- 1 - 1/ Đặt vấn đề : Di truyền học phân phân tử nghiên cứu cấu trúc các gen và sự vận hành các sản phẩm của chúng trong một tế bào. Lãnh vực này không ngừng được phát triển là nhờ kỹ thuật liên quan đến sự thao tác ADN, ARN và protein thay đổi mau lẹ và mạnh mẽ mà các kỹ thuật đó ngày nay được gọi là công nghệ gen hay công nghệ tái tổ hợp ADN. Công nghệ tái tổ hợp ADN là những kỹ thuật tách và tái tổ hợp lại các gen invitro. ADN tái tổ hợp là phân tử ADN lai từ ADN của hai lồi khác nhau. Ví dụ một gen cần nghiên cứu được gắn vào ADN của virus tạo ADN tái tổ hợp. Quá trình tách gen cần nghiên cứu, sử dụng rồi gắn vào ADN khác (như ADN virus, ADN plasmid…) tạo ra ADN tái tổ hợp rồi chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào cần thiết là các kỹ thuật cơ bản củ công nghệ tái tổ hợp ADN. Các enzym cắt hạn chế RE và các vector là các công cụ sử dụng trong công nghệ tái tổ hợp ADN. Đề tài: “ Vai trò của enzyme restriction và plasmid trong ứng dụng của sinh học phân tử” giúp người viết hiểu hơn về vai trò của sinh học phân tử trong nhiều lĩnh vực khoa học. 2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu : Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và các enzym. Phạm vi nghiên cứu: chỉ tập trung nghiên cứu vai trò của enzyme restriction và plasmid thông qua kỹ thuật tái tổ hợp ADN. 3/ Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu được lấy từ các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự phân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài. Mặc dù đề tài được chuẩn bị khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn sơ suất, rất mong được sự góp ý của quí thầy hướng dẫn và các bạn đồng nghiệp. Tác giả chân thành biết ơn. 4/ Cấu trúc tiểu luận: Phần 1: Kỹ thuật tái tổ hợp ADN. Phần 2: Một số ứng dụng của kỹ thuật di truyền. MỤC LỤC Trang Phần mở đầu 1 Phần nội dung 3 Phần I- Kỹ thuật tái tổ hợp ADN PHẦN MỞ ĐẦU DUNG - 2 - I/ Các enzyme hạn chế 3 II/ Thu nhận gen 5 1/Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen 5 2/Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học 6 3/Sinh tổng hợp gen từ mARN của gen tương ứng 6 III/ Các vector chuyển gen 6 1/ Các vector chuyển gen plasmid 7 2/ Các vector chuyển gen là phage lamdaˆ 3/ Các vector chuyển gen dự trên cosmid 9 4/ Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men 10 IV/ Tạo ADN tái tổ hợp 11 V/ Tạo dòng phân tử 13 Phần II- Một số ứng dụng của kỹ thuật di truyền…………………….16 KẾT LUẬN 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 Phần 1: KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN. Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện qua nhiều giai đoạn nhờ các công cụ enzyme cắt, nối và sao chép nucleic acid. I.CÁC ENZYME HẠN CHẾ: Kỹ thuật tái tổ hợp ADN sử dụng hàng loạt các công cụ phân tử, đó là các enzym nuclease, ADN-polymerase, ligase, reverse transcriptase, terminal transferase, trong đó vai trò hàng đầu là các enzyme restriction. Vào năm 1962, V.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những enzyme đặc biệt hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân biệt ADN PHẦN NỘI DUNG - 3 - của mình với ADN lạ của phage. Các enzym này hạn chế khả năng sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng một cách đặc hiệu do đó gọi theo tiếng Anh là Restriction enzyme. Chữ restriction có nghĩa là hạn chế có nguồn gốc lịch sử từ đó và được dùng đến nay. Các enzyme phân cắt ADN được gọi là nuclease gồm 2 loại là exonuclease và endonuclease. Exonuclease cắt ADN từ 2 đầu mút, còn endonuclease cắt ADN ở giữa phân tử. Các restriction enzyme cắt phân tử AND ở giữa một cách đặc hiệu nên được gọi là restriction endonuclease. Năm 1970, H.Smith và các cộng tác viên đã tách được restriction endonuclease đầu tiên từ vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd được gọi là HindII. Các enzyme restriction endonuclease nằm trong hệ thống chuyên biệt hạn chế- biến đổi ( restrictio-modification system) để bảo vệ tế bào khỏi sự xâm nhập của ADN lạ. Các restriction enzyme nhận biết ADN mạch kép ở những trình tự nhất định thường được gọi là điểm nhận biết (recognition sites) và cắt ADN ở ngay điểm này hay kế cận. Các điểm nhận biết này thường có trình tự 4-8 cặp nucleotide đối xứng đảo ngược nhau, được gọi là các palyndrom. Sự cắt ADN như vậy có thể tạo đầu tù hay đầu bằng (HpaI) hoặc đầu dính (BamHI) phụ thuộc vào cơ chế cắt của enzyme. Đầu dính đặc biệt được sử dụng trong cấu trúc phân tử ADN lai hay khảm. Ngày nay hơn 500 loại restriction endonuclease đã được phát hiện, chúng có khả năng cắt ADN tổng cộng với hơn 120 trình tự nhận biết khác nhau. Hàng trăm loại restriction endonuclease được bán ở thị trường. Mỗi restriction endonuclease có trình tự nhận biết đặc trưng. Ví dụ: *Restriction endonuclease EcoRI (từ E.coli) có trình tự Eco RI cắt G-A-A-T-T-C G A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G G-T-T-A-A G *Enzyme Bam HI (từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens) Bam HI G-G-A-T-C-C G G-A-T-C-C C-C-T-A-G-G C-C-T-A-G G *Enzyme Hae III (từ vi khuẩn Haemophilus aegyptium) Hae III G-G-C-C G-G C-C C-C-G-G C-C G-G Các enzym Eco RI và Bam HI khi cắt ADN mạch kép tạo ra các đầu lệch dính (cohesive ends) vì các base bổ sung dễ bắt cặp để gắn lại với nhau - 4 - như lúc chưa bị cắt rời. Nếu có một đoạn ADN lạ khác cùng bị cắt bởi một loại enzym hạn chế, ví dụ Eco RI thì nhờ các đầu dính đoạn ADN lạ có thể xen vào giữa như sau : Đoạn ADN1 Đoạn ADN lạ 2 G-A-A-T-T-C ~G-A-A-T-T-C~~~~~~G-G-A-T-C-C~ C-T-T-A-A-G ~C-T-T-A-A-G~~~~~~C-T-T-A-A-G~ Eco RI « Đầu dính » « Đầu dính » G A-A-T-T-C A-A-T-T-C~~~~~~G C-T-T-A-A G G~~~~~~C-T-T-A-A « Đầu dính » « Đầu dính » G-A-A-T-T-C~~~~~~G-G-A-T-C-C C-T-T-A-A-G~~~~~~G-T-T-A-A-G Đoạn ADN lạ xen giữa Tính chất quan trọng này được sử dụng để cắt và ghép các gen. Các enzyme endonucleaza hạn chế và những đoạn cắt của chúng Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn Bam III G G A T C C C C T A G G Bacillus amylolique faciens H Bgl II A G A T C T T C T A G A Bacillus globigi Hind III A A G C T T T T C G A A Haemophilus influenzeae R d Eco RII C C T G G G G A C C Escherichia coli R245 Hpa I G T T A A C C A A T T G Haemophilus parainfluenzea Hha I G C G C Haemophilus haemolyticus - 5 - C G C G Taq I T C G A A G C T Thermus aquaticus YTI II.THU NHẬN GEN : Có thể thu nhậân gen cho việc thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba phương pháp : tách trực tiếp từ ADN bộ gen, tổng hợp hóa học và sinh tổng hợp gen từ mARN tương ứng. 1.Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen : Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong buổi đầu của sự phát triển kỹ thuật di truyền. Tồn bộ ADN của một sinh vật được cắt đoạn nhỏ khoảng 15-20.000 cặp base bằng lắc cơ học hay bởi các restriction endonuclease rồi gắn vào các vật mang gen tạo plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào để tạo dòng đoạn ADN hoặc theo dõi sự biểu hiện của gen. Phương pháp này mang nhiều tính chất mò mẫm vì nguyên bộ gen tức tồn bộ ADN của các sinh vật khác nhau chứa rất nhiều gen. Phương pháp này được gọi bằng tiếng Anh là Shotgun ( bắn đạn chài). Tuy nhiên hiện nay nó vẫn được sử dụng có hiệu quả trong việc lập ngân hàng gen hay thư viện gen của các sinh vật, được gọi là ngân hàng gen nhiễm sắc thể (Bank of genomic ADN) hay thư viện gen (genomic ADN libraries). 2.Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học : Lần đầu tiên vào năm 1977, KaItakura và Boyer đã thành công trong việc cho gen tổng hợp nhân tạo mã hóa hormone somatostatin của động vật có vú biểu hiện trong tế bào E.coli. Gen somatostatin đã nhận được nhờ biết cấu trúc peptid của hormone chỉ gồm có 14 amino acid. Sau đó, các nòi E.coli mang gen tổng hợp được tạo ra, chúng sản sinh hormone tăng trưởng ở người Somatotripin) và các hormone peptid khác. Gen hormone tăng trưởng ở người dài 584 cặp nucleotide là gen dài nhất được tổng hợp nhân tạo vào cuối những năm 70. 3.Sinh tổng hợp gen từ mARN của gen tương ứng : Trong thực tiễn của kỹ thuật di truyền người ta sử dụng rộng rãi phương pháp thứ ba tạo gen từ các ARN thông tin của chúng. Phương pháp này được vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase. Enzyme gọi đúng nghĩa là ADN-polymerase phụ thuuộc ARN (ARN- dependent ADN-polymerase). Enzym có khả năng tổng hợp nên ADN một mạch là c-ADN (complementary ADN) từ khuôn mARN hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học. Nhờ enzyme này có thể tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn có mặt mARN của gen đó. - 6 - III.CÁC VECTOR CHUYỂN GEN: Vật chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được đoạn gen cần thiết . Các vật chuyển gen phải thỏa mãn các yêu cấu tối thiểu : *Có các trình tự xuất phát sao chép (ori) để có thể tồn tại độc lập. *Có các trình tự nhận biết (ricognition site) mà các restriction endonuclease nhận biết để cắt. *Các trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ. *Đảm bảo sự di truyền bền vững của ADN tái tổ hợp ở dạng độc lập hay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ. *Có các gen đánh dấu để dễ phát hiện vector hoặc các gen gắn vào. 1.Các vector chuyển gen plasmid : a.Vector pBR322. Các vector thông dụng được sử dụng với E.coli trước tiên phải kể đến là pBR322 (chữ p là chữ viết tắt của cụm từ plasmid ; BR là tên viết tắt của hai nhà khoa học ở phòng thí nghiệm đầu tiên tìm ra vector này là : F.Bolivar và R.Rodrigues ; 322 là danh số của plasmid này để phân biệt với các plasmid khác trong khi nghiên cứu cũng do phòng thí nghiệm này tìm ra như pBR325, pBR327 ). Plasmid có kích thước nhỏ hơn 10kb nên dễ loại trừ vấn đề ADN bị gãy khi làm sạch : pBR322 có 4361 cặp base. Kích thước đó nói lên rằng, không chỉ vector có thể làm sạch một cách dễ dàng mà còn có thể cả phân tử ADN được cấu trúc với nó. Thậm chí thêm vào 6 kb ADN, phân tử pBR322 tái tổ hợp vẫn còn là kích thước có thể điều khiển được. Plasmid này có hai bộ gen kháng kháng sinh là gen kháng ampicilin hoặc gen kháng tetracyclin được dùng làm marker chọn lựa đối với tế bào chứa plasmid này. Mỗi gen marker gồm những vị trí cắt gen hạn chế duy nhất, mà chúng được dùng trong các thí nghiệm chọn dòng. Việc gài ADN mới vào pBR322 đã được cắt với PstI, PvuI hoặc ScaI sẽ làm ức chế gen amp R và khi dùng gài một trong 8 emzyme cắt hạn chế làm ức chế tetracyclin. Sự thay các vị trí cắt hạn chế –mà chỗ đó có thể dùng để ức chế gài- pBR322 có thể được dùng để chọn dòng các đoạn ADN có đầu dính. - 7 - Một sự tiến bộ thứ ba của pBR322 là cơ số bản sao cao. Có khoảng 15 phân tử có mặt trong E.coli bị biến nạp nhưng số lượng này có thể tăng từ 1.000 tới 3.000 phân tử bởi sự phóng đại plasmid với sự có mặt của chất ứu chế tổng hợp như chloramphenicol. Do đó sự nuôi cấy E.coli đã cung cấp một sự sản sinh lớn phân tử pBR322 tái tổ hợp. b. Vector pBR325 chứa ba marker chọn lựa. pBR325 là plasmid pBR222 có thêm đoạn ADN. Đoạn này mang gen acetylcholintransferaza của chloramphenicol (CAT) một enzyme ức chế hoạt động của chloramphenicol và như vậy kháng kháng sinh này. Gen CAT chỉ chứa vị trí enzyme cắt hạn chế E.coRI trên plasmid. Như vậy vị trí này có thể được dùng để chọn dòng những tái tổ hợp được phát hiện bởi ức chế gài của kháng chloramphenicol, pBR325 có tiến bộ hơn pBR222 là thêm một vị trí chọn dòng và thêm một marker chọn lựa. c.Vector pATI 53-plasmid có số bản sao cao. Vector pATI 53 là một dẫn suất khác của pBR322 nhưng trong trường hợp này sự thay đổi không bao gồm sự cộng thêm marker chọn dòng mới hay những vị trí chọn dòng bên ngồi. Ngược lại, vector pATI 53 đã được cấu trúc bởi sự tách ra một đoạn 700 đôi base của pBR322, trong đó có cả gen amp R và tet R nhưng làm thay đổi sự tái bản và tiếp tục tạo ra plasmid. pATI 53 khác với pBR322 ở hai phương diện: - pARI 53 có số lượng bản sao cao hơn pBR322, thường có mặt khoảng 30-45 phân tử trên một E.coli. Với số lượng copy này thì dễ dàng được phát hiện khi nghiên cứu hiệu quả của gen được chọn dòng trong tế bào chủ. - pARI 53 là một plasmid không liên tục, không trực tiếp vận chuyển được tới tế bào E.coli khác do sự phát đi 700 đôi base đã làm phá hủy khả năng liên tục của pBR322. Điều này quan trọng đối với sự kiềm chế sinh học để tránh đi khả năng làm tẩu thốt phân tử pATK- 53 tái tổ hợp từ trong các ống nghiệm. d.Vector pUC8-sự chọn dòng gen lacZ. Vector pUC8 đã được dẫn ra từ pBR322, mặc dù trong trường hợp này sự tái bản và gen amp R vẫn còn nguyên vẹn. Một đoạn nucleotide của gen này đã bị thay đổi. Tất cả những vị trí chọn dòng bây giờ đã được tụ tập lại trong một đoạn ngắn của gen lacz 1 . Sự chọn dòng bằng gen lacz 1 không thuận tiện hơn khi dùng marker kháng sinh song giá trị của nó ở chỗ là tập trung lại được các vị trí cắt hạn chế và cho phép một đoạn ADN có hai đầu dính khác nhau được chọn dòng mà không còn chất gắn. 2.Các vector chuyển gen là phage lamda : - 8 - Phân tử ADN lamda chứa 52 kb có thể tăng lên khồng 5% tức là khoảng 3 kb ADN mới thêm vào nữa. Nếu kích thước của phân tử lớn hơn 52 kb, thì nó không bao gói vào cấu trúc đầu lamda được và các tiểu phần phage gây nhiễm không tiến hành được. Điều đó làm hạn chế kích thước của đoạn ADN cài vào vector lamda. Bộ gen lamda thì quá lớn, điều đó phải có nhiều đoạn thứ tự nhận diện đối với các enzym cắt hạn chế. Song enzym cắt hạn chế không thể được dùng để làm gãy phân tử lamda bình thường trong cái kiểu- mà kiểu đó sẽ cho phép gài ADN mới vào đó được. Hình như phân tử này có thể được cắt thành nhiều mẫu nhỏ mà những mẫu này có thể tạo thành bộ gen lamda mới thay đổi do kết cấu nối trở lại. Do những khó khăn đó nên chúng ta ngạc nhiên rằng; có nhiều kiểu vector chọn dòng lamda được phát triển. Việc sử dụng đầu tiên của chúng là những mẫu ADN lớn từ 5kb đến 40kb, còn những mẫu quá lớn thì lại được dùng bởi plasmid hay vector M13. Dưới đây là những vector gài vào và thay thế dựa vào phage lamda. * Vector gài vào ít nhất phải có một vị trí cắt hạn chế Gồm có : -Lamda NM607 đó là vector gài, nó mang tới 9 kb ADN mới được gài vào vị trí EcoRI trong gen CI. -Lamda charon 16, ADN mới được gài vào vị trí EcoRI làm ức chế gen lacZ’. * Vector thay thế phải có hai vị trí cắt hạn chế Gồm có : -Lamda (ƯE λ B’) : đoạn ADN mới có thể thay vào là 15kb. -Lamda EMBl4 : đoạn ADN mới có thể thay vào là 23 kb. 3.Các vector chuyển gen dựa trên cosmid : Cosmid là vector lai tạo giữa phân tử ADN phage và plasmid vi khuẩn. Cosmid về cơ bản là một plasmid mang vị trí cos. Vị trí cos cần cho chức phận bao gói của phage. Cosmid thiếu các gen lamda nên không sản xuất plaque. Thí nghiệm chọn dòng với cosmid thì được giản ra như sau : cosmid mở ra một vị trí cắt hạn chế và những đoạn ADN mới được gài vào. Những đoạn này thì được sản xuất bằng enzyme cắt hạn chế và được dẫn vào cosmid. Sự kết nối được giản ra. Sau đó ADN cosmid tái tổ hợp được bao gói và làm nhiễm E.coli mặc dù vòng plaque không được hình thành. Cosmid được dùng để thuần hóa những đoạn ADN lớn có khi tới 40kb. Khả năng này đã làm dấy lênvấn đề thư viện genom hay còn gọi là thư viện bộ gen. Thư viện bộ gen là một bộ của dòng tái tổ hợp-mà dòng đó chứa tất cả các ADN có mặt trong một cơ thể riêng lẻ, chẳng hạn thư viện bộ gen E.coli chứa tất cả những gen E.coli. Các cơ thể có thư viện bộ gen được giới thiệu ở bảng sau : - 9 - Số lượng các dòng gen có mặt trong thư viện bộ gen của các cá thể. Các cá thể khác nhau Kích thước bộ gen (đôi base) Số đoạn dài 17 kb (1) Số đoạn dài 35 kb (2) Escherichia coli 4x10 6 700 340 Bacillus megaterium 3x10 7 5.300 2.600 Aspergillus nidulans 4x10 7 7.000 3.400 Saccharomyces cerevisiae 7x10 7 12.500 6.000 Drosophila melanogaster 8x10 7 1.410 6.850 Cà chua 7x10 8 125.000 60.000 Người 3x10 9 535.000 258.000 Ếch 2,3x10 10 4.280.000 1.997.000 (1) đoạn 17 kb có thể dùng vector lamda EMB L4 nhân dòng. (1) đoạn 35 kb có thể dùng vector cosmid nhân dòng. Những thư viện này có thể giữ lại nhiều năm, có thể gửi cho nhau từ nhóm nghiên cứu này tới nhóm nghiên cứu khác. Điều đó giupù cho sự phát triển nghiên cứu nhanh chóng trong lĩnh vực sinh học phân tử. 4.Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men : Nấm men S.cerevisiae là một trong những cơ thể quan trọng nhất trong kỹ thuật di truyền. Vector có cấu trúc vòng 2 micromet, kích thước 6kb tồn tại trong tế bào nấâm men và có số luợng bản sao từ 70 đến 200. Dùng gen leu.2 như là marker chọn lọc. Vector được dẫn ra từ vòng 2 micromet gọi là plasmid episom nấm men. Sự cải tiến plasmid này qua nhiều bước dẫn đến tạo thành nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men gọi tắt YAC (yeast artificial chromosome). - 10 - Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC. YAC gồm những trình tự nucleotide căn bản : Ori, CEN ( centromer- tâm động), EcoRI, TEL (telomer là 2 trình tự đầu mút của nhiễm sắc thể) và ở phía trước 2 TEL có 2 BamHI (restriction endonuclease). Khi cắt bằng EcoRI và BamHI. YAC bị đứt thành 2 đoạn A và B, mỗi cái có một đầu TEL và đầu kia là EcoRI. Nếu ADN, ví dụ của người, cũng bị cắt rất nhẹ nhàng bằng EcoRI thì nhờ các đầu cố kết, chúng sẽ gắn vào trình tự EcoRI và nối A với B thành nhiễm sắc thể nhân tạo có khả năng sao chép nhờ Ori và phân chia đều về các cực của tế bào nhờ CEN. YAC có khả năng mang đoạn gen rất dài, có thể đến 1 triệu cặp nucleotide. IV.TẠO ADN TÁI TỔ HỢP (recombinant ADN) : Bước tiếp theo là gắn các đoạn ADN lạ hay các c-ADN vào vector chuyển gen để tạo plasmid tái tổ hợp có mang ADN lạ. Phương pháp gắn các đoạn ADN vào vector đơn giản dùng các đầu mút cố kế hay đầu dính. Phương pháp này dựa trên cơ sở sự gắn các đoạn ADN với nhau, mà mỗi một trong chúng có đầu dính tương tự nhận được do bị cắt bơiû cùng một loại restriction endonuclease. Dưới đây là sơ đồ mô tả quá trình gắn ADN lạ vào vector chuyển gen nhờ có đầu dính hay đầu cố kết : [...]... nay, chưa thấy giới hạn trong các ứng dụng của nó ngồi vấn đề đạo lý KẾT LUẬN Tóm lại, restriction enzyme (RE) và plasmid có vai trò đặc biệt quan trọng trong ứng dụng của sinh học phân tử, cụ thể là trong kỹ thuật tái tổ hợp ADN RE là endonucleaza có khả năng thủy phân ADN mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí xác định Mỗi RE nhận biết được một trình tự nucleotide đặc trưng và trình tự này có cấu... học, giúp tìm hiểu cơ chế sống, trong đó có điều hòa hoạt động, biệt hóa, tăng sinh tế bào dẫn đến ung thư ngày càng sáng rõ hơn - 18 - TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân, 1994: nghệ gen và Công nghệ sinh học ứng dụng trong y dược học hiện đại, NXB Y học 2 Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật 3 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB Giáo dục 4 Lê Đình Lương,... SỐ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT TRUYỀN DI Kỹ thuật di truyền đã dẫn đến nhiều ứng dụng có tính chất cách mạng trong sinh học và thực tiễn sản xuất Nó không những là công cụ hữu hiệu phục vụ cho nghiên cứu mà còn mở ra nhiều ứng dụng mới mà con người hằng mơ ước Sau đây là một số ứng dụng chính : 1.ADN và cả ARN trở nên dễ nghiên cứu Nhờ kỹ thuật tạo dòng các gen có thể được nhân ra nhiều bản sao và tương ứng. .. gài vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn, plasmid đó gọi là episom -Kích thước của các plasmid khoảng từ 10kb cho tới 250 kb -Số lượng bản sao từ 1 đến 50 -Có năm loại plasmid chính : *Plasmid F-có khả năng khởi động chuyển plasmid sang một cơ thể khác *Plasmid R kháng lại kháng sinh *Plasmid col-mã hóa colicin một phân tử protein giết vi khuẩn khác *Plasmid thối hóa-cho phép vi khuẩn làm thối hóa những phân. .. - 13 - Từ khi phát hiện được plasmid có các đặc điểm và tính chất nêu trên, cho đến nay các plasmid không ngừng được cải tiến, ngày càng mang thêm nhiều đặc tính quí cho việc tạo dòng Hiện nay đã sinh ra ba thế hệ của plasmid Các đặc tính của các thế hệ plasmid Các thế hệ của plasmid Plasmid thế hệ 1 Plasmid thế hệ 2 Plasmid thế hệ 3 Ví dụ Các đặc tính quý Đó là các plasmid Góp phần tạo dòng các gen... làm thối hóa những phân tử chuyển hóa không bình thường như toluen, acid salicylic *Plasmid độc-gây bệnh lý cho vật chủ như plasmid Ti sinh ra bệnh ung thư rễ trên cây hai lá mầm -Trong nấm men S.cerevisae cũng có plasmid vòng 2 micromet; nó kết hợp với pBR322 của E.coli tạo ra vector episom gài vào ADN chromosom của nấm men và nhân lên nhiều lần Tóm lại plasmid vi khuẩn là phân tử ADN hai chuỗi vòng... kháng kháng sinh Plasmid có nhiều đặc tính mà những đặc tính đó được sử dụng đặc biệt vào cấu trúc vector chọn dòng Chúng có thể có một bàn duy nhất hay nhiều bản sao trong phạm vi một vi khuẩn và tái bản không lệ thuộc vào ADN của vi khuẩn Thứ tự ADN tồn bộ của nhiều plasmid đã biết được Nhờ đó người ta có thể gài đoạn ADN ngoại lai vào những vị trí chính xác bởi những enzym cắt hạn chế Plasmid nhỏ... khổng lồ cuả sinh vật, dùng trong phương pháp tạo dòng để thu được dòng gen mong muốn có số lượng lớn, dùng trong lập bản đồ giới hạn để so sánh bộ gen giữa các lồi thông qua kỹ thuật RFLP Các plasmid với vai trò làm vector, là công cụ để chọn và tạo dòng trong công nghệ tái tổ hợp ADN - 17 - Công nghệ tái tổ hợp ADN ra đời đã dẫn tới những tiến bộ phi thường trong thực tiễn y khoa và trong nông nghiệp... pháp gen trong chưã bệnh cho người như sau : -Liệu pháp antisense, antigene -Đưa một gen mới vào bù đắp cho gen hỏng hóc -Đưa một gen mới vào sản xuất ra chất cần thiết để tiêu hủy tế bào bệnh -Cấy gen vào các vi khuẩn, nấm men để sản xuất các dược phẩm mới quý, hiếm sử dụng trong điều trị các bệnh -Tái tổ hợp gen trong tạo vaccin thế hệ mới, vaccin phân tử- vaccin ADN -Sử dụng kỹ thuật di truyền trong. .. pSC101, Col E1 PBR322 -Kích thước 4363 bp -Có hai gen kháng kháng sinh : *ApR-kháng ampicillin *TcR-kháng tetrcillin -Có 20 vị trí nhận biết enzyme giới hạn RE -Có 11 vị trí đưa gen ADN lạ xen vào, trong số đó có những vị trí nằm trong các gen kháng kháng sinh nên khi có gen ADN lạ xen vào sẽ kàm mất tính kháng kháng sinh tương ứng -Đây là plasmid mạnh nhất với hai đặc tính ; *Kích thước nhỏ nên sao chép . dụng trong công nghệ tái tổ hợp ADN. Đề tài: “ Vai trò của enzyme restriction và plasmid trong ứng dụng của sinh học phân tử giúp người viết hiểu hơn về vai trò của sinh học phân tử trong. thấy giới hạn trong các ứng dụng của nó ngồi vấn đề đạo lý. Tóm lại, restriction enzyme (RE) và plasmid có vai trò đặc biệt quan trọng trong ứng dụng của sinh học phân tử, cụ thể là trong kỹ thuật. nghệ gen và Công nghệ sinh học ứng dụng trong y dược học hiện đại, NXB Y học. 2. Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB