PHẦN MỞ ĐẦU Biện pháp sinh học sử dụng các sinh vật, vi sinh vật đối kháng hay sản phẩm của chúng trong kiểm soát sinh học, nhằm ngăn chặn, diệt trừ các sinh vật, vi sinh vật gây bệnh có nhiều ưu điểm to lớn. Nó không những phòng, trị sâu bệnh hại có hiệu quả mà còn khắc phục được những nhược điểm của biện pháp sử dụng các chất hoá học bảo vệ thực vật. Biện pháp sinh học không hoặc rất ít gây ô nhiễm môi trường, góp phần vào việc giữ cân bằng sinh thái, không độc hại với người sử dụng, các nông phẩm tạo ra có chất lượng cao, sạch an toàn với sức khoẻ con người và vật nuôi. Vì vậy biện pháp sinh học được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nước phát triển và hiện đang từng bước được mở rộng, khuyến khích sử dụng ở hầu hết các nước trên thế giới và có nhiều triển vọng phát triển mạnh trong tương lai. Ở Việt Nam, trong những năm trở lại đây cũng đang có nhiều nghiên cứu hướng vào khả năng đối kháng và tạo chế phẩm phân bón hay thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ những loài Trichoderma đặc biệt là ở thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, những nghiên cứu về Trichoderma từ RNM là hoàn toàn mới mẻ và mới chỉ được sơ bộ đánh giá từ năm 2008 tại Bộ môn CNSH-VS, trường ĐHSP Hà Nội. Chúng ta đang phải đối mặt và giải quyết hậu quả gây ra từ việc sử dụng tràn lan, không có khoa học thuốc hoá học bảo vệ thực vật. Hậu quả đó không những làm ô nhiễm nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khí ảnh hưởng trực tiếp đến các sinh vật sống trong các môi trường đó. Dư lượng thuốc tồn lưu trong các nông phẩm còn ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ con người làm phát sinh nhiều bệnh nan y như ung thư, viêm phổi, thai dị dạng…Hơn nữa, do việc quá lạm dụng thuốc còn gây hiện tượng quen thuốc của vi sinh vật gây bệnh. Đứng trước thực tiễn đó, việc tạo ra các chế phẩm sinh học có hiệu quả cao phòng, trị được sâu, bệnh và tiến tới thay thế dần biện pháp sử dụng chất hoá học bảo vệ thực vật là yêu cầu và đòi hỏi cấp thiết không những để làm giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm nông nghiệp mà còn vì mục đích giải quyết vấn đề môi trường và nâng cao chất lượng cuộc sống con người. 1 Để góp phần nghiên cứu tìm hiểu khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma từ RNM, với mong muốn tìm ra những chủng có khả năng áp dụng trong bảo vệ thực vật, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng đối kháng và tiềm năng ứng dụng của một số chủng Trichoderma phân lập từ RNM trên một số nấm bệnh thực vật”. Mục tiêu của đề tài là chọn lọc được một số chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm bệnh. Bước đầu nghiên cứu khả năng ứng dụng của chủng Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với nấm bệnh Phytophthora capsici trên ớt. PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm hình thái, khả năng sinh sản của nấm Trichoderma 1.2. Đặc điểm sinh trưởng của Trichoderma 1.3. Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma 1.4. Ảnh hưởng của một số nhân tố môi trường tới Trichoderma 1.5. Một số cơ chế đối kháng của Trichoderma 1.5.1. Cơ chế kí sinh 1.5.2. Cơ chế kháng sinh 1.5.3. Cơ chế enzyme 1.5.4. Cơ chế cạnh tranh 1.5.5. Kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật 1.5.6. Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của Trichoderma 1.6. Tình hình nấm bệnh hại cây trồng trên thế giới và Việt Nam 1.7. Tình hình bệnh hại ớt 1.8. Một số biện pháp phòng chống bệnh do nấm trên thực vật 1.9. Ứng dụng Trichoderma trong kiểm soát sinh học bảo vệ thực vật 1.9.1. Tình hình ứng dụng nấm Trichoderma trên thế giới 1.9.2. Tình hình sử dụng Trichoderma ở Việt Nam 2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu - Các chủng nấm nghiên cứu: Gồm các chủng Trichoderma (34 chủng) được phân lập từ Rừng ngập mặn Giao Thủy - Nam Định đang được lưu giữ tại phòng CNSH – Vi sinh, khoa Sinh học, trường ĐHSP Hà Nội. - Các chủng nấm kiểm định: Phytophthora sp., Fusarium sp. (L2) do Bộ môn CNSH-VS cung cấp; nấm Colletotrichum gloeosporioides do Viện di truyền Nông nghiệp phân lập và cung cấp; nấm Rhizoctonia solani do Viện bảo vệ thực vật phân lập và cung cấp; nấm Phytophthora capsici được chúng tôi phân lập tại Bộ môn CNSH-VS từ mẫu bệnh do Viện nghiên cứu Rau quả cung cấp. 2.1.2. Đối tượng cây sử dụng trong nghiên cứu - Ớt chỉ thiên (Capsicum annuum L.): hạt ớt chỉ thiên chúng tôi sử dụng hai loại, một của Tổng công ty Rau quả nông sản Việt Nam, một loại do chúng tôi thu và xử lí hạt. 2.1.2. Hóa chất 2.1.3. Dụng cụ và thiết bị 2.1.4. Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu 2.1.4.1. Môi trường giữ giống Trichoderma 2.1.4.2. Môi trường nuôi cấy Trichoderma trong nghiên cứu 2.1.4.3. Môi trường xác định hoạt tính enzyme 2.1.4.4. Môi trường tự nhiên kích thích sinh bào tử Phytophthora capsici 2.1.4.5. Môi trường phân lập nấm 2.2. Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 2.2.1.1. Phương pháp cấy chấm điểm 2.2.1.2. Phương pháp nhỏ dịch 2.2.2. Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát đặc điểm hiển vi 2.2.3. Phương pháp phân lập nấm Phytophthora từ mô bệnh 2.2.4. Phương pháp nuôi cấy Dual 2.2.5. Phương pháp tính hiệu lực phòng trừ 2.2.6. Phương pháp thu bào tử Trichoderma 3 2.2.7. Phương pháp tính tỉ lệ bệnh (TLB) 2.2.8. Phương pháp nghiên cứu một vài chỉ tiêu sinh trưởng 2.2.9. Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê trên phần mềm Microsoft Excel bằng phương pháp thống kê toán học 2.2.10. Phương pháp bố trí thí nghiệm CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng đối kháng nấm bệnh của Trichoderma RNM 3.1.1. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phytophthora sp. Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Phytophthora sp. được thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phytophthora sp. STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 1 NHA7.3 - - + + ++ 2 NHA7.4 - + ++ +++ +++ 3 NHA7.5 - + ++ +++ +++ 4 NHA8.6 - - - - - 5 NHA8.8 - - - + + 6 GTa2.2 - - + + + 7 GTa3.2 - + + + + 8 GTA3.5 - - + + + 9 GTA5.1 - - + + ++ 10 GTA5.5 - - + ++ +++ 11 GTb2.1 - - + + + 12 GTb4.7 - - - - - 13 GTb4.8 - + + + ++ 14 GTb5.3 - + + + + 15 GTB2.4 - + + + + 16 GTB2.5 - - + ++ ++ 17 GTB2.6 - - - - - 18 GTB4.5 - + ++ +++ +++ 19 GTB5.7 - - ++ ++ ++ 20 GTd4.2 - + + + + 4 STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 21 GTd4.3 - + + + ++ 22 R221A1 + ++ +++ * * 23 L2T - - + + + 24 TT4 + ++ +++ * * 25 TT5 + ++ +++ * * 26 TT44 - + + + + 27 TT60 - - + + + 28 6 - - ++ ++ +++ 29 11 - - + + + 30 17 - - + +++ +++ 31 19 - - + ++ ++ 32 25(1) - + ++ ++ ++ 33 25(2) + + ++ +++ +++ 34 NHA7.17 - - - - - Trong đó: -: không có khả năng đối kháng ; +: có đối kháng, hiệu quả ức chế 40-60%; ++: đối kháng mạnh, hiệu quả ức chế 60-80%; +++: đối kháng rất mạnh, hiệu quả ức chế 80-90%; *: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90%. 3.1.2 Khả năng đối kháng của Trichoderma với Colletotrichum gloeosporioides Bảng 3.2. Khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma với Colletotrichum gloeosporioides STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 1 NHA7.3 - - + ++ ++ 2 NHA7.4 - + +++ +++ * 3 NHA7.5 - + +++ +++ +++ 4 NHA8.6 - - - - - 5 NHA8.8 - - + ++ ++ 6 GTa2.2 - + ++ ++ ++ 7 GTa3.2 - + ++ +++ +++ 8 GTA3.5 - - - - - 5 STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 9 GTA5.1 - - + + + 10 GTA5.5 - + ++ +++ +++ 11 GTb2.1 - - + + + 12 GTb4.7 - - ++ ++ ++ 13 GTb4.8 - - - + + 14 GTb5.3 - - + + + 15 GTB2.4 - ++ +++ +++ +++ 16 GTB2.5 - - - - - 17 GTB2.6 - - - - - 18 GTB4.5 - - + ++ ++ 19 GTB5.7 - - - - - 20 GTd4.2 - ++ +++ * * 21 GTd4.3 - ++ +++ +++ +++ 22 R221A1 - + ++ ++ ++ 23 L2T - + ++ ++ ++ 24 TT4 - + + + + 25 TT5 - + + + ++ 26 TT44 - ++ +++ * * 27 TT60 - - - + + 28 6 - - + + + 29 11 - - + ++ ++ 30 17 - + ++ ++ ++ 31 19 - - - - - 32 25(1) - + ++ ++ ++ 33 25(2) - + ++ +++ +++ 34 NHA7.17 - - - - - Trong đó: -: không có khả năng đối kháng; +: có đối kháng, hiệu quả ức chế 40-60%; + +: đối kháng mạnh, hiệu quả ức chế 60-80%; +++: đối kháng rất mạnh, hiệu quả ức chế 80-90%;*: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90% 6 3.1.3. Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia solani Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia solani được thể hiện ở bảng 3.3: Bảng 3.3. Kết quả đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia solani STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 1 NHA7.3 - - + ++ ++ 2 NHA7.4 - + +++ +++ +++ 3 NHA7.5 - + ++ +++ +++ 4 NHA8.6 - - - - - 5 NHA8.8 - - - - - 6 GTa2.2 - - + ++ ++ 7 GTa3.2 - - + + + 8 GTA3.5 - + + + + 9 GTA5.1 - - + ++ ++ 10 GTA5.5 - + + + + 11 GTb2.1 - - - - - 12 GTb4.7 - + ++ ++ ++ 13 GTb4.8 - - + + + 14 GTb5.3 - - + ++ ++ 15 GTB2.4 - + +++ +++ +++ 16 GTB2.5 - + + + + 17 GTB2.6 - - - - - 18 GTB4.5 - - - + + 19 GTB5.7 - + + + + 20 GTd4.2 - + ++ +++ +++ 21 GTd4.3 - - + ++ ++ 22 R221A1 - + +++ * * 23 L2T - - + ++ ++ 24 TT4 - + ++ * * 25 TT5 - + +++ * * 7 STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 26 TT44 - + +++ +++ * 27 TT60 - - + + + 28 6 - - + + + 29 11 - + ++ +++ +++ 30 17 - - + + + 31 19 - - + ++ ++ 32 25(1) - + + + + 33 25(2) - + + ++ ++ 34 NHA7.17 - - + + + Trong đó: -: không có khả năng đối kháng; +: có đối kháng, hiệu quả ức chế 40-60%; + +: đối kháng mạnh, hiệu quả ức chế 60-80%; +++: đối kháng rất mạnh, hiệu quả ức chế 80-90%; *: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90% 3.1.4. Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp. Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp. được thể hiện ở bảng 3.4: Bảng 3.4. Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp (L2) STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 1 NHA7.3 - - - - - 2 NHA7.4 - - + + + 3 NHA7.5 - ++ +++ * * 4 NHA8.6 - - - - - 5 NHA8.8 - - - - - 6 GTa2.2 - + ++ * * 7 GTa3.2 - - + + + 8 GTA3.5 - - + ++ +++ 9 GTA5.1 - - - - - 10 GTA5.5 - - - - - 11 GTb2.1 - - + + + 12 GTb4.7 - - - - - 8 STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 13 GTb4.8 - - - - - 14 GTb5.3 - - + + + 15 GTB2.4 - + + ++ ++ 16 GTB2.5 - - - - - 17 GTB2.6 - - - - - 18 GTB4.5 - ++ +++ +++ +++ 19 GTB5.7 - + + ++ ++ 20 GTd4.2 - - - - - 21 GTd4.3 - - + + + 22 R221A1 - + ++ +++ +++ 23 L2T - + ++ * * 24 TT4 - + + + + 25 TT5 - + ++ +++ +++ 26 TT44 - + + + + 27 TT60 - - - - - 28 6 - - + + + 29 11 - - - - - 30 17 - - - - - 31 19 - - - + + 32 25(1) - - - + + 33 25(2) - - - - - 34 NHA7.17 - - - - - Trong đó: -: không có khả năng đối kháng; +: có đối kháng, hiệu quả ức chế 40-60%; + +: đối kháng mạnh, hiệu quả ức chế 60-80%; +++: đối kháng rất mạnh, hiệu quả ức chế 80-90%; *: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90% 3.1.5. Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với nấm bệnh Phytophthora capsici Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Phytophthora capsici được thể hiện ở bảng 3.5: 9 Bảng 3.5. Kết quả đối kháng giữa các chủng Trichoderma nghiên cứu với Phytophthora capsici STT Các chủng Trichoderma 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày 1 NHA7.3 - + ++ ++ ++ 2 NHA7.4 - +++ +++ +++ +++ 3 NHA7.5 + +++ * * * 4 NHA8.6 - + ++ ++ ++ 5 NHA8.8 - - ++ ++ ++ 6 GTa2.2 - - + + + 7 GTa3.2 - + + + + 8 GTA3.5 - + ++ ++ ++ 9 GTA5.1 - + ++ ++ ++ 10 GTA5.5 - + +++ * * 11 GTb2.1 - ++ ++ ++ ++ 12 GTb4.7 - + ++ +++ +++ 13 GTb4.8 - - + ++ ++ 14 GTb5.3 - + ++ ++ ++ 15 GTB2.4 - ++ +++ * * 16 GTB2.5 - + + + + 17 GTB2.6 - + + + + 18 GTB4.5 - - + ++ ++ 19 GTB5.7 - + + + + 20 GTd4.2 + +++ * * * 21 GTd4.3 - - + ++ ++ 22 R221A1 + +++ * * * 23 L2T - + ++ +++ +++ 24 TT4 - ++ * * * 25 TT5 - + ++ +++ +++ 26 TT44 - ++ +++ +++ +++ 27 TT60 - + ++ +++ +++ 28 6 - + + + + 10 [...]... capsici được phân lập lại từ mẩu thân và rễ của cây ớt bệnh trên môi trường Agar – nước cất A: Phân lập P capsici từ thân; B: phân lập P 3.6 Một số cơ chế đối kháng có thể của các chủng Trichoderma với các nấm bệnh nghiên cứu đặc biệt với nấm Phytophthora capsici Chúng tôi nhận thấy chủng NHA7.5, R221A1, GTd4.2, TT4, GTB2.4, TT44 biểu hiện cao cả hoạt tính chitinase và cellulase đều có khả năng đối kháng. .. thủng tại một số chỗ tiếp xúc và các sợi nấm nhỏ Trichoderma này có thể qua các lỗ thủng đó chui vào khoang trong của sợi nấm bệnh và sử dụng chất dinh dưỡng của nấm bệnh, sinh trưởng trong đó, nhanh chóng tiêu hủy và làm chết nấm bệnh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1 Hầu hết các chủng Trichoderma đều biểu hiện khả năng đối kháng với nấm bệnh (với nấm Phytophthora sp có 30/34 chủng, với nấm Colletotrichum... lại Từ đó đưa ra những kết luận, đánh giá khả năng ứng dụng của các chủng có hiệu quả đối kháng cao với nấm bệnh trên nhiều đối tượng cây trồng Tiếp tục nghiên cứu xa hơn nữa, khả năng ứng dụng tạo chế phẩm phân bón vi sinh hay chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật có phối trộn và chứa các chủng có hiệu quả cao như NHA7.5, R221A1 để đưa ra những kết luận chính xác hơn nữa về tiềm năng ứng dụng trong thực. .. tiễn của những chủng này Tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn nữa về cơ chế đối kháng của các chủng nấm Trichoderma có hiệu quả cao với nấm bệnh đặc biệt là hai chủng NHA7.5 và R221A1 Vì đây là hai chủng có khả năng đối kháng mạnh và hoàn với hầu như cả 5 loại nấm kiểm định đã thử nghiệm Trên cơ sở hiểu rõ được cơ chế đối kháng của nó để có phương pháp ứng dụng chúng sao cho có hiệu quả nhất trong thực. .. chủng trên theo thứ tự là 26,67%, 23,53%, 20%, 11,76% Như vậy trong 4 chủng, chủng NHA7.5 có hiệu quả phòng trị cao nhất, chủng GTd4.2 có hiệu quả phòng trị thấp nhất Hai chủng có nhiều tiềm năng ứng dụng tạo chế phẩm phân bón hay chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật là NHA7.5, R221A1 KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu tiếp khả năng ứng dụng của của các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng hoàn toàn với 4 loại nấm. .. hiện bệnh sau một thời gian chủng bệnh; ĐC1: Không xử lí bất cứ nấm gì cả nấm bệnh và nấm Trichoderma; ĐC2: Chủng nấm bệnh, không xử lí nấm Trichoderma 21 3.5 Kết quả phân lập lại Phytophthora capsici từ những cây ớt có biểu hiện bệnh sau khi chủng bệnh Hình 3.14 Cây ớt có biểu hiện nhiễm P capsici sau khi chủng bệnh Khuẩn lạc nấm Phytophthora capsici Khuẩn lạc nấm Phytophthora capsici Hình 3.15 Nấm. .. TT5, TT44) có khả năng đối kháng hoàn toàn với Rhizoctonia solani, 3 chủng (NHA7.5, GTa2.2, L2T) có khả năng đối kháng hoàn toàn với Fusarium sp., có 8 chủng có khả năng đối kháng hoàn toàn với Phytophthora capsici trong đó 4 chủng biểu hiện tính đối kháng nhanh và mạnh là NHA7.5, GTd4.2, R221A1, TT4 Bốn chủng này được chúng tôi chọn lọc để nghiên cứu tiếp ở giai đoạn ứng dụng 2 Nghiên cứu hoạt tính... hết 5 loại nấm kiểm định đã thử nghiệm Khả năng sinh enzyme và tính đối kháng của các chủng Trichoderma nghiên cứu có liên quan mật thiết Các chủng biểu hiện hoạt tính cellulase cao trong nghiên cứu này thường thể hiện tính đối kháng cao với nấm Phytophthora (cellulose và glucan là thành phần chính của thành tế bào) Ngoài ra, tốc độ sinh trưởng mạnh mẽ của các chủng nghiên cứu lấn át nấm bệnh cũng được... Trichoderma (chủng TT4) không xử lí nấm bệnh; - TT4(2): Xử lí Trichoderma (chủng TT4) trước khi chủng bệnh; NHA7.5(1): Xử lí Trichoderma (chủng NHA7.5) không xử lí nấm bệnh; NHA7.5(2): Xử lí Trichoderma (chủng NHA7.5) trước khi chủng bệnh; NBCT(TT4): Xử lí Trichoderma (chủng TT4) khi cây có biểu hiện bệnh sau một gian chủng bệnh; NBCT(NHA7.5): Xử lí Trichoderma (chủng NHA7.5) khi cây có biểu hiện bệnh sau một. .. 27/34 chủng, với nấm Rhizoctonia solani có 30/34 chủng, với nấm Fusarium sp có 19/34 chủng, với nấm Phytophthora capsici cả 34 chủng đều biểu hiện khả năng đối kháng) Nhiều chủng có khả năng đối kháng rất mạnh và hoàn toàn, trong đó 3 chủng (R221A1, TT4, TT5) đối kháng hoàn toàn với Phytophthora sp., 3 chủng (NHA7.4, GTd4.2, TT44) đối kháng hoàn toàn với nấm Colletotrichum gloeosporioides, 4 chủng . tài nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng đối kháng và tiềm năng ứng dụng của một số chủng Trichoderma phân lập từ RNM trên một số nấm bệnh thực vật”. Mục tiêu của đề tài là chọn lọc được một số chủng. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng đối kháng nấm bệnh của Trichoderma RNM 3.1.1. Khả năng đối kháng của Trichoderma với Phytophthora sp. Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma. số chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao với nấm bệnh. Bước đầu nghiên cứu khả năng ứng dụng của chủng Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với nấm bệnh Phytophthora capsici trên ớt.