Đang tải... (xem toàn văn)
Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên phương pháp sắc ký cột
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 3 NỘI DUNG …………………………………………………………….………… 4 Chương 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ …………………………………… 4 1. Lịch sử sắc ký …………………………………………………………………. 4 2. Định nghĩa sắc ký……………………………………………………………… 4 3. Các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật sắc ký …………………………………… 5 4. Phân loại sắc ký……………………………………………………………… 6 4.1. Phân loại theo bản chất của hai pha sử dụng ……………………………… 6 4.2. Phân loại theo bản chất tương tác………………………………………… 7 4.3. Phân loại theo cấu hình ……………………………………………………. 8 Chương 2: SẮC KÝ CỘT HỞ ……………………………………… ………… 10 1. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT …………………………………………………… 10 1.1. Cột………………………………………………………………………… 10 1.2. Các loại pha tĩnh dùng nhồi cột ……………………………………………. 10 1.2.1. Silica gel …………………………………………………………… 10 1.2.2. Alumina …………………………………………………………… 14 1.2.3. Kieselguhr – Celite ………………………………………………… 14 1.2.4. Gel …………………………………………………………………….14 1.3. Dung môi ………………………………………………………………… 15 1.3.1. Các dung môi thường dùng cho sác ký cột ………………………… 15 1.3.2. Cách chọn dung môi thích hợp……………………………………… 15 1.4. Mẫu sắc ký …………………………………………………………………. 15 2. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH ……………………………………………………. 16 2.1. Chuẩn bị cột ……………………………………………………………… 16 2.2. Nạp mẫu cần tách lên cột sắc ký ……………………………………………17 2.2.1. Nạp mẫu dạng dung dịch …………………………………………… 17 2.2.2. Nạp mẫu dạng bột khô ……………………………………………… 18 2.3. Giải ly chất ra khỏi cột …………………………………………………… 19 2.3.1. Các phương pháp giải ly …………………………………………… 19 2.3.2. Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly …………………………………………………………………………………… 20 1 2.3.3. Vận tốc giải ly ……………………………………………….………. 21 2.3.4. Theo dõi quá trình giải ly cột …………………………………………22 2.3.5. Ghi nhận kết quả sắc ký ………………………………………………23 2.4. Xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất ……………………………… 23 3. ƯU, NHƯỢC ĐIỂM VÀ ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ CỘT HỞ …………… 24 3.1. Ưu điểm ……………………………………………………………………. 24 3.2. Nhược điểm ……………………………………………………………… 24 3.3. Ứng dụng ………………………………………………………………… 24 Chương 3: MỘT VÀI KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT KHÁC ……………………… 25 1. Sắc ký cột khô ………………………………………………………………… 25 2. Sắc ký cột nhanh ……………………………………………………………….27 3. Sắc ký nhanh cột khô ………………………………………………………… 29 KẾT LUẬN …………………………………………………………………………32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………… 33 2 Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, hàng trăm nghìn các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra và được nghiên cứu để phục vụ cho nhiều lĩnh vực của cuộc sống. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp các hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp các chất dẫn đường để tổng hợp ra các loại thuốc mới. Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hợp chất có khả năng trị bệnh rất cao. Vì vậy việc tách chiết, cô lập hợp chất thiên nhiên là công việc thật sự cần thiết. Có nhiều phương pháp để tách chiêt, cô lập các hợp chất thiên nhiên từ cây cỏ. Một trong những phương pháp thường hay dùng nhất là phương pháp sắc ký. Phương pháp sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanh chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là hóa học các hợp chất thiên nhiên. Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho phép ta ứng dụng nó ở mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện. Ngày nay, phương pháp sắc ký được sử dụng để tách tất cả mọi hợp chất dù có màu hay không màu, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn. Do các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều ít khác nhau nên không thể nào có một kỹ thuật sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. Trong bài báo cáo này, tôi xin giới thiệu một phương pháp sắc ký thường dùng trong phòng thí nghiệm đó là . Đối với người nghiên cứu về hóa học hợp chất thiên nhiên thì việc tìm hiểu sơ bộ về sắc ký cột c‡ng như việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột là một việc vô cùng cần thiết, có thể sử dụng hiệu quả vào trong công tác nghiên cứu của mình. 3 !"#$%$&#'( Từ ngữ sắc ký trong tiếng Anh là “chromatography” có xuất xứ từ chữ “chroma” trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu. Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Mikhail Semyonovich Tsvett đã dùng cột nhôm oxit (có tài liệu nói cột canxi cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ lá cây. Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên phương pháp này là phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi màu vì đã tách được những chất có màu. Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc ký c‡ng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau. Sự phát triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không còn đúng theo ý nghĩa ban đầu của nó. Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký đều có những nét chung nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn hợp chất phân tích qua lớp chất bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng mang trên chất rắn hoặc giấy và sự chuyển dịch đó được thực hiện bằng một chất khí hoặc chất lỏng (pha động). Trong những năm 1930, hàng loạt các nhà hóa học đã được vinh danh bằng giải thưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ vào những thành công trong việc sử dụng kỹ thuật sắc ký cột hấp phụ: - 1937, P. KARRER (Thụy Sĩ) về hóa học Carotenoid đặc biệt là vitamin A và vitamin B. - 1938 R.KUHN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin. - 1939 L.RIZICKA (Thụy Sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid. - 1940 MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớp silica gel và về sau phát triển sang sắc ký giấy. Hai ông được giải thưởng Nobel năm 1952 về sắc ký phân bố. - 1948 TISLIUS (Thụy Điển) được giải Nobel về kỹ thuật điện di và sắc ký hấp phụ. 4 )!"*+$&#'( - Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906): sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy. - Định nghĩa của IUPAC (1993): sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hướng xác định. Trong sắc ký cột, pha tĩnh được giữ trong một cột ngắn và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hoặc do trọng lực. - Hiện nay: sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh. ,!-#./01&##23#4+'51.61$&#'( Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh. ﾧ Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau. 5 7+89 (Mobile phase) 7+1* (Stationar phase) Lúc khởi đầu Các thành phần của hỗn hợp phân bố khác nhau vào hai pha Trạng thái cân bằng, các thành phần của hỗn hợp đã phân bố giữa hai pha theo một tỉ lệ nhất định Nhận xét:Hợp chất ( ) có ái lực mạnh hơn đối với pha tĩnh Hệ số phân chia là sự phân bố thí dụ: của 2 loại hợp chất ( ) và ( ) trong một hệ thống gồm có hai pha: pha động và pha tĩnh Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống trơ về mặt hóa học đối với các chất trong q trình sắc ký, cột có thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung mơi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ . Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxid nhơm, silica gel, CaCO 3 , than hoạt tính, polyamid, các loại có gắn nhóm ion,… Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa. Dung mơi dùng có thể là một hoặc hỗn hợp nhiều loại dung mơi có tỉ lệ thích hợp. Quy trình rửa giải nói chung là sử dụng dung mơi có tính chất hướng về một phía hoặc tăng hoặc giảm về tính chất. Với các chất hấp phụ pha thuận cổ điển, dung mơi sử dụng có độ phân cực tăng dần. Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt kết quả tốt hay khơng là tùy thuộc vào hệ số phân chia (partition coeffiicient). Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vào một hệ thống gồm có 2 pha (thí dụ: hai pha lỏng-lỏng hoặc rắn-lỏng), lúc đạt đến trạng thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ này thay đổi tùy vào các tính chất động học của các hợp chất và của cả hai pha Hệ số phân chia K được biểu diễn như sau: s m C Nồng độcủacáchợpchấttrong phatónh K C Nồng độcủa hợpchất trong pha động = = Mỗi hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi hợp chất sẽ di chuyển ngang qua pha tĩnh với một vân tốc khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất. :!7;<=>?$&#'( !" #$%%&'( Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh và pha động, người ta phân biệt một số kỹ thuật sắc ký khác nhau. - Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh tách riêng các hợp chất trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp phụ của nó. + Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumina hoặc silica gel đã được xử lý, có thể được nạp nén vào trong một cột hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm nhơm hoặc tấm nhựa. 6 + Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn lên trên chất mang rắn. - Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí + Pha động là chất khí: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký khí + Pha động là chất lỏng: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. ) !" #$ Sắc ký phân chia: * Pha động: chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí) * Pha tĩnh là chất lỏng, đó là một lớp chất lỏng với chiều dài thật mỏng, chất lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn, có trơ. Sắc ký hấp phụ: * Pha động là chất lỏng hoặc chất khí. * Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống. Những hạt rắn trơ này c‡ng giống như những hạt rắn trong sắc ký phân chia, nhưng không có phủ chất lỏng bên ngoài, bản thân hạt rắn là pha tĩnh. Tiêu biểu của sắc ký hấp phụ. Pha tĩnh rắn là những hạt rắn, nhuyễn, trơ 7 Sắc ký trao đổi ion: Tiêu biểu của sắc ký trao đổi ion * Pha động là chỉ có thể là chất lỏng * Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học gọi là polyme, nên được gọi là các hạt nhựa. Bề mặt của các hạt mang nhóm chức ở dạng ion. Sắc ký lọc gel: * Pha động chỉ có thể là chất lỏng * Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polyme, trên bề mặt của các hạt có nhiều lỗ rỗng. Mỗi loại nhựa có một kích cỡ nhất định, biết trước. Tiêu biểu của sắc ký lọc gel 8 * !" +, Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng: Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. Chế phân tách của sắc ký giấy chủ yếu là phân bố, trong đó pha tĩnh (thường là nước) được thấm trên một tờ giấy thấm đặc biệt gọi là giấy sắc ký. Nhờ các xoang rỗng trong sợi cellulose của tờ giấy sắc ký khác nhau, phân biệt theo độ thấm dung môi và mức độ dày mỏng của giấy, với các mã hiệu tùy thuộc vào hãng sản xuất. Khi tiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp. Sắc ký cột Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa, dụng cụ này giống như cái buret định phân trong phòng thí nghiệm. Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký giấy hoặc sắc ký lớp mỏng nhưng ở đây pha tĩnh được nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai một cách liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh. Trong sắc ký cột pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột. Tùy theo tính chất của chất dùng làm cột mà sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố). Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150μm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt phía trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt. Dung môi giải ly được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới cột, rồi đem cô quay đuổi dung môi, dùng sắc lý lớp mỏng để theo dõi quá trình giải ly. Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường thì hợp chất không hoặc kém phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau. 9 Còn trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha đảo thì những hợp chất phân cực sẽ giải ly ra khỏi trước và những chất phân cực kém sẽ giải ly sau. 10 [...]... Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký cột khô ₪ Ưu điểm: - Phương pháp sắc ký cột khô là phương pháp bắt cầu giữa phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột điều chế cổ điển Áp lực chi phí về thiết bị ít hơn so với phương pháp sắc ký lỏng điều chế - Cũng như các phương pháp sắc ký cột nói chung, DCC dùng được cả trong phân tích và điều chế - DCC nhanh, dễ dàng và hiệu quả cao trong việc tách. .. học của hợp chất cô lập được Cấu trúc này phải đáp ứng tất cả các chỉ tiêu hóa lý đã nêu trên 3 ƯU, NHƯỢC ĐIỂM VÀ ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ CỘT HỞ 3.1 Ưu điểm 24 Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột - Có thể sử dụng trong cả hai lĩnh vực phân tích và điều chế - Sắc ký cột không những dùng để xác định số lượng các thành phần của hỗn hợp mà nó còn có thể được dùng để tách và tinh.. .Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột Chương 2: SẮC KÝ CỘT HỞ 1 DỤNG CỤ - HÓA CHẤT 1.1 Cột Cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh dài 30-70 cm, đường kính 1-5 cm, đầu dưới có một vòi thủy tinh và 1 khóa để điều chỉnh tốc độ chảy Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu chất cần phân tách - Trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 2550 lần trọng lượng mẫu cần sắc ký. .. phương pháp sắc ký cột nói chung, sắc ký cột khô dùng được cả trong phân tích và điều chế Sắc ký cột khô được dùng để xác định số lượng thành phần chất trong hỗn hợp, phân tách và làm tinh khiết những thành phần này để dùng cho những phân tích sau đó Sắc ký cột khô đã áp dụng thành công cho những chất như thuốc nhuộm, alkaloids, và những hợp chất dị vòng khác, mặc dù có thể tách bằng các loại cột sắc. .. đầu cột một phễu lọc đuôi dài, rót hỗn hợp sệt vào cột, mở nhẹ khóa bên dưới cột cho dung môi chảy qua, hứng dung môi vào một becher trống, dung môi này được sử dụng lại để rót lên đầu cột Rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng 1 thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp phụ nén đều trong cột 17 Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột. .. ống với tốc độ 5 cm/phút Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký cột nhanh ₪ Ưu điểm: - Nhờ khí nén đẩy dung môi giải ly nên thời gian triển khai nhanh hơn sắc ký cột cổ điển (thời gian triển khai nhỏ hơn 20 phút) Cho phép phân lập mẫu 0.01-10g 29 Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột trong10-15 phút Có thể tách rất tốt hỗn hợp có khoảng 4 chất - Thiết bị đơn giản, rẻ... loại cột sắc ký khác nhưng sẽ gặp nhiều khó khăn đáng kể Lipid cũng có thể được tách bằng sắc ký cột khô 2 Sắc ky cột nhanh (Flash column chromatography-FCC) - Chất hấp phụ: sử dụng silica gel có cỡ hạt 40-63µm cho kết quả tốt nhất - Mô tả hệ thống: Hệ thống gồm cột sắc ký bằng thủy tinh như hệ thống sắc ký 28 Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột cổ điển, đầu cột được... giải ly vào phễu và lặp lại các thao tác như trên Mỗi lần phải hút khô phễu rồi mới cho dung môi mới Dung môi giải ly được sử dụng lần lượt từ không phân cực đến phân cực Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký nhanh -cột khô ₪ Ưu điểm: - Dụng cụ dễ tìm - Thời gian sắc ký nhanh nhờ lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly 31 Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột - Thuận... đầu cột, giữ sao cho có một lớp dung môi dày 3-5cm trên đầu cột Triển khai sắc ký - Hiện hình sắc ký: Đặt ống trụ nằm ngang trên một tấm kiếng và quan sát bằng đèn UV, đánh dấu các đoạn Lấy ống ra ngoài và dùng lưỡi dao lam để cắt ống thành những khúc thích hợp Dùng dung môi để trích chất trong mỗi đoạn 27 Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột Cắt ống trụ để trích chất. .. lọ nào có sắc ký bản mỏng giống nhau sẽ 23 Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn Đuổi dung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho cao của các phân đoạn đó Chỉ ngưng cột khi thu được lượng cao các phân đoạn bằng 70-80% trọng lượng mẫu đã nạp vào đầu cột 2.3.5 Ghi nhận kết quả sắc ky - Phân đoạn thu được là một chất tương . những hợp chất có khả năng trị bệnh rất cao. Vì vậy việc tách chiết, cô lập hợp chất thiên nhiên là công việc thật sự cần thiết. Có nhiều phương pháp để tách chiêt, cô lập các hợp chất thiên nhiên. là chất khí: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký khí + Pha động là chất lỏng: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. ) !" #$ Sắc ký phân. từ cây cỏ. Một trong những phương pháp thường hay dùng nhất là phương pháp sắc ký. Phương pháp sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanh chóng, mở ra một giai