1 MỞ ĐẦU Cellulose được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và tảo để phục vụ cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng. Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu không chúng sẽ tích tụ lại và gây hại cho hệ sinh thái. Cellulose là polysaccharide cấu tạo bởi các đơn phân β-D-glucose được liên kết bởi cầu nối 1,4-glycoside (Shallom & Shoham, 2003). Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp . Trong tự nhiên, các loài nấm thường kết hợp với các vi khuẩn phân hủy cellulose thành các đơn phân (monomer) là glucose rất dễ hấp thụ đối với các sinh vật khác. Tuy nhiên trong các hệ sinh thái nhân tạo như các vườn, trang trại, đồn điền, ruộng lúa, các sinh vật phân hủy cellulose trên không tồn tại hoặc rất ít, do đó sẽ không diễn ra quá trình phân hủy cellulose (cũng như các chất cao phân tử khác) một cách dễ dàng và nhanh chóng như trong các hệ sinh thái rừng tự nhiên. Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tương tự khác tạo thành các oligosaccharide. Nhiều chủng nấm tiết enzyme cellulase với lượng lớn hơn các chủng vi khuẩn và Trichoderma được biết như chi nấm có khả năng tiết cellulase nhiều nhất (Amouri và cs, 2006). Cellulose "kháng" lại mạnh mẽ với các enzyme phân hủy chúng nhưng các loài nấm Trichoderma lại có khả năng phân hủy hoàn toàn cellulose. Hầu hết các cellulase thương mại là được sản xuất bởi nấm T. reesei và Aspergillus niger. Điều này phản ảnh một thực tế rằng nấm 2 mốc là một nguồn tự nhiên tiết enzyme mạnh (Bergquist và cs, 2002) và có thể nghiên cứu để sản xuất enzyme với quy mô công nghiệp . Một ứng dụng tiềm năng của cellulase là sản xuất ethanol nhiên liệu từ sinh khối lignocellulose (Duff và cs, 1996), dùng để thay thế cho xăng trong động cơ đốt trong. Công nghệ triển vọng nhất cho sự chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol nhiên liệu là dựa trên sự phân giải cellulose nhờ enzyme cellulase (Holker và cs, 2004; Ahamed & Vermette, 2008) . Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cellulose (Đặng Minh Hằng, 1999; Tăng Thị Chính và cs, 1999; Hoàng Quốc Khánh và cs, 2003; Nguyễn Văn Tuân, 2009). Những nghiên cứu này chủ yếu dừng lại ở vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase . Công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật là cơ sở để sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp như vaccine, hormone, enzyme Việc cải thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi, trong đó có tạo dòng và sản xuất glucanase. Điều này đã mở ra một hướng đi mới trong việc tăng cường khả năng phân hủy các phế phẩm nông nghiệp giàu cellulose nhưng vẫn an toàn đối với môi trường. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng gen mã hóa glucanase từ Trichoderma asperellum” nhằm tạo cơ sở bước đầu cho việc sản xuất glucanase ứng dụng trong công - nông nghiệp. 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ GLUCANASE Dựa vào hoạt tính của enzyme đối với cơ chất, người ta phân chia glucanase thành nhiều loại khác nhau như β-1,3-glucanase, β-1,4-glucanase, β-1,6-glucanase. Jesus và cs (1995) đã mô tả các cơ chất khác nhau và loại liên kết chính của chúng. Các cơ chất khác nhau được sử dụng làm nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy một số loài nấm, trong đó liên kết glycoside hiện diện trong cơ chất quyết định sự biểu hiện của enzyme glucanase cụ thể. 1.1.1. β-1,3-Glucanase β -1,3-glucan là một trong những thành phần cấu trúc chính của thành tế bào nấm, β-1,3-glucanase đã được chứng minh là enzyme quan trọng trong sự phân giải thành tế bào của nấm gây bệnh ở thực vật (Elad và cs, 1983). Glucanase biểu hiện hoạt tính (in vitro) ở cấp độ micromol (~50 µg/ml) chống lại một số lớn loại nấm, bao gồm cả các tác nhân gây bệnh ở người và thực vật (Coutos và cs, 1993). Mặc dù các enzyme phân giải glucan được phân bố trong một số họ enzyme thủy phân glycoside, nhưng chỉ có các gen mã hóa glucanase trong họ 5 và 55 từ các loài Trichoderma được mô tả đặc tính (Dong-Jinkim và cs, 2002). β-1,3-Glucanase phân bố rộng rãi ở vi khuẩn, nấm và thực vật bậc cao, trong đó nhiều enzyme đã được tinh sạch và xác định hoạt tính (Copa- Patino và cs, 1989; Kauffmann và cs, 1987). Chúng được phân loại như exo- β-1,3-glucanase [β-1,3-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.58)] và endo-β- 1,3-glucanase [β-1,3-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.6 hoặc EC 3.2.1.39)]. Exo-β-1,3-glucanase giải phóng liên tục glucose từ đầu không khử của cơ chất, trong khi endo-β-1,3-glucanase có khả năng phân cắt liên kết β- 1,3-glycoside ngẫu nhiên ở phía trong dọc theo chuỗi polysaccharide, giải 4 phóng các đoạn oligosaccharide ngắn. Các chức năng sinh lý của β-1,3- glucanase phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Ở thực vật, các enzyme này được xem như là hệ thống phòng thủ chống lại các loại nấm gây bệnh (Grenier và cs, 1993). Trong nấm, β-1,3-glucanase dường như có nhiều chức năng khác nhau. Đầu tiên, có vai trò phát sinh hình thái trong suốt quá trình phát triển và phân hóa của nấm (Peberdy và cs, 1990). Thứ hai, β-1,3- glucanase có liên quan đến sự huy động β-glucan trong điều kiện nguồn carbon và năng lượng bị cạn kiệt, lúc này chức năng của chúng giống như các enzyme tự phân (Rapp P., 1992). β-1,3-glucanase cũng có tác động đến nấm gây bệnh ở thực vật bằng cách phân giải callose (β-D-1,3-glucan) trong mô mạch của vật chủ trong quá trình tấn công của mầm bệnh (Shaeffer và cs, 1994). Cuối cùng, vai trò dinh dưỡng trong hoại sinh và ký sinh cũng đã được nghiên cứu (Sivan và Chet, 1989) . 1.1.2. β-1,4-Glucanase Thành tế bào thực vật là nguyên liệu có khả năng tái tạo, dồi dào nhất trên trái đất (Himmel và cs, 1999; Saleem và cs, 2008) và là nguồn dự trữ chính của carbon trong tự nhiên (Yang và cs, 2007). Thành phần chính của thành tế bào thực vật là cellulose - 40% trọng lượng khô, hemicellulose - 33% và lignin - 23% (Han và cs, 2003; Sa-Pereira và cs, 2003). Sinh khối thực vật là nguồn hóa học và nguyên liệu thay thế tự nhiên với chu kỳ tuần hoàn ngắn đủ để đáp ứng nhu cầu của thị trường nhiên liệu trên thế giới. Cellulase là enzyme quan trọng được ứng dụng trong nhiều quy trình công nghiệp (Hanif và cs 2004; Jamil và cs, 2005) và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vì các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực như: công nghiệp dệt, chế biến tinh bột, sản xuất rượu, bia, mạch nha, chiết xuất nước ép trái cây và rau củ, (Gao và cs 2008; Zhou và cs, 2008) , sản xuất acid hữu cơ (Cheryan và cs, 1997), sản xuất dung môi hữu cơ (Dũrre, 1988), sản xuất thức ăn gia súc, 5 công nghiệp sản xuất giấy và trong công nghệ xử lý môi trường (Tăng Thị Chính và cs, 1999) . Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên, nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn có khả năng phân hủy mạnh cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ cellulase . Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xương sống khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ưu của các enzyme. 1.1.3. β-1,6-Glucanase Ngoài thành phần β-1,3-glucanase, thành tế bào nấm còn chứa glucan phân nhánh với liên kết β-1,6-glycoside (Peberdy và cs, 1990 và Hrmova Fincher, 1993). Bên cạnh các enzym thủy phân β-1,3-glucan đã được nghiên cứu rộng rãi (Benitez và cs, 1998), thì những đặc tính sinh hóa và phân tử của β-1,6-glucanase (1,6-β-D-glucan glucanohydrolases, EC 3.2.1.75) cũng đã được mô tả (Pitson và cs, 1996). Như các enzym thủy phân ngoại bào khác, β-1,6-glucanase có thể có một vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của nấm, bởi sự phân giải các glucan ở dạng polymer trong môi trường sống của chúng. Nấm ký sinh tiết ra các enzyme này có khả năng phân giải thành tế bào vật chủ của chúng. β-1,6- glucanase được tiết ra bởi T. harzianum được xem là một thành phần hoạt động hổ trợ cùng với các enzyme thủy phân khác trong quá trình ký sinh của loài này . 6 1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI β-1,4-GLUCANASE 1.2.1. Nguồn gốc Endo-β-1,4-glucanase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis , ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác như mối , ở động vật thân mềm như Mytilus edulis . Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất vượt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme. Trước hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được. Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật sinh trưởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme. 1.2.2. Phân loại Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân, 7 nhóm 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, phân nhóm 1: thủy phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; http://afmb.cnrs-mrs.fr/pedro/CAZY/db.html). Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thành các nhóm khác nhau. Trước đây, cellulase được chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx được chia thành hai loại: exo β-1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo β-1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử cellulose . Hiện nay cellulase được phân thành ba loại: endoglucanase hoặc carboxymethyl cellulase (CMCase) (endo-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4), exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (exo-1,4-glucanase, EC 3.2.1.91) và glucosidase (D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) (Gielkens và cs, 1999; Kang và cs, 1999; Parry và cs, 1983). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên cầu nối 1,4-D-glycoside ở trong phân tử cellulose (Siddiqui và cs, 2000). Kết quả làm giảm nhanh chóng chiều dài của polymer và nồng độ của đường khử gia tăng chậm. Exoglucanase thủy phân cellulose bằng cách loại bỏ các đơn vị cellobiose từ đầu không khử của cellulose (Han và cs, 1995; Akiba và cs, 1995). Các cellulase có nguồn gốc khác nhau được sắp xếp thành các họ. Trước đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase được chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F . Sau đó, cellulase được chia thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác . Hiện nay, các cellulase được sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 và 74 . 8 1.3. ỨNG DỤNG CỦA β-1,4-GLUCANASE 1.3.1. Trong công nghiệp thực phẩm Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những hướng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục. Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong. Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme Viscozyme 120L được ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào đậu tương . Trong quá trình sản xuất nước cà rốt thường sử dụng endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn. Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần đường, protein còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như cellulose và β-glucan, làm ảnh hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản phẩm. Người ta thường sử dụng β-glucanase để loại bỏ những thành phần này. Các chế phẩm như Finizym 200L gồm các cellulase từ A. niger, β-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng trong sản xuất bia. Ngoài ra, endoglucanase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola insolens được ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ. Glucanase từ T. reesei, A. niger được ứng dụng trong sản xuất fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) được sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dược phẩm cũng như có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Khi được bổ 9 sung vào cơ thể người và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh lý quan trọng như: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ các chức năng của gan, làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng . Các phế phụ phẩm nông nghiệp như lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất các oligosaccharide. Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các oligosaccharide ở các nước trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về các oligosaccharide vào khoảng 1000-2000 tấn/năm . 1.3.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam. Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành nông nghiệp. Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm như trứng, thịt, sữa cho thị trường mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho ngành trồng trọt. Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói giảm nghèo, nâng cao đời sống cho người dân Việt Nam. Tuy nhiên, ngành nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn. Một trong những vấn đề cần được giải quyết hiện nay là làm thế nào để nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn cho môi trường xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con người. Trước tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã được đưa ra và một trong những giải pháp được nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học như sản xuất và bổ sung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi. Bổ sung chế phẩm enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và 10 hấp thụ chất dinh dưỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trưởng phát triển, nâng cao chất lượng vật nuôi. Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn được tiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lượng vốn có, tiết kiệm chi phí chăn nuôi, đồng thời làm giảm lượng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng trong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Thức ăn gia súc, gia cầm được chế biến từ các loại ngũ cốc có chứa nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thường không được tiêu hóa triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung β- glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thụ và chuyển hóa thức ăn . Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung glucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi làm tăng đáng kể tốc độ tăng trưởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi. Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm glucanase và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng tiêu hóa so với đối chứng (là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme) như sau: khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác tăng 10-18%, phytate tăng 59-70% . Tiềm năng ứng dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế phẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau có thể kể đến như: Rovazyme G2 (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 3 loại enzyme (cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease, amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF, [...]... phân lập và tạo dòng gen mã hóa α-1,3 -glucanase (mutanase) từ hai chủng T harzianum CBS 243.71 và P purpurogenum CBS 238.95 trong A oryzae JaL142 và JaL125 Trong khi đó, tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa exo-α1,3 -glucanase (AGN13.2) từ T asperellum T32 cũng đã được mô tả (Luis S và cs, 2004) Ganiger và cs (2008) đã tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa endoglucanase từ những loài Trichoderma. .. công trình nào nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen glucanase được công bố Hai gen mã hóa endo-β-1,4 -glucanase, egl1 và egl3, từ nấm T reesei đã được Penttila biểu hiện trong nấm men Saccharomyces cerevisiae từ năm 1987 dưới sự điều khiển của promoter gen mã hóa phosphoglycerate kinase De la Cruz và cs (1995) đã phân lập và tạo dòng gen mã hóa endo-β-1, 3glucanase, BGN13.1, từ chủng T harzianum CECT... tương đương với kích thước của gen endo-β-1,4 -glucanase dùng để thiết kế mồi 3.5 Tạo dòng gen mã hóa endo-β-1,4- glucanase Vector pGEM-T Easy có vùng 3’-T ở cả hai đầu đã tăng hiệu quả việc gắn gen endo-β-1,4 -glucanase của T asperellum PQ34 (sản phẩm PCR) vào vector khi khuếch đại PCR được tiến hành bằng enzyme Taq DNApolymerase Vị trí chèn gen endo-β-1,4 -glucanase của T asperellum vào vector pGEM-T... liệu ở hai bảng 3.1 và 3.2 có thể thấy hoạt độ của endo-β-1, 4glucanase của các chủng nấm T asperellum tỷ lệ thuận với đường kính vòng phân giải Từ đây, chúng tôi chọn chủng nấm T asperellum PQ34 để tiế hành phân lập và tạo dòng gen mã hóa cho enzyme endo-β-1,4 -glucanase Bảng 3.2 Hoạt độ endo-β-1,4 -glucanase của các chủng T asperellum 33 Chủng T asperellum Hoạt độ chung (U/mL) CH2 0,62 ± 0,30 SH16 8,13... tốc độ 13.000 rpm, trong 10 phút ở 4oC 28 2.2.4.2 Khuếch đại gen bằng PCR Sử dụng cặp mồi EGF (5'-GATAATATCTCCCCGTCATCGACAA-3') và EGR (5'-GAGAACAGACAGCCTCATAGAGTAG-3') được thiết kế cho gen mã hóa endo-β-1,4 -glucanase của Trichoderma viride (accession No: AY343987) để khuếch đại vùng mã hóa của gen endo-β-1,4 -glucanase của Trichoderma asperellum Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 6 µL master mix (Gotaq... trong S cerevisiae INVSc1 sử dụng vector tạo dòng pTZ57R/T và vector biểu hiện pYES2/CT Kết quả cho thấy hoạt tính của β-1,6 endoglucanase của dòng tái tổ hợp từ T reesei tăng ba lần, từ T harzianum và T virens tăng hai lần so với đối chứng Gen mã hóa enzyme ngoại bào exo- β-1,3 -glucanase (tag83) được sản xuất bởi T viride 20 (Kulminskaya và cs, 2001) , và từ T asperellum (Marcello và cs, 2010) cũng... Các thí nghiệm sử dụng RT-PCR cho thấy exo-β-1,3 -glucanase cảm ứng trong T asperellum xảy ra ở mức độ dịch mã và sự biểu hiện của gen tag83 tăng lên có ý nghĩa khi có sự hiện diện của R solani Zhou và cs (2010) đã sử dụng Bombyx mori (tằm) để sản xuất endo- glucanase II tái tổ hợp (rEGII) Gen mã hóa EGII (egl2) được tạo dòng từ T reesei và chèn vào genome của B mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) sử... chủng Trichoderma sp., các gen mã hóa glucanase từ các loài khác cũng đã được nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện Bacillus sp D04 sản xuất cellulase với trọng lượng phân tử 35 kDa, enzyme này có khả năng phân giải CMC, cellotetraose, cellopentaose, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside và avicel PH101 Gen mã hóa cellulase (cel) có kích thước 1461 bp của Bacillus sp.D04 đã được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli... cs (2008) đã phân lập cDNA của gen mã hóa endo-β -glucanase II (EGII) từ chủng nấm Humicola insolens H31-3 bằng phương pháp RT-PCR, sau đó tạo dòng trong vector biểu hiện pGAPZαA Plasmid tái tổ hợp này được đưa vào Pichia pastoris GS115 bằng phương pháp điện biến nạp, khi phân tích SDS-PAGE cho thấy protein biểu hiện có trọng lượng khoảng 55 kDa 1.8 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN TRONG E coli 22 Theo Baneyx... đã tạo dòng gen B7-H3 vào vector pGEX-5X-3 và biến nạp vào E coli để nghiên cứu chức năng sinh học của protein B7-H3 trong việc hoạt hóa tế bào lympho T Human beta-defensin-4 (hBD4) là một protein có tác dụng chống nhiễm khuẩn ở người, Zhinan và cs (2006) đã thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gen này vào E coli, sử dụng vector biểu hiện pET32-smhBD4, phân tích sự biểu hiện của gen mã hóa . với môi trường. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài Tạo dòng gen mã hóa glucanase từ Trichoderma asperellum nhằm tạo cơ sở bước đầu cho việc sản xuất glucanase ứng dụng trong. và tạo dòng gen mã hóa α-1,3 -glucanase (mutanase) từ hai chủng T. harzianum CBS 243.71 và P. purpurogenum CBS 238.95 trong A. oryzae JaL142 và JaL125 . Trong khi đó, tạo dòng và biểu hiện gen mã. gen mã hóa exo-α- 1,3 -glucanase (AGN13.2) từ T. asperellum T32 cũng đã được mô tả (Luis S. và cs, 2004) . Ganiger và cs (2008) đã tiến hành tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa endoglucanase từ những