp hướng tới nhân giống in vitro cây Lan huệ mạng (Hispeastrum reticulatum var striatifolium) [11] Trên môi trường nền MS có bổ sung BA mẫu tái sinh chồi và củ in vitro . KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI. HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ LAI (HIPPEASTRUM EQUESTRE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC. nhân giống in vitro cây hoa Lan huệ để nhân nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống. Xuất phát từ những yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu nhân giống in vitro