Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề 1 Phần I.Tổng quan 2 1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.2. Thành phần hoá học 2 1.3. Độc tính và tác dụng sinh học 4 Phần II. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 5 2.1. Nguyên liệu 5 2.2. Phương pháp nghiên cứu 5 Phần III. Thực nghiệm và kết quả 7 3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 7 3.1.1. Đặc điểm hình thái cây lá ngón 3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của rễ, thân, lá 3.1.3. Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây Lá ngón 3.2. Nghiên cứu thành phần hoá học 3.2.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học 3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 3.2.3. Định lượng Alcaloid toàn phần 3.2.4. Chiết xuất và phân lập Alcaloid Phần IV. Kết luận và đề nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục 1 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lá ngón (Gelsemium elegans Benth.) là một loài cây độc mọc hoang ở nhiều vùng núi Việt Nam. Lá, thân, rễ đều có chất độc có thể gây chết người. Gần đây có nhiều trường hợp tử vong do sử dụng nhầm các bộ phận của cây lá ngón [10]. Để góp phần kiểm định dược liệu và tiến tới giám định các vụ ngộ độc do cây lá ngón, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của cây lá ngón Gelsemium elegans Benth., Loganiaceae ” với các nội dung sau: Về mặt thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, định tên khoa học mẫu nghiên cứu. - Xác định đặ điểm vi phẫu: rễ, thân, lá. - Xác định đặc điểm bột rễ, bột thân, bột lá. Về thành phần hoá học - Định tính các nhóm chất hữu cơ trong rễ, thân, lá. - Định tính alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng. - Định lượng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá. - Chiết xuất và phân lập alcaloid chính. - Nhận dạng alcaloid phân lập được. PHẦN I TỔNG QUAN 2 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 1.1. Đặc điểm thực vật Cây lá ngón có tên khoa học là: Gelsemium elegans (Benth.), họ Mã tiền (Loganiaceae). Ở một số vùng của Việt Nam nó còn có tên là Co ngón (Lạng Sơn), thuốc dút ruột, Hồ mạn đằng, Câu vẫn, Đoạn trường thảo. Cây lá ngón là một loại cây mọc leo, thân và cành không có lông, gỗ có màu vàng. Thân cây có khía dọc, lá mọc đối hình trứng thân dài hay hơi hình mác, đầu nhọn, phía cuối nhọn hay hơi tù, mép nguyên, bóng, nhẵn, dài 7 - 12cm, rộng 2,5 - 5,5 cm. Hoa mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá. Cánh hoa mầu vàng, đài 5, lá đài rời. Tràng gồm 5 cánh hoa nhẵn, dính thành ống hình phễu, nhị 5 đính ở phía dưới ống tràng, bầu chẵn, vòi dạng sợi. Đầu nhụy 4 thùy hình sợi. Quả nang có vỏ cứng dai, mầu nâu hình thon dài 1cm rộng 0,5cm hạt nhỏ quanh mép có rìa mỏng màu nâu nhạt, hình thận.[1],[3], [5],[9],[12] Cây lá ngón phân bố khá phổ biến ở nhiều miền rừng núi Việt Nam. Từ Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Lào Cai, Lạng Sơn, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hoà Bình, đến các tỉnh Tây Nguyên. Ngoài ra, cây lá ngón còn mọc ở một số nước nhiệt đới. Ở Trung Quốc, lá ngón có mặt ở các tỉnh Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây. Ở Bắc Châu Mỹ có loài Gelsemium Sempervirens. Art.[4],[9],[12] 1.2. Thành phần hoá học Theo các tài liệu của Đỗ Tất Lợi [12],Võ Văn Chi [4], Vũ Văn Chuyên [5], Trần Công Khánh [9], thì cây lá ngón có chứa nhiều alcaloid khác nhau, cụ thể là: Từ loài cây ngón mọc ở Bắc châu Mỹ, G. Sempervirens đã chiết ra được nhiều loại alcaloid như: gelsemin (C 20 H 22 O 2 N 2 ), gelmixin (C 19 H 24 O 3 N 7 ), chất sempervirin và sempervin… tất cả đều có độc tính rất mạnh. 3 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Ở Trung Quốc năm 1931 người ta đã nghiên cứu rễ, thân rễ, cành của cây lá ngón Trung Quốc (Gelsemium elegans) đã chiết xuất được 4 loại alcaloid có tính chất và đặt tên là: + Kumin (C 20 H 22 ON 2 ): dễ tan trong cồn, khó tan trong ether, không tan trong nước. Tan trong nước acid. Đây là thành phần chủ yếu của cây chất này không độc lắm. + Kuminin: vô định hình không màu, dễ tan trong ether và nhiều dung môi hữu cơ, khó tan trong nước, tan trong nước acid. + Kuminixin: là chất vô định hình. + Kuminidin: có tinh thể hình trụ, không màu, tan nhiều trong các dung môi hữu cơ và nước. Tỷ lệ cả 4 loại alcaloid trên là 0,3%. Vào năm 1936 F.Guichard nghiên cứu từ cây lá ngón mọc ở Việt Nam đã chiết từ lá, vỏ thân và rễ được những chất giống như lá ngón Trung Quốc. Tác giả đã thấy chất kumin có cả trong quả và hạt, ngoài ra còn tìm thấy một chất có huỳnh quang dưới đèn tử ngoại, không tan trong acid và ghi là chất thuộc nhóm esculetin. [12] Năm 1953 M.M Janot xác định lá ngón Việt Nam có chứa gelsemin ở lá, kumin ở thân, rễ và sempervinrin ở các bộ phận của cây. Năm 1971 Phan Quốc Kinh, Phạm Gia Khôi và Lương Văn Thịnh chiết được kumin từ rễ cây lá ngón mọc ở Hoà Bình.[1] Hoàng Như Tố đã phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thấy có 15 vết Alcaloid ở cây lá ngón trong đó đã tách được gelsemin và kumin.[1] 4 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 N O O N CH 3 H N N H + Gelsemin Sempervirin 1.3. Độc tính và tác dụng sinh học Cây lá ngón là một loại cây rất độc, không được nhân dân ta dùng làm thuốc mà chỉ dùng với mục đích tự tử hay đầu độc. Nhưng ở Trung Quốc người dân lại hay dùng làm thuốc chữa hủi hay chữa bệnh nấm tóc [12]. Theo Võ Văn Chi, [4], thì cây lá ngón có thể dùng làm thuốc, bộ phận dùng là rễ, thân, lá. Nó có vị cay, đắng, tính nóng, rất độc có tác dụng thanh nhiệt, tiêu thũng, hạt có độc, giảm đau, sát trùng, chống ngứa. Có công dụng là: điều trị eczema, nấm ở chân, ở thân, đòn ngã tổn thương, đụng giập, trĩ, tràng nhạc, đinh nhọt và viêm mủ da, điều trị phong hủi. Giã cây tươi đắp ngoài hoặc nấu nước rửa ngoài mà không được dùng uống trong.[4] Trong cây lá ngón mọc ở Bắc Mỹ: thành phần chủ yếu là chất gelmixin, có độc tính rất mạnh. Với liều thấp trên động vật có vú, trước khi thấy hiện tượng ức chế hô hấp thường thấy một thời kỳ hưng phấn ngắn.[12] Trong cây lá ngón của ta và Trung Quốc có thành phần khác nhưng so với tác dụng của những alcaloid của cây lá ngón Bắc Mỹ thì nhiều phần giống nhau. Chất kumin và kuminin ít độc hơn, gần giống tác dụng của gelsemin. Chất kuminixin rất độc, nhưng chất gelsemixin lại độc hơn nữa. Nhỏ dung dịch gelsemin và gelsemixin lên mắt thì thấy hiện tượng giãn đồng tử còn kumin và kuminin không làm giãn đồng tử.[12] 5 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Ngoài thành phần hoá học, Hoàng Như Tố còn kiểm tra truyền thuyết dân gian nói: “chỉ ăn 3 lá là đủ chết người" đồng thời tìm cơ chế tác dụng của lá ngón để tìm cách chống độc có hiệu quả đã đi tới một số kết luận sau: - Liều độc: LD50 đối với chuột nhắt trắng của rễ là 102mg/kg thể trọng (chiết bằng cồn 90 0 ), của lá là 600mg/kg (dược liệu tươi chiết bằng nước), 200mg/kg (lá khô chiết bằng nước), 150mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 70 0 ), 89mg/kg (lá khô chiết bằng cồn 90 0 ), của alcaloid toàn phần chiết từ lá khô là 200mg/kg, trong khi đó của gelsemin là 140mg/kg và kumin thì không độc. Như vậy, lá ngón có độc nhưng không đến mức 3 lá đủ chết người như dân gian thường nói. - Tác dụng độc của lá ngón không đặc hiệu trên hệ thống thần kinh, gây nên co giật và chết do ngừng hô hấp trong một trạng thái thiếu oxy rõ rệt. - Nghiêu cứu về mặt chống độc, cho phép kết luận cơ chế tác dụng của các hoạt chất cây lá ngón chủ yếu đánh vào các men hô hấp, gây sự rối loạn trong tế bào dẫn tới sự thiếu oxy nghiêm trọng gây nên tình trạng co giật cơ và liệt cơ. Phương hướng dùng các thuốc ngăn cản sự ức chế men và bảo trợ men đã dẫn tác giả tìm ra được tính chống độc của ATP. Khi dùng ATP để ngăn ngừa cũng như để điều trị ngộ độc bằng lá ngón đã giảm tỷ lệ chết của chuột nhắt trắng từ 58% xuống còn 25%, đã cứu được tất cả các thỏ làm thí nghiệm khi đã bị ngộ độc bằng liều chết của lá ngón.[12] Dù đã nghiên cứu như vậy nhưng việc phát hiện các chất độc trong cơ thể khi bị ngộ độc lá ngón còn rất khó khăn, vì phản ứng được tiến hành trên những chất lấy được ở cơ thể người bị ngộ độc là một việc không phải dễ dàng.[12] 6 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Chất độc chính trong cây lá ngón là các alcaloid như gelsemin, kumidin và kumin có trong toàn cây, độc nhất là ở rễ và lá non. Ngộ độc với triệu chứng như khát nước, sốt, đau rát họng, đau bụng, nôn mửa, hoa mắt răng cắn chặt, sùi bọt mép, hạ thân nhiệt, hạ huyết áp, hô hấp chậm rồi chết. Cách giải độc: Phải nhanh chóng loại chất độc ra khỏi cơ thể bằng cách gây nôn và rửa ruột (nôn ra sớm thì sống, chậm thì chết).[9] Theo kinh nghiệm truyền thống thì cho uống thật nhiều nước sắc cam thảo. Tiêm truyền huyết thanh mặn hay ngọt, giữ cơ thể ấm. Nếu hạ huyết áp thì dùng ephedrine, khó thở thì dùng niketamid cho thở oxy hoặc hô hấp nhân tạo, đau bụng thì dùng thuốc giảm đau.[9] 7 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 PHẦN II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu - Nguyên liệu là rễ, thân và lá của cây lá ngón có hoa thu hái tại xã An Châu, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang vào tháng 02/2003. - Nguyên liệu sau khi thu hái được thái nhỏ sấy khô ở nhiệt độ 40-50 0 C sau đó được bảo quản trong túi bóng lớn, kín. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu về mặt thực vật học - Quan sát hình thái bên ngoài bằng cảm quan theo tài liệu [1],[2], [12]. - Cắt và quan sát vi phẫu: Rễ, thân, lá trên kính hiển vi quang học tại bộ môn dược liệu theo tài liệu thực tập [2],[8]. - Soi bột và mô tả các đặc điểm của bột rễ, thân, lá theo tài liệu [2], [8],[13]. 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học trong cây lá ngón - Định tính các nhóm chất trong rễ, thân và lá cây. [1],[2] - Định lượng alcaloid trong cây theo phương pháp acid base.[2] - Xác định độ ẩm trên máy Sartorius ( Germany) tại bộ môn dược liệu. - Đo phổ UV trên máy tại Viện kiểm nghiệm Bộ y tế. - Đo phổ IR trên máy tại Phòng Hoá, Viện khoa học hình sự. - Đo phổ khối trên máy 5989B MS tại Phòng cấu trúc Viện hoá học. - Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân trên máy tại 8 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 - Đo độ chảy trên máy GALLENKAMP tại bộ môn hoá hữu cơ. PHẦN III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Đặc điểm thực vật 3.1.1. Đặc điểm hình thái cây lá ngón Cây bụi leo mọc ở ven rừng, thân nhỏ hoặc vừa không có lông, lá mọc đối, hình trứng thuôn dài hay hơi hình mác, đầu nhọn phía cuống lá nhọn, mép nguyên, bóng, nhẵn, dài 10cm, rộng 5cm, mặt trên của lá mầu sẫm, mặt dưới mầu nhạt hơn, gân lá hình lông chim, có từ 4-7 cặp gân phụ, cuống lá dài 1cm. Hoa nhỏ mọc thành xim ở đầu cành hay ở kẽ lá, bao hoa mầu phớt tím, cánh hoa mầu vàng. Mẫu chúng tôi nghiên cứu đã được GS. Vũ Văn Chuyên định tên khoa học là: Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae. 9 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của lá, thân và rễ ∗ Cấu tạo giải phẫu lá: Hình 2 Mặt cắt ngang có dạng đối xứng hai bên, lá được chia làm hai phần chính, phiến lá và gân lá. - Gân lá: Mặt dưới lồi, mặt trên phẳng hơi lõm. Biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình trứng kích thước tương đối lớn xếp đứng, biểu bì dưới tế bào có dạng hình tròn và nhỏ hơn. Mô dày gồm những lớp tế bào tròn, thành dày xếp sát biểu bì trên và biểu bì dưới. Mô mềm cấu tạo từ những tế bào tròn hình mỏng xếp lộn xộn. Cung libe gỗ ở giữa gân lá. Có libe bao quanh cung gỗ. - Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới cấu tạo bởi những tế bào tròn xếp đều đặn thành hàng, tế bào ở phía trên to hơn ở phần biểu bì dưới. Hầu như không quan sát thấy mô dậu. Ngay dưới lớp biểu bì là mô khuyết, các tế bào xếp lộn xộn có nhiều khuyết nhỏ. 10 [...]... hiện khoá luận tốt nghiệp, nghiên cứu alcaloid cây lá ngón tại bộ môn dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội Chúng tôi đã thu được kết quả sau: * Về đặc điểm thực vật: - Đã quan sát mô tả được đặc điểm thực vật của cây nghiên cứu và Giáo sư Vũ Văn Chuyên đã định tên khoa học là: Gelsemium elegans (Benth.), Loganiaceae - Đã xác định đặc đIểm vi phẫu rễ, thân, lá và đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây lá ngón. .. ngón nghiên cứu góp phần tiêu chuẩn hoá dược liệu • Về thành phần hoá học: • Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong ba bộ phận rễ, thân, lá của cây lá ngón có alcaloid, saponin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol Bằng sắc kí lớp mỏng và sử dụng hệ dung môi thích hợp đã phát hiện được 8 vết alcaloid trong rễ và thân, 4 vết alcaloid trong lá • Đã định lượng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá. .. mềm Nhận xét: Các bộ phận của cây lá ngón có một số đặc điểm vi học đặc trưng: - Giải phẫu lá: lớp tế bào biểu bì ở phần gân trên của lá có hình trứng, xếp đứng, kích thước lớn hơn các tế bào biểu bì phiến lá, libe bao quanh bó 13 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 gỗ Bột lá có các mạch xoắn, các tế bào ở phần phiến lá có chất tế bào tạo thành khối giống tinh thể... Chi,( 1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr 644 –645 5 Vũ Văn Chuyên, Tóm tắt họ thực vật, Nhà xuất bản Y học 6 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu,(1985) Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, tr 376 –398 7 Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam tập 2, Nhà xuất bán Y học, tr 288– 289 8 Trần Công Khánh,(1981) Thực tập giải phẫu và hình thái thực vật, Nhà xuất bản KHKT... trong lá có 0,169% alcaloid toàn phần trong bột dược • Đã phân lập được 1 alcaloid tinh khiết trong rễ cây lá ngón Căn cứ vào phổ UV, phổ IR, phổ khối, phổ NMR Chúng tôi sơ bộ nhận dạng V 2 là kumin 29 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 4.2 Đề nghị: Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu.công trình nghiên cứu này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hoá học. .. 0,270 0,315 Vàng nhạt 0,315 0,342 0,387 Vàng 0,384 0,423 Vàng 0,423 0,459 Vàng nhạt 0,458 0,514 Vàng 0,514 SẮC KÝ ĐỒ 22 Lá Màu Rf Vàng Vàng 0,270 0,314 Vàng nhạt Vàng nhạt 0,457 0,513 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Nhận xét 3.2.3 Định lượng alcaloid toàn phần: 3.2.3.1 Định lượng alcaloid toàn phần trong rễ, thân, lá của cây lá ngón bằng phương pháp acid base Bột... từ vàng đến vàng đậm So sánh thấy hệ dung môi II tách tốt vì số lượng các vết xuất hiện nhiều và khoảng cách các vết ở xa nhau hơn Kết quả sắc ký khai triển với hệ dung môi II được trình bày ở sắc ký đồ 1 và ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết quả SKLM ST T V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 Rễ Màu Vàng nhạt Vàng đậm Vàng Vàng nhạt Vàng Vàng Vàng đậm Vàng Thân Rf Màu Rf 0,045 Vàng nhạt 0,044 0,270 Vàng đậm 0,270 0,315 Vàng... phẫu thân và rễ: Mô mềm vỏ của thân có nhiều sợi gỗ thành dầy, khoang hẹp, còn ở rễ thì hầu như không có sợi gỗ ở mô mềm vỏ Các tia ruột màng hoá gỗ chia gỗ ra từng bó ở phía ngoài, mô gỗ ở phía trong liên tục, tinh thể canxi oxalat hình khối phân bố nhiều ở phần tia ruột cạnh libe của thân Bột thân và rễ có nhiều tế bào màng hoá gỗ kích thước lớn và các sợi gỗ 3.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 3.2.1... các mạch gỗ lớn, xếp trong mô gỗ bị các tia ruột thành dầy hoá gỗ chia ra tầng bó vào gần đến tâm Mô gỗ phía trong liên tục và không có mô mềm ruột 3.1.3 Mô tả đặc điểm bột rễ, thân, lá của cây lá ngón 12 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Hình 5 ∗ Bột lá: mầu xanh lục, mùi hắc Soi kính hiển vi nhận thấy có các đặc điểm sau: - Các mảnh mô mềm - Các mảnh mạch - Các... cắt rễ tròn từ ngoài vào trong có: - Lớp bần: Gồm ba đến bốn hàng tế bào xếp thành dẫy đồng tâm và xuyên tâm, có nhiều chỗ đã bị bong ra - Mô mềm vỏ: Phần này của rễ mỏng hơn so với ở thân, được cấu tạo bởi những tế bào có thành mỏng Không có các bó sợi và tế bào hoá gỗ trong mô mềm vỏ - Libe: Xếp thành từng bó, bên ngoài libe không có các sợi thành dầy hoá gỗ như ở phần thân cây - Gỗ: Có các mạch . pháp nghiên cứu 5 Phần III. Thực nghiệm và kết quả 7 3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật 7 3.1.1. Đặc điểm hình thái cây lá ngón 3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu của r , thân, lá 3.1.3. Mô tả đặc. của cây lá ngón [10]. Để góp phần kiểm định dược liệu và tiến tới giám định các vụ ngộ độc do cây lá ngón, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của. của cây lá ngón Gelsemium elegans Benth. , Loganiaceae ” với các nội dung sau: Về mặt thực vật: - Mô tả đặc điểm thực vật, định tên khoa học mẫu nghiên cứu. - Xác định đặ điểm vi phẫu: r , thân,