1 A. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Tính cấp thiết của luận án Ô đầu, Phụ tử là những vị thuốc quý, đã được dùng khá phổ biến trong Y Dược học cổ truyền. Hiện nay trên thế giới, đang có những nghiên cứu về chi Aconitum L. nhằm phát triển các sản phẩm theo hướng hiện đại, nâng cao hiệu quả sử dụng các loài thuộc chi này trong phòng và điều trị bệnh. Ở Việt Nam, cây Ô đầu được trồng nhiều ở huyện Quản Bạ, Đồng Văn, tỉnh Hà Giang và được người dân địa phương sử dụng theo kinh nghiệm làm thuốc chữa bệnh đau nhức xương khớp hoặc nấu cháo ăn để tăng cường sức khoẻ. Hàng năm nước ta có nhiều vụ ngộ độc do sử dụng nhầm lẫn, đầu độc bằng dược liệu, chế phẩm có nguồn gốc từ cây Ô đầu. Do đó cần có tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu và phương pháp xác định nhanh nguyên nhân gây ngộ độc cây Ô đầu. Theo quyết định phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030 của Thủ Tướng Chính phủ, cây Ô đầu được quy hoạch trồng tại tỉnh Hà Giang. Để phát triển vùng trồng cây Ô đầu một cách bền vững, cần có nghiên cứu theo hướng ứng dụng trong Y Dược học hiện đại, góp phần phát triển sản phẩm từ cây Ô đầu, nhằm tạo đầu ra cho cây Ô đầu Hà Giang. Để đóng góp về mặt khoa học, thực tiễn và góp phần giải quyết những vấn đề nêu trên, luận án với tên đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx.) trồng ở tỉnh Hà Giang” được thực hiện. 2 2. Mục tiêu và nội dung chính của luận án 2.1. Mục tiêu luận án + Xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang. + Nghiên cứu thành phần hóa học: định tính, định lượng nhóm chất, chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hoá học các chất phân lập được. + Đánh giá độc tính cấp và thử một số tác dụng sinh học của một số phân đoạn dịch chiết từ cây Ô đầu để gợi mở hướng sử dụng dược liệu này. 2.2. Nội dung chính của luận án + Xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang bằng phương pháp phân tích đặc điểm hình thái và phương pháp giải trình tự gen ADN. + Định tính, định lượng, chiết xuất, phân lập nhóm chất alcaloid, flavonoid, polysacharid từ cây Ô đầu. + Thử độc tính cấp của các phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid, flavonoid, polysaccharid. + Thử tác dụng giảm đau của phân đoạn chứa alcaloid có độc tính thấp, tác dụng tăng cường miễn dịch của phân đoạn dịch chiết chứa polysaccharid, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn dịch chiết chứa flavonoid 3. Những đóng góp mới của luận án * Về thực vật: - Đã áp dụng phương pháp giải trình tự gen ADN để xác định được tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang là: Aconitum carmichaeli Debx. 3 * Về hóa học: - Đã áp dụng phương pháp ICP-MS xác định được hàm lượng 12 kim loại nặng (Pb, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Ag, As) trong Ô đầu, Phụ tử - Đã chiết xuất phân lập được 5 alcaloid, 4 flavonoid, 2 sitosterol và 5 chất nhóm acid béo, este. Trong đó có 2 chất mới là: 5,7,3 ' - trimethoxyquercetin 3-O-β-D-fructofuranosid và (Z)-3- hydroxypentan-2-yl-10-aminooctacos-9-enoat. Các chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Aconitum là: acid 9-chlorooctadecanoic, acid 3- chloroicosanoic, acid 8-chlorohexadecanoic, 3-hydroxypropane-1,2- diyl dihenicosanoat, 7,4′-O-dimethylluteolin 5-O-[α-L- arabinofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid], quercetin 3-O-  -L- rhamnopyranosid, quercetin 3-O-β-D-galactopyranosid * Về độc tính cấp và tác dụng sinh học: - Đã xác định được LD 50 của 2 phân đoạn dịch chiết chứa alcaloid là: 991.36 ± 176.78 (mg/kg) và 27.257 ± 7.071 (mg/kg) - Đã xác định ở liều tối đa chuột có thể uống 12g phân đoạn dịch chiết chứa flavonoid/kg và 15 g phân đoạn chứa polysaccharid/kg tể trọng chuột mà không có chuột nào chết. - Phân đoạn alcaloid (PĐ E) chiết xuất từ Phụ tử với liều 12.5 mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày uống trong 3 ngày liên tục, thấy có tác dụng giảm đau thông qua kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ, làm tăng khoảng cách gây phản xạ đau và làm giảm số cơn quặn đau ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô chứng. - Phân đoạn polysaccharid (PĐ I) chiết xuất từ Phụ tử với liều 100 mg/kg và 300 mg/kg thể trọng chuột, thấy có tác dụng kích thích 4 miễn dịch thông qua mẫu thử làm tăng phục hồi số lượng bạch cầu, tăng nồng độ cytokine IL-2, nồng độ globulin miễn dịch và hạn chế một phần tổn thương trên giải phẫu vi thể tổ chức lympho. - Phân đoạn flavonoid (PĐ C) chiết từ lá với liều 30mg/kg thể trọng chuột thấy có tác dụng chống viêm gan cấp và chống oxy hóa thông qua làm giảm hoạt độ enzym (39.23 %) và làm giảm hàm lượng MDA trong gan (15.96 %) so với lô chứng. 4. Ý nghĩa của luận án Luận án có những ý nghĩa về mặt khoa học và thực tế như sau: + Xác định tên khoa học của cây giúp khẳng định rõ nguồn gốc dược liệu, góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu. + Giám định tên khoa học của cây bằng phương pháp giải trình tự gen ADN, đây là phương pháp mới được áp dụng tại Việt Nam có độ chính xác, độ tin cậy cao. + Chiết xuất, phân lập các chất, xác định hàm lượng nhóm chất góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu, xác định nhanh nguyên nhân gây ngộ độc có phải do Ô đầu, Phụ tử hay không. + Phân lập được 2 chất mới trong tự nhiên và một số chất mới với chi Aconitum, với loài, góp phần bổ sung vào bộ dữ liệu của cây và của chi, tạo thuận lợi cho những nghiên cứu ứng dụng sau này. + Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp cho thấy mức độ độc và góp phần định hướng sử dụng các phân đoạn này. + Kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học khẳng định thêm những tác dụng chưa được nghiên cứu hoặc ứng dụng nhiều, minh chứng rõ hơn về công dụng của Ô đầu, Phụ tử dùng trong Y học cổ truyền, gợi mở hướng sử dụng trong Y Dược học hiện đại. 5 Kết quả của đề tài luận án góp phần thúc đẩy việc trồng và phát triển cây Ô đầu tại tỉnh Hà Giang, từ đó nâng cao đời sống nhân dân địa phương. 5. Bố cục luận án Luận án gồm 4 chương, 40 bảng, 47 hình, 153 tài liệu tham khảo, 23 phụ lục. Luận án có 124 trang gồm các phần chính: Đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (27 trang), nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (13 trang), kết quả nghiên cứu (57 trang), bàn luận (23 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang). B. NỘI DUNG LUẬN ÁN Chƣơng 1. TỔNG QUAN Đã tập hợp và trình bày có hệ thống các kết quả nghiên cứu từ trước tới nay về thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Aconitum trên thế giới và ở Việt Nam. Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu Thu hái mẫu cây Ô đầu trồng ở huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang. Lấy củ mẹ, củ con khi cây đã ra quả và lụi. Lấy lá cây khi cây mới ra quả. Nguyên liệu được sấy khô ở 60 0 C, bảo quản trong túi polyetylen kín, khô ráo. Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thuần chủng cả 2 giống khoẻ mạnh, khoảng 06 tuần tuổi, trọng lượng khoảng 20± 2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp. 6 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu về thực vật: Phân tích đặc điểm hình thái thực vật, chiết và phân tích ADN, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen của loài thuộc chi Aconitum. Nghiên cứu về hóa học: - Định tính các nhóm chất hữu cơ. - Định lượng alcaloid toàn phần theo phương pháp acid-base - Định lượng aconitin bằng phương pháp HPLC - Định lượng flavonoid toàn phần và polysacharid toàn phần bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến - Xác định hàm lượng các kim loại nặng trong mẫu Ô đầu, Phụ tử bằng phương pháp đo phổ ICP-MS - SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60GF 254 . Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 0.040-0.063 mm, 0.063-0.200 mm, Merck) và silica gel pha đảo YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex G100 . - Xác định cấu trúc các chất phân lập dựa trên thông số vật lý và các phương pháp phổ gồm: điểm chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và 2 chiều Nghiên cứu tác dụng sinh học: - Đánh giá độc tính cấp của các phân đoạn dịch chiết trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon và phương pháp Bliss. - Đánh giá tác dụng giảm đau của phân đoạn chứa alcaloid trên chuột 7 nhắt trắng bằng phương pháp Koster, mâm nóng và máy tail-flick. - Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch của phân đoạn chứa polysaccharid trên mo hình gây suy giảm miễn dịch cấp bởi cyclophosphamid - Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của phân đoạn chứa flavonoid trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm bằng CCl 4 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật - Căn cứ vào kết quả phân tích đặc điểm hình thái, khóa phân loại thực vật chí Trung Quốc (2001) và giải trình tự gen ADN, so sánh với ADN của loài thuộc chi Aconitum để xác định tên khoa học cây Ô đầu ở Hà Giang là: Aconitum carmichaeli Debx. 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 3.2.1. Xác định thành phần hóa học - Định tính các nhóm chất hữu cơ: đã xác định trong cây có các nhóm chất chính là alcaloid, flavonoid, polysaccharid, ngoài ra còn có một số nhóm chất khác: acid béo, este, sterol… - Định lượng các nhóm chất alcaloid, flavonoid, polysaccharid: + Áp dụng phương pháp acid-base để xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong Ô đầu, Phụ tử cùng 2 phân đoạn D, E chiết từ Phụ tử cho kết quả lần lượt như sau: 0.93 %, 0.70 %, 28.61 %, 26.83 % tính theo aconitin. + Áp dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng aconitin trong Phụ tử, Ô đầu cùng 2 phân đoạn D, E chiết từ Phụ tử cho kết quả lần lượt như sau: 0.072 %, 0.125 %, 0.066 %, 0.015 %. 8 + Xây dựng, thẩm định và áp dụng phương pháp đo quang phổ UV- Vis để xác định hàm lượng: * Flavonoid toàn phần trong lá, trong phân đoạn dịch chiết C, E lần lượt là: 1.60 %, 38.24 %, 30.42 % tính theo quercetin. * Polysaccharid toàn phần trong Phụ tử, Ô đầu, trong phân đoạn I, II chiết từ Phụ tử lần lượt là: 19.63 %, 14.52 %, 87.6 %, 72.8 % tính theo D-glucose. + Áp dụng phương pháp đo ICP-MS đã xác định hàm lượng 12 kim loại nặng trong Ô đầu, Phụ tử sống là: Pb, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Hg, Ag, As nằm trong giới hạn cho phép quy định đối với thuốc, thực phẩm. 3.2.2.Chiết xuất và phân lập các chất từ Ô đầu, Phụ tử - Phụ tử (2,8 kg) ngâm chiết bằng ethanol 96 %. Chiết xuất phân lập các chất bằng sắc ký cột thu được các chất: (OD1, OD2, OD3, OD4, OD5, OD6, OP7, OD8, OD9, OD10). - Ô đầu (3,2 kg) ngâm chiết bằng ethanol 96 %. Chiết xuất phân lập các chất bằng sắc ký cột thu được các chất: OD4, OD6, OD7. - Bột Phụ tử 500 g ngâm chiết bằng nước cất ở 90 o C. Dịch chiết được tủa bằng ethanol 96 % và ly tâm thu tủa polysaccharid. Tách được phân đoạn I, II bằng cột sắc ký sephadex G100. 3.2.3. Chiết xuất phân lập các hợp chất từ lá cây Ô đầu Lá cây Ô đầu (1,5 kg) chiết bằng ethanol 96 %. Chiết xuất phân lập các chất bằng sắc ký cột thu được các chất: F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7. 3.2.4. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập đƣợc từ cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang 9 Căn cứ vào phản ứng hóa học đặc trưng để dự kiến nhóm chất, căn cứ vào phổ IR, MS, 13 C-NMR, 1 H-NMR, DEPT 135, DEPT 90, HSQC, HMBC và so sánh với dữ liệu phổ đã công bố của chất tương ứng để xác định cấu trúc của các chất phân lập được như sau: Chất OD7: Hình 3.18. Cấu trúc của chất OD7 OD7 hiện màu với thuốc thử Dragendorff nên dự kiến chất OD7 thuộc nhóm alcaloid. Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho các nhóm liên kết O-H, C-H, C-N, C-O-C. Phổ khối ESI-MS của chất cho pic ion phân tử ở m/z 590 [M+H] + tương ứng với khối lượng phân tử M= 589. Phổ 13 C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 cho thấy chất OD7 xuất hiện 31 tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho sự có mặt của 31 nguyên tử carbon trong đó có 1 nhóm methyl, 4 nhóm methoxy, 6 C trong vòng benzen thế, 4 nhóm methylen, 11nhóm methin bão hòa, 2 carbon bậc 4 và 3 carbon C-OH. Phổ 1 H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho chất 43 nguyên tử hidro, với các tín hiệu đặc trưng như: 4.25 (m, 1H, H-1), 2.97 (s, 3H, - NCH 3 ), 3.32 (s, 1H, H-17), các tín hiệu (3.35s, 3.39 s, 3.43 s, 3.75 s, 3H) đặc trưng cho 5 nhóm methoxy, 7.49 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 8.12 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.63 (m, 1H) đặc trưng cho nhóm benzoyl. Kết hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC) và so sánh với dữ liệu đã công bố của chất benzoylmesaconitin, chất OD7 được xác định là: 10 benzoylmesaconitin. Khi so sánh giữa chất OD7 và OP7 (trong Phụ tử) thấy: cả hai chất cùng hiện màu với thuốc thử Dragendorff, giá trị R f khi triển khai SKLM trong cùng hệ dung môi và phổ MS, phổ 13 C- NMR của 2 chất này giống nhau, như vậy xác định chất OP7 phân lập từ Phụ tử cũng là benzoylmesaconitin. Chất OD5, OD8, OD9, OD10 sau khi so sánh với phổ của OD7, đặc điểm phổ NMR, so sánh với dữ liệu phổ của các chất tương ứng: hokbusin A, fuzilin, delcosin, karacolin, xác định như sau: chất OD5 là: hokbusin A, chất OD8 là fuzilin, chất OD9 là delcosin, chất OD10 là karacolin, cấu trúc các chất như sau: N H 3 CH 2 C OCH 3 OH HO OCH 3 OH OH OCH 3 H H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Cấu trúc OD5: Hokbusin A Cấu trúc OD8: Fuzilin N H 3 CH 2 C OCH 3 OCH 3 OH OH OH HO H H OCH 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 17 12 13 14 15 16 18 19 N H 3 CH 2 C HO OH H H OH OCH 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Cấu trúc OD9: Delcosin Cấu trúc OD10: Karacolin Chất OD4:Phổ IR xuất hiện đỉnh hấp thụ cực đại đặc trưng cho nhóm O-H, C-H, C=O, C-O-C. Phổ ESI-MS của chất cho pic ion phân tử ở m/z: 709 [M+H] + tương ứng với khối lượng phân tử M= [...]... dụng của liều 30 mg/kg tương đương với thuốc đối chứng silymarin liều 100 mg/kg thể trọng (15.96 % so với 17.7 %) BÀN LUẬN Trước kia, một số công bố cho thấy các tác giả mới nghiên cứu về cây Ô đầu ở Sa Pa, tỉnh Lào Cai, cây Ô đầu Hà Giang chưa thấy có nghiên cứu nào được công bố Mặt khác, trong các điều kiện sinh thái khác nhau, một loài thực vật vẫn có sự thay đổi về hàm lượng, thành phần hóa học, tác. .. tác dụng sinh học Đề tài đã xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở Hà Giang bằng phương pháp phân tích đặc điểm hình thái và giám định ADN giúp xác định rõ nguồn gốc của cây Nghiên cứu hóa học đã cung cấp thêm những dữ liệu hóa học quan trọng (hàm lượng nhóm chất chính, chất mới…) tạo điều kiện thuận lợi cho công tác kiểm nghiệm dược liệu và các sản phẩm liên quan đến Ô đầu, Phụ tử Nghiên cứu. .. mg/kg/ngày, 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày, uống trong 3 ngày liên tục, có tác dụng làm giảm rõ rệt số cơn quặn đau ở tất cả các thời điểm nghiên cứu so với lô chứng (p0.05) - Khoảng cách gây phản xạ đau trên máy tail-flick của chuột ở lô uống codein tăng có ý nghĩa thống kê so với chuột ở 3 lô uống PĐ E (p . khoa học, thực tiễn và góp phần giải quyết những vấn đề nêu trên, luận án với tên đề tài Nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx. ) trồng. trồng ở tỉnh Hà Giang được thực hiện. 2 2. Mục tiêu và nội dung chính của luận án 2.1. Mục tiêu luận án + Xác định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang. + Nghiên cứu thành phần. triển vùng trồng cây Ô đầu một cách bền vững, cần có nghiên cứu theo hướng ứng dụng trong Y Dược học hiện đại, góp phần phát triển sản phẩm từ cây Ô đầu, nhằm tạo đầu ra cho cây Ô đầu Hà Giang.