1/ Đặt vấn đề : PHẦN MỞ ĐẦU DUNG Công nghệ sinh học ngành khoa học mũi nhọn, phát triển sở kĩ thuật mẻ: kĩ thuật di truyền, kĩ thuật dung hợp tế bào; kĩ thuật nuôi cấy mô; kĩ thuật nuôi cấy tế bào; kĩ thuật cấy chuyển phôi….Những thành tựu chuẩn bị cho cách mạng sinh học ngành kinh tế-kĩ thuật Phương pháp nuôi cấy mô áp dụng từ lâu nhà trồng hoa nhà chọn giống muốn nhân nhanh giống đặc cấp, cải thiện hiệu thời kì chọn lọc Ni cấy mơ tế bào thực vật tiến hành Việt Nam từ năm 70 Hiện nay, nước có vài chục phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào Phần lớn phịng thí nghiệm tiến hành nghiên cứu ứng dụng: chủ yếu vi nhân giống ống nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật cịn có khả đóng góp cho nnhững nghiên cứu ứng dụng xa nữa, đặc biệt cải biến di truyền (chọn dịng tế bào, đột biến tế bào, ni cấy bao/hạt phấn, lai tế bào, chuyển gen) công nghệ thu nhận chất có hoạt tính sinh học Đề tài “Các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật” giúp cho người viết có kiến thức ni cấy mô tế bào thực vật, hướng nghiên cứu ứng dụng tiến hành thành công phịng thí nghiệm 2/ Đối tượng phạm vi nghiên cứu : Đối tượng nghiên cứu: mô tế bào thực vật, thành phần môi trường chất kích thích sinh trưởng Phạm vi nghiên cứu: đề cập đến hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật 3/ Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu đề tài phương pháp tổng hợp tài liệu lấy từ nguồn thông tin thư viện, báo đài, internet Dựa vào phân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu tài liệu để thực đề tài Mặc dù đề tài chuẩn bị công phu, chắn sơ suất, mong góp ý q thầy hướng dẫn bạn đồng nghiệp Tác giả chân thành biết ơn 4/ Cấu trúc tiểu luận: Phần 1: Vi nhân giống in vitro Phần 2: Tạo đơn bội ứng dụng nghiên cứu thực tiễn Phần 3: Chọn dòng tế bào thực vật Phần 4: Dung hợp protoplast lai tế bào sôma Phần 5: Chuyển gen thực vật Phần 6: Sự phát triển thành tựu nuôi cấy mô tế bào thực vật Việt Nam MỤC LỤC Trang Phần mở đầu Phần nội dung .3 Phần 1: Vi nhân giống in vitro………………………………………………………………………………………………… -1- Phần 2: Tạo đơn bội ứng dụng nghiên cứu thực tiễn……………… ……… I Các yếu tố ảnh hưởng lên hình thành phơi mơ sẹo Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro II Tái sinh III.Ứng dụng đơn bội từ hạt phấn Phần 3: Chọn dòng tế bào thưcï vật…………………………………………………………………………………………… I Cơ sở khoa học II Vật liệu phương pháp chọn dòng III Chọn dòng chịu bệnh .8 IV Chọn dòng chống chịu stress môi trường 11 V Chọn dòng tế bào cho suất chất thứ cấp cao 13 Phần 4: Dung hợp protoplast lai tế bào sôma………………………………………………………………… 15 I Dung hợp protoplast lai nhân .15 II Lai tế bào chất .18 Phần 5: Chuyển gen thực vật………………………………………………………………… ………………………………….21 I Một số vấn đề chung chuyển gen thực vật 21 II Các phương pháp chuyển gen 22 Chuyển gen Agrobacterium 22 Phương pháp nhiễm Agrobacterium virus 23 Phương pháp chuyển gen trực tiếp .23 Phương pháp bắn gen 23 Phương pháp vi tiêm 24 Phần 6: Sự phát triển thành tựu nuôi cấy mô tế bào thưc vật Việt Nam……………………………………………………………………………………………… …………………………………………… 25 KẾT LUẬN ….27 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………………………………… …………………28 PHẦN NỘI DUNG -2- Phần 1: VI NHÂN GIỐNG IN VITRO Vi nhân giống in vitro gọi tắt vi nhân giống hệ thống sử dụng phát triển nhân tạo nhân điểm sinh trưởng tồn mô phân sinh Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống quan trọng, khơng định thành cơng ban đầu mà q trình nhân Các cơng trình D.Amato (1977) cho thấy có đỉnh sinh trưởng chồi bảo đảm ổn định di truyền Tiếp đến đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm bệnh nguyên liệu tốt để nhân Các chồi nhân ban đầu thường tạo từ đỉnh chồi đỉnh mô phân sinh môi trường thạch chứa muối khống, cabonhydrat, vitamin chất điều hòa sinh trưởng Vi nhân giống bắt đầu tách đỉnh chồi mô phân sinh từ định nhân sau khử trùng đưa vào ni cấy môi trường phù hợp Sự phát triển nhanh mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng nhiệt độ Chồi nhân lên sau đến tuần Các chồi hình thành lại tách chuyển sang mơi trường qui trình lặp lại Trong số trường hợp, rễ tạo môi trường nhân, số trường hợp khác, chồi nhân phải chuyển sang mơi trường có auxin khơng có auxin để tạo rễ Đây phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp phương pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo phôi, chồi nhân giữ lại đặc điểm phôi gốc, khơng bị thay đổi mặt di truyền Hiện nhờ phát triển môi trường hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân tăng lên nhiều (5 – 515 chồi/tháng) Đặc biệt nhân chồi mơi trường lỏng có lắc nhân reactor Trong số trường hợp, vi nhân giống thực thơng qua việc tạo phôi tái sinh thẳng từ mô sẹo Phương pháp cho hệ số nhân cao hơn, thường kéo theo biến dị sôma nên trước chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ thay đổi di truyền Vi nhân giống có ưu việt sau: -Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất -Nhân số lượng lớn diện tích nhỏ Trong m để tới 18.000 -Cây làm bệnh không tiếp xúc với nguồn bệnh bảo đảm giống bệnh -Thuận tiện hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 dâu tây nặng 15kg) Việc bảo quản giống thuận lợi Các giống giữ nhiệt độ oC hàng tháng cho tỉ lệ sống đền 95% Nhu cầu giống nhân in vitro ngày nhiều Mấy năm gần đây, hàng năm giới sản xuất khoảng 50 triệu Ước tính phải đạt 250 triệu cây/năm đáp ứng yêu cầu thực tiễn Một vấn đề giá trồng nhân phương pháp vi nhân cao (2500 – 3000 đ/cây) cần phải cải tiến qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt giới hóa khâu nhân nhân giống thật q có giá trị kinh tế cao Trên thực tế nhân phương pháp vi nhân đắt giống từ hạt Hiện nhân giống thành công nhiều giống lan, hoa cúc, hoa hồng, cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông… Vi nhân giống ngồi việc ứng dụng để nhân nhanh số giống cịn rút ngắn thời gian đưa lai lồi nguyên chủng tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất nhân nhanh bố mẹ cặp lai sảnh xuất hạt lai Phần 2: TẠO CÂY ĐƠN BỘI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC TIỄN -3- Có nhiều phương pháp tạo đơn bội, từ năm 60, việc tạo đơn bội nuôi cấy bao phấn hạt phấn phát triển Cây đơn bội nhận nuôi cấy bao phấn hạt phấn môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976) Trong q trình ni cấy, hạt phấn phân chia, tạo mơ sẹo phơi tạo I.Các yếu tố ảnh hưởng lên hình thành phôi mô sẹo 1.Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy Trạng thái sinh lý cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng lớn đến hạt phấn nuôi cấy in vitro Tuổi cây, thay đổi chu kỳ quang nhiệt độ yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo đơn bội Kết nghiên cứu Dunwell (1976) cho thấùy tỉ lệ phôi cao nhận sử dụng nụ hoa hình thành sớm phát triển nhiệt độ thấp ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ hạt phấn cao Ở số loại hạt phấn giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi mô cao, số giống khác hạt phấn giai đoạn mitos đầu cho hiệu tốt Vấn đề kiểu gen quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấùn khoai tây nhị bội tạo từ đơn bội sử dụng để ni bao phấn có hiệu so với bao phấn từ bố mẹ Ngồi xử lí bao phấn nhiệt độ thấp (3 – 10oC) gia tăng tỉ lệ tạo mô phôi từ hạt phấn (Wenzel & cs, 1977) 2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro Thành phần cacbonhydrat môi trường quan trọng, đặc biệt đường sucrose nuôi cấy bao phấn thuốc cần từ 2% đến 4% Đối với khoai tây lúa cần đến 6%, chí 12% Trong chất hữu cơ, axit glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi số giống cải thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc Các dịch chiết tự nhiên dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm số chất khác vitamin C, nước dừa có tác dụng tích cực cho tạo phơi, mơ sẹo tái sinh nuôi cấy bao phấn Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo lại ức chế tạo phơi Vì trường hợp tạo phơi cần tránh sử dụng auxin Nói chung auxin thường có tác dụng giai đoạn ni cấy ban đầu Cytokinin quan trọng cho phản ứng hạt phấn nuôi cấy Trong số trường hợp ethylen kích thích tạo mô sẹo Wilson & cs (1978) cho biết nuôi cấy bao phấn môi trường lỏng làm tăng tần số tạo phôi thuốc lúa mạch Bổ sung vào mơi trường than hoạt tính có tác dụng loại bỏ chất ức chế làm tăng hiệu nuôi cấy bao phấn Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu ni cấy Đối với thuốc mật độ tối ưu 105 hạt/ml môi trường Đối với khác mật độ dao động từ 104 đến 105 Aùnh sáng nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, thuốc cần 300-500 lux Nhiệt độ bình thường từ 25-28 oC thích hợp nuôi cấy bao phấn hạt phấn hầu hết giống II.Tái sinh Việc tái sinh từ bao phấn thuốc số họ cà khác tương đối dễ, chí tái sinh môi trường tạo mô sẹo tạo phôi Đối với số lồi khác, mầm (lúa, ngơ, mì), mơi trường nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh trưởng đường cao tái sinh cây, muốn tái sinh phải chuyển sang mơi trường khơng có chất điều hòa sinh trưởng Một số trường hợp phải dùng zeatin nước dừa tái sinh -4- Trong trường hợp tạo qua mô sẹo, việc tái sinh xảy mơi trường khơng có chất điều hịa sinh trưởng, thường phải chuyển sang mơi trường có nồng độ auxin thấp nồng độ cytokinin Các cytokinin thường hay dùng BAP kinetin Cho thêm chất casein, lactoabumin thủy phân nước dừa thường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh ngũ cốc Mô già lâu không cấy chuyển mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ lệ tái sinh thấp khả tái sinh Khi nuôi cấy bao phấn, ngũ cốc thường có tượng tái sinh nhiều bạch tạng (có đến 50%) Wang cs (1977) thấy tăng nhiệt độ nồng độ 2,4D nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ bạch tạng cao Ngồi ra, bạch tạng xuất nhiều từ bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping, 1978) Phần lớn tái sinh từ hạt phấn đơn bội, số lồi có nhị bội đa bội Những kết nghiên cứu tế bào học cho thấy tạo thành nhị bội đa bội kết dung hợp nhân nhân di truyền mà khơng có phân chia nhân xảy q trình ni cấy III.Ứng dụng đơn bội từ hạt phấn Các đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trước hết làm nguyên liệu để tạo dòng Muốn tạo dịng phải lương bội hóa đơn bội xử lí consixin thơng qua tạo mơ sẹo từ đơn bội sau tái sinh Như nói trên, số lịai nhận nhị bội q trình ni cấy bao phấn hạt phấn, trường hợp cần kiểm tra sinh hóa tế bào học kỹ lưỡng Các dịng có ý nghĩa lớn cải biến trồng Chúng sử dụng tạo lai khỏe mạnh từ cặp lai bố mẹ bất tương hợp ( Chu & cs, 1978) rút ngắn thời gian tạo hạt lai Các dòng đơn bội kép tạo ứng dụng sản xuất lúa mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa… Trong thời gian ngắn khoảng đến năm hai giống thuốc cho suất cao chất lượng tuyệt hảo tạo phương pháp cấy bao phấn (Hu han & cs, 1978) Nhiều giống lúa Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976), giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) tạo phương pháp nuôi cấy hạt phán Ngồi dòng đơn bội kép sử dụng để phát triển quần thể cho việc lập đồ phân tử Trong nghiên cứu, đơn bội đối tượng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi cặp NST, ngồi phân tích di truyền quần thể đơn bội để xác định kiểu di truyền tính trạng lặn Các đơn bội cịn dùng làm nguyên liệu tạo đa bội lệch Cây đơn bội dùng lai khác lòai để rút ngắn thời gian ổn định NST Nuôi cấy bao phấn ứng dụng để nghiên cứu tạo đột biến Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn Bao phấn hạt phấn Giống Nuôi cấy bao phấn Cây đơn bội Lưỡng bội hóa Cây lưỡng bội Dòng -5- Dòng siêu chủng Phần 3: CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV) I.Cơ sở khoa học Cơ sở khoa học CDTBTV tế bào thực vật mang tính tồn Mỗi lồi thực vật có khả tái sinh khác Cơ sở thứ hai mô quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm số lượng lớn tế bào khơng đồng Vì quần thể tế bào ni cấy xem quần thể thực vật diễn thay đổi kiểu gen, kiểu hình tuổi Khi tế bào tái sinh thành thể thay đổi mức độ thể, chí có quần thể tế bào phát triển từ tế bào ban đầu suốt trình sinh trưởng phát triển tế bào đến hình thành thể hồn chỉnh diễn nhiều thay đổi di truyền ảnh hưởng yếu tố môi trường nuôi cấy, đặc biệt chất điều hịa sinh trưởng Mặt khác, có quần thể tế bào đồng mặt sinh lý, di truyền phát triển, quần thể tế bào đối tượng lí tưởng việc sử dụng chất gây đột biến để thu nhận đột biến có ý nghĩa Cũng trồng, ni cấy mơ tế bào, quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình Một loại kết thay đổi gen, gọi thay đổi di truyền, cịn loại khơng liên quan đến thay đổi gen, gọi biến đổi ngồi gen Những thay đổi ngồi gen không di truyền Ngồi vấn đề vừa nêu, nuôi cấy mơ tế bào cịn gặp tượng phổ biến là: phần đáng kể mô tái sinh từ cụm tế bào chí từ tế bào thay đổi số đặc điểm mà không cần áp dụng phương pháp chọn lọc Hiện tượng gọi tượng phân dịng sơma Có tác giả gọi dịng tái sinh từ tế bào nuôi cấy “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi dòng tái sinh từ protoplast “protoclones” (Sheppard & cs, 1980) Larkin va Scowcroft (1981) đưa định nghĩa có tính chất khái quát “somaclonal variation’ để tất thay đổi tái sinh từ loại tế bào nuôi cấy II.Vật liệu phương pháp chọn dịng Chọn vật liệu cho thí nghiệm CDTBTV quan trọng Các vật liệu tế bào mơ phân hóa Mỗi loại vật liệu có ưu điểm nhược điểm riêng Việc chọn vật liệu hay vật liệu khác phụ thuộc vào phục phương pháp nuôi cấy loại Vật liệu thường dùng CDTBTV mô sẹo (callus) Mô sẹo dùng để chọn dòng chống chịu chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối (McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), chọn dòng cho suất chất thứ cấp cao (Nozue cs, 1987; Hiraoka, 1986) Đối với mơ sẹo sử dụng phương pháp chọn lọc trực tiếp tức chọn môi trường chọn lọc chứa nồng độ định chất chọn lọc, mô tế bào đột biến có tính chọn lọc hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phương pháp chọn lọc bước tức mô tế bào sống sót nồng độ định tác nhân chọn lọc lại chuyển sang nồng độ cao Ngồi sử dụng kết hợp hai phương pháp Sự ổn định mô chọn lọc khả phát triển bình thường liên tục môi trường chọn lọc chuyển môi trường chọn lọc sau thời gian dài cấy môi trường không chọn lọc đặc điểm chọn lọc Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có ưu điểm đơn giản nguyên liệu có số nhược điểm là: dễ tạo dạng khảm mơ chọn lọc cịn có nhiều tế bào bình thường nên tái sinh cây, quần thể tái sinh có mang đặc điểm chọn lọc mang đặc điểm giống bố mẹ, chí có phần chứa tế bào chọn lọc, phần khác chứa tế bào bình thường Để khắc phục -6- nhược điểm giảm kích thước mơ: mơ nhỏ tốt Trọng lượng mơ thường dùng 100-150 mg, giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha & Widholin, 1987) Tế bào nuôi cấy dịch lỏng nhiều tác giả sử dụng CDTBTV (Kishinami & Widholin, 1986; Watad cs, 1985) Đối với loại tế bào phương pháp chọn lọc trực tiếp chọn bước tiến hành có kết nhiều đối tượng Sử dụng tế bào dịch lỏng để CDTBTV có ưu điểm tế bào cụm nhỏ tế bào tiếp xúc đồng với tác nhân chọn lọc, nhược điểm quan trọng sau chọn lọc khả tái sinh bị giảm đáng kể nhiều trường hợp hẳn Hầu hết dịng chọn lọc thơng qua hệ thống tế bào dịch lỏng không nhận đuợc (Dix, 1990) Vì hệ thống tế bào dịch lỏng sử dụng để chọn dịng có khả tổng hợp tích lũy chất thứ cấp phù hợp Trong trường hợp tế bào dịch lỏng đáp ứng mục đích ni cấy tế bào qui mô lớn đặc biệt việc sử dụng công nghệ nuôi tế bào thực vật qui mô công nghiệp Protoplast (tế bào trần) thực vật nguyên liệu đáp ứng nhiều mặt CDTBTV Protoplast hệ thống tế bào đơn triệt để Từng tế bào phát triển đồng môi trường, tế bào phân chia tạo quần thể tế bào mô sẹo, cuối mô sẹo tái sinh thành hồn chỉnh, tránh tượng khảm Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs, 1986) dòng cho suất chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast Trước việc nuôi cấy tái sinh từ protoplast cịn gặp nhiều khó khăn, tái sinh từ protoplast lồi có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống ni cấy protoplat CDTBTV cịn bị hạn chế Hiện hệ thống nuôi cấy protoplast với hiệu cao nhiều lồi có trồng quan trọng khoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì cơng bố Vì protoplast trở thành vật liệu lý tưởng cho CDTBTV Cần phải nói thêm protoplast cịn đối tượng quan trọng cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt dung hợp tế bào chuyển gen Để tránh khó khăn tái sinh từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng protoplast, số tác giả sử dụng mơ phân hóa mơ tách rời làm nguyên liệu CDTBTV Một mô phân hóa sử dụng phơi từ hạt (Kueh & Bright, 1981) phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984) Fluhr & cs (1985) chọn dịng kháng thuốc xử lí mầm kháng sinh McCabe & cs (1989) nhận dòng kháng thuốc xử lí mảnh Bên cạnh việc sử dụng phương pháp chọn lọc in vitro mô sẹo , tế bào dịch lỏng, prptoplast mơ phân hóa kết hợp xử lí tác nhân gây đột biến để làm tăng dần số đột biến kiểu đột biến Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau tách tia cực tím (UV) N-methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG) Phương pháp tương tự số tác giả khác tiến hành có hiệu sử dụng N-ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, tia X (Maliga & cs, 1981) Ngồi xử lí mẫu vật chất gây đột biến trước đưa vào nuôi cấy chọn lọc III.Chọn dòng chịu bệnh: Mặc dù phương pháp truyền thống tạo dịng giống chịu bệnh vài trường hợp chọn dòng chịu bệnh phương pháp chọn tốn nhiều công sức thời gian Việc gây nhiễm bệnh nhân tạo cho số lượng lớn để tạo chọn giống chịu bệnh vấn đề, ngồi gây nhiễm nhà kính nhiều khơng thành cơng Khơng -7- phương pháp truyền thống việc chọn đột biến đơn gen đa gen kháng loại bệnh gặp nhiều hạn chế: thứ phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai lai ngược nhiều thời gian, thứ ba không chuyển gen lặn nhiều gen lúc Đặc biệt lồi nhân vô tính chuyển gen khơng thể thực lai tạo Đột biến thực nghiệâm tạo giống chịu bệnh tần số xuất đột biến đơn gen thấp (10 -4 – 10-6), ngồi tỉ lệ khảm đột biến tương đối cao Từ 1970 có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro khắc phục nhiều vấn đề chọn dòng chịu bệnh như: qui mơ thí nghiệm, thời gian chọn lọc, khống chế điều kiện gây nhiễm Ngồi nhận đột biến đơn gen đột biến lặn Nếu tần số đột biến đơn gen trường hợp đột biến thực nghiệm 10 -4 – 10-6 quần thể tái sinh (Ro) từ mơ tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981) Nếu kết hợp xử lí tác nhân gây đột biến ni cấy in vitro làm tăng tần số đột biến ( Maliga & cs, 1981) Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh điều kiện in vitro có số vấn đề cần nghiên cứu giải vấn đề tương hợp chủ tác nhân gây bệnh đối tượng lây nhiễm mô sẹo tế bào tự nhiên tác nhân gây bệnh không nhận chủ (nhất nấm kháng sinh) Để chọn dịng chịu bệnh sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh độc tố gây bệnh (ĐTGB) Phần lớn tác nhân gây bệnh sử dụng virus đối tượng lây nhiễm protoplast Vấn đề then chốt phải tạo quần thể tế bào bị nhiễm đồng phân biệt tế bào chịu bệnh với tế bào khơng bị nhiễm hai có khả phát triển điều kiện nuôi cấy Để giải vấn đề trên, Shepard (1975), Murakishi Carlson (1982) tách protoplast từ bị lây nhiễm liên tục, sau ni vấy chọn lọc Murakishi Carlson sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu vàng lây nhiễm thuốc đơn đơn bội, sau cấy mảnh lên mơi trường phù hợp cho sinh trưởng tế bào virus kháng virus Các tác giả thấy mô từ tế bào virus sinh trưởng nhanh có màu xanh, tế bào kháng virus sinh trưởng chậm có màu vàng Một số nấm vi khuẩn gây bệnh Phoma lingam, Plamidomonas brassicae (Sacristan, 1955; Sacristan Hoffman, 1979; Pullman Rappaport, 1983; Prasad & cs, 1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs, 1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae (Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977), Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) sử dụng để chọn dòng chịu bệnh Prasad cs (1984) chọn dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sương phương pháp tái sinh từ hoa tự non bị nhiễm nấm Sun & cs (1986) nuôi mô sẹo từ phôi lúa với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae chọn dòng kháng bệnh Một số tác giả khác tiến hành gây nhiễm tái sinh từ mô điều kiện in vitro nhận kết đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass, 1986; Joung & cs, 1987) Ngồi đưa tái sinh từ mô tế bào trồng đất bị nhiễm nấm, hướng chưa tiến hành nhiều Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ số nấm vi khuẩn dùng nhiều chọn dòng chịu bệnh, sử dụng ĐTGB chọn dịng có ưu điểm tế bào bị nhiễm đồng nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), sử dụng nguyên liệu cách đa dạng Ngồi cịn có tương quan thuận kháng ĐTGB điều kiện in vitro in vivo Chọn dòng kháng ĐTGB tiến hành thành công protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dịch lỏng (Connell & -8- Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey, 1986), phôi thứ cấp (Sacristan, 1982) đỉnh chồi (Gantotti & cs, 1985) Sử dụng ĐTGB tế bào mở nhiều triển vọng chọn đột biến kháng bệnh (Carlson, 1973) Bên cạnh ưu điểm ĐTGB, chọn dòng chịu bệnh cần lưu ý số vấn đề xác định cụ thể vai trị độc tố q trình gây bệnh nhiều trường hợp bị bệnh không phát có độc tố xác định có độc tố gây bệnh độc tố lại khơng có vai trị việc gây bệnh (Scheffer, 1983) Một vấn đề nhiều trường hợp tái sinh từ mơ kháng ĐTGB lại khơng có khả kháng bệnh Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho có đặc điểm tái sinh, ta tái sinh số lượng nhiều đến mức cần thiết có mang đặc điểm mong đợi Điều khẳng định cơng trình Thanutong & cs (1983) Các tác giả nhận 10-20% số tái sinh có khả kháng độc tố Pseudomonas độc tố Alternaria ĐTGB dùng chọn dịng chịu bệnh dạng thô tinh khiết ĐTGB thô dạng dịch chiết từ nấm vi khuẩn sử dụng nhiều để chọn dòng chịu bệnh Nhiều dòng kháng ĐTGB công bố sử dụng ĐTGB thô khoai tây kháng P.infestas (Behnke, 1979), thuốc kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984) Brettel & cs (1980), Rines Luke (1985) nhận dịng ngơ kháng H.maydis r.t dịng lúa mạch kháng H.victoriae sử dụng độc tố (tinh khiết) từ hai loại nấm Ngồi phương pháp chọn dòng chịu bệnh điều kiện in vitro, xử lí tế bào, mô tái sinh từ tế bào mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh ĐTGB, ứng dụng khả phân dịng sơma tái sinh từ tế bào mơ, ta chọn dịng chịu bệnh mà khơng cần xử lí tác nhân gây bệnh Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980; Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) chọn dòng chịu bệnh theo phương pháp Giống mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) giống lhoai lang “Sarlet” chịu bệnh (Moyer & Collins, 1983) chọn đưa vào sản xuất Hiện việc tái sinh từ tế bào mô trở nên dễ dàng hầu hết giống chọn lọc theo hướng có nhiều hứa hẹn thực tế có giống chịu bệnh đuợc đưa vào sản xuất có số mặt hạn chế phương pháp này: Thứ phải thử nghiệm quần thể lớn tái sinh điều kiện tự nhiên; thứ hai phân dịng sơma làm thay đổi nhiều đặc điểm khác nên nhiều chọn dòng chị bệnh lại ảnh hưởng đến đặc điểm kinh tế (Bidney & Shepard, 1981) Nhìn chung có nhiều cơng trình mở triển vọng việc sử dụng nuôi cấy mô tế bào để chọn dòng chịu bệnh trồng nhiều vấn đề cần giải chế tương hợp chủ (mô tế bào) với tác nhân gây bệnh, liên quan đến vấn đề chế nhiễm bệnh điều kiện nuôi cấy in vitro Một vấn đề quan trọng xác định vai trò ĐTGB trình chọn lọc in vitro Một số vấn đề liên quan mặt kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào rút ngắn thời gian nuôi cấy tái sinh để tránh thay đổi hình thái số đặc điểm khác Việc chọn lựa đối tượng để áp dụng kĩ thuật ni cấy mơ tế bào vào chọn dịng chịu bệnh quan trọng Một số tác giả khác cho ni cấy mơ, tế bào áp dụng để chọn dòng chịu bệnh lồi sinh sản vơ tính phù hợp có kết (Daub, 1986; Jones, 1990) Ngồi nuôi cấy mơ tế bào áp dụng để chọn dòng chịu bệnh đơn gen chịu -9- bệnh mang gen lặn (Jones, 1990) Việc sử dụng ĐTGB khơng đặc hiệu để chọn dịng chịu bệnh đặc biệt mà phương pháp thông thường không chọn được đề cập (Jones, 1990) IV.Chọn dịng chống chịu stress mơi trường Các stress môi trường bao gồm điều kiện bất lợi mơi trường phèn, chua, mặn, khơ, hạn, nóng, lạnh Việc chọn tạo giống trồng chống chịu stress môi trường cần thiết Theo Nabors (1990) có 25% đất trồng bị mặn (chủ yếu NaCl), 25% số đất chua (là ion nhôm) 40-60% đất khô hạn Ngồi việc cải tạo mơi trường tưới tiêu, bón phân, sử dụng chất diệt sâu bọ diệt cỏ dẫn đến việc cần thiết chọn tạo giống trồng chống chịu với tác nhân Như trình bày phần trên, ni cấy mơ tế bào đóng góp phần việc tạo chọn dòng chống chịu stress môi trường Trước giới thiệu số thành tựu lĩng vực đề cập đến số vấn đề liên quan đến sở phương pháp chọn dịng chống chịu stress mơi trường Ngồi số vấn đề chung đề cập phần chọn dòng chịu bệnh dòng cho suất chất thứ cấp cao, chọn dòng chống chịu stress mơi trường cịn có số vấn đề liên quan đến sở tính chống chịu mức độ tế bào hồn chỉnh.Đặc biệt sở di truyền tính chống chịu stress mơi trường chưa biết rõ.Nhiều tác giả cho có nhiều alen tham gia vào tính chống chịu stress môi trường, ngồi alen thường lặn nên trường hợp dị hợp tử Đây vấn đề làm cho việc chọn dịng chống chịu stress mơi trường chưa có thành tựu mong muốn Ngồi số vấn đề quan trọng tương quan khả chống chịu stress môi trường hồn chỉnh tế bào ni cấy phức tạp chọn dịng ni cấy mơ khơng tạo chống chịu điều kiện đặc biệt đồng ruộng Mặc dù có số vấn đề quan trọng nêu trên, thực tế có sở số liệu đáng tin cậy triển vọng ứng dụng nuôi cấy mô tế bào để chọn dòng chống chịu với stress môi trường: biết nhiều đặc điểm đa gen biến đổi đột biến xảy gen tham gia vào đặc điểm Những kết nghiên cứu Gorham cs ( 1987 ) Ashraf cs ( 1986 ) cho thấy tính chống chịu với số stress liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể di truyền qua hệ sau Ngồi có số liệu phân ly theo Mendel đặc điểm chọn lọc (Comner & Meredits, 1985) Cho đến hầu hết cơng trình chọn dịng chống chịu stress môi trường chọn theo phương pháp chọn lọc trực tiếp Việc tiến hành xử lý stress tiến hành mơ sẹo (callus) hình thành mơ sẹo phát triển Các stress mức độ thấp mức độ gây chết, xử lý nồng độ định tế bào chịu nồng độ lại đưa lên nồng độ cao Việc tiến hành xử lý liên tục gián đoạn, thời gian xử lý ngắn dài Cho đến chưa có nghiên cứu so sánh cụ thể trường hợp Tốt tùy đối tượng cụ thể mà kết hợp việc chọn lọc theo cách hay cách khác Đây vấn đề nghiên cứu mặt phương pháp hết quan trọng, đóng góp vào thành cơng việc chọn dịng chống chịu stress môi trường Muốn nhận đột biến đột biến lặn, chọn lọc tiến hành mô đơn bội từ hạt phấn, chọn lọc mô đơn bội từ hạt phấn lai F nhận đột biến đơn gen tái tổ hợp alen sẵn có - 10 - Trong năm gần có bước tiến đáng kể việc chọn dòng chống chịu muối, hạn, chua nhiệt độ Nhiều dòng chịu muối (NaCl) chọn lọc từ mô nuôi cấy lồi Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium, Ipomoea babatas L (Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985), Medicago sativa L (McCoy 1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and Swartz, 1984) Tính chống chịu vài trường hợp thông báo ổn định mức độ tế bào hồn chỉnh (Winnicov, 1991) Về chế tính chịu muối có kết đáng ghi nhận Ở Việt Nam việc tiến hành chọn dòng thuốc địa phương chịu muối tiến hành thu kết tiến (Nguyễn Hồng Lộc & cs, 1990) Kết nghiên cứu số tác giả cho thấy abscisic axit (ABA) chất có liên quan đến việc tổng hợp protein (đặc biệt protein với phân tử lượng 26) xuất dòng chịu muối (Sigh & cs, 1987) Mối tương quan ABA, tính chịu muối tổng hợp protein đặc biệt vấn đề nghiên cứu lý thú năm tới Các dòng chịu hạn thông báo (Bressan & cs, 1981, Hand & cs, 1983), tác giả sử dụng chất gây hạn PEG 4000 PEG 6000 đưa vào môi trường để chọn Vấn đề tạo dịng kháng nhơm Couner cs nghiên cứu tỉ mỉ (Conner & Meredith, 1985) Các tác giả chọn dòng thuốc kháng nhơm ổn định, tính kháng nhơm đặc điểm trội di truyền qua hệ sau Việc chọn dòng chống chịu với nhiệt độ thấp cao có tiến bộ: Preil cs (1983) nhận cúc chịu nhiệt độ thấp Nhìn chung phần lớn nghiên cứu từ trước đến tập trung vào tìm chế tính chịu lạnh chịu nóng Những kết Chen Gusta (198) nhận Triticum aetivum L, Secale cereale L, Bromus inermis Leyss cho thấy ABA làm tăng khả chịu lạnh đáng kể Các tác giả cho ABA chất cần thiết để tạo dòng chịu lạnh Orr cs nhận kết tương tự tác dụng ABA Cả tính chịu lạnh tính chịu nhiệt liên quan đến việc tổng hợp hàng loạt protein vai trò cụ thể loại protein nào? Chúng có vai trị q trình chịu lạnh chịu nhiệt cao? Đây câu hỏi để ngỏ Chọn dòng chống chịu stress môi trường yêu cầu chiến lược công tác giống trồng phần lớn cơng trình tập trung vào tìm kiếm phương pháp chọn lọc tìm chế loại chống chịu Những kết nhận sở ban đầu Để có thành cơng tương lai có áp dụng vào thực tiễn nghiên cứu thuộc hai hướng điều quan tâm hàng đầu V Chọn dòng tế bào cho suất chất thứ cấp cao Các chất thứ cấp thực vật hợp chất thể thực vật vai trị q trình sống bản, hợp chất giữ vai trò thứ cấp Thực mặt tiến hố, chất thứ cấp đóng vai trị quan trọng trình đấu tranh sinh tồn chất độc động vật vi sinh vật, chất có tác dụng quyến rũ trùng có mầu sắc hương vị đặc biệt Sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào năm gần mở triển vọng sử dụng kỹ thuật để nuôi sinh khối lớn có khả tổng hợp chất thứ cấp Hiện có nhiều phịng thí nghiệm ký với hãng sản xuất để thu nhận chất thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy quy mô cơng nghiệp Một u cầu q trình công nghiệp hố tế bào nuôi cấy để thu nhận chất thứ cấp vấn đề tạo dòng cho suất cao ổn định - 11 - Vật liệu thường dùng để chọn dòng tế bào cho suất chất thứ cấp cao mô tế bào nuôi cấy dịch lỏng Đối với chất thứ cấp có màu, chọn mắt Đối với chất thứ cấp khơng có màu trước cấy chuyển cần phân tích Đây việc làm tốn nhiều công sức thời gian Để khắc phục, Ogino cs (1978) đưa phương pháp ép tế bào Theo phương pháp này, cụm tế bào mô ép hai tờ giấy lọc, nhựa tế bào ngấm vào giấy lọc sau dùng phương pháp nhuộm để xác định Đối với số chất tế bào tiết mơi trường xác định theo phương pháp dùng màng phủ than hoạt tính để hấp thụ chất sau dùng tia cực tím (UV) để xác định (Knoop and Beiderback, 198) Ngồi sử dụng phương pháp xác định dựa vào tính chất kìm hãm phát triển vi khuẩn chất tế bào tiết berberine chẳng hạn (Suzuki & cs, 1987) Các phương pháp khác phóng xạ phân biệt tế bào huỳnh quang sử dụng Để thiết lập hệ thống chọn dòng tế bào cho suất chất thứ cấp cao thành công, việc nghiên cứu yếu tố liên quan đến tích lũy chất tế bào nuôi cấy quan trọng, vấn đề chưa sáng tỏ.Tuy nhiên vai trò chất điều hồ sinh trưởng nồng độ đường ghi nhận Hàm lượng chất thứ cấp tế bào phụ thuộc vào tăng trưởng sinh khối, tốc độ tổng hợp tiết môi trường chất Thường thường tế bào nuôi cấy tích lũy chất thứ cấp giai đoạn cuối chu kỳ sinh trưởng (Zenk & cs, 1977) tế bào ni cấy có tốc độ sinh trưởng nhanh không kèm theo gia tăng tốc độ tổng hợp chất thứ cấp Những tế bào nuôi cấy có tốc độ phân chia chậm có ưu việc tạo chất thứ cấp Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho suất chất thứ cấp cao vấn đề nhiều tác giả quan tâm Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ C.roseur có suất cao cho hàm lượng chất thứ cấp cao tế bào dịch lỏng từ có suất thấp Cũng đối tượng Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ có suất cao khơng phải lúc cho suất chất thứ cấp cao Kết công bố lồi khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979) Cho đến chưa có chứng minh chắn tương quan suất làm nguyên liệu suất tế bào nuôi cấy Theo Wilson (1990) nên sử dụng đa dạng di truyền để tạo dòng tế bào khởi đầu Một số tác giả thấy phận khác dùng để tạo dịng tế bào khơng ảnh hưởng tới suất chất thứ cấp (Speake & cs, 1964) Nhiều tác giả khác lại nhận kết cho thấy dòng tế bào từ phận khác cây, chí từ phận cho suất chất thứ cấp khác (Zenk & cs, 1975; Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982) Hall Yeoman (1987) cho biết quần thể tế bào nuôi cấy khả tổng hợp chất (đặc biệt chất màu) khác tế bào Những biến động tích lũy chất thứ cấp sở để tìm phương pháp phù hợp cho việc chọn dòng cho suất cao Cho đến tồn ba hệ thống chọn lọc, hệ thống thứ sử dụng tế bào nuôi cấy đồng ổn định; hệ thống thứ hai sử dụng hổn hợp tế bào, tế bào riêng rẽ ổn định; hệ thống thứ ba sử dụng hỗn hợp tế bào mà tế bào riêng rẽ không ổn định - 12 - Hệ thống chọn lọc thứ tạo dòng cho suất ổn định hệ thống thứ hai thứ ba tạo dòng ổn định không ổn định Một vấn đề quan trọng mà chưa sáng tỏ sở thay đổi kiểu hình, trình điều khiển trao đổi chất thứ cấp tế bào thực vật ni cấy in vitro Để có phương pháp chọn dòng tế bào cho suất chất thứ cấp cao nghiên cứu vấn đề quan trọng Ngồi phương pháp chọn lọc dòng tế bào cho suất chất thứ cấp cao nêu, ứng dụng công nghệ gen để tạo dòng tế bào hướng cần tiến hành, nhiên nhiều vấn đề liên quan chưa hiểu biết đặc biệt sở sinh hố phân tử chu trình trao đổi chất thứ cấp Mặc dù số vấn đề cần giải thành tựu đạt chọn dòng tế bào cho suất chất thứ cấp cao mở triển vọng lớn việc đưa tế bào thực vật ni cấy vào sản xuất chất thứ cấp có ý nghĩa nông nghiệp, công nghiệp y học Đặc biệt phát triển hệ thống công nghiệp để sản xuất sắc tố đỏ chất diệt khuẩn Shikonin Nhật (Curtin, 1983) mở triển vọng công nghiệp hố việc thu nhận chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy Viện Công nghệ sinh học Canada phòng nghiên cứu hãng Vipont hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công nghiệp sản xuất Sangninarine sử dụng sản xuất thuốc đánh (Agricell Report, 1989) Thực vật nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm Các chất khó tổng hợp nguồn cung cấp chủ yếu từ trồng Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng nguồn cung cấp thay việc trồng trọt cho chất quan tâm đặc biệt Vấn đề tìm phương pháp chọn dịng cho suất chất thứ cấp cao khâu then chốt để đưa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mơ cơng nghiệp Những thành tích đạt lĩnh vực đặc biệt việc công nghiệp hố sản xuất Shikonin tế bào nuôi cấy tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật ni cấy để nhận chất thứ cấp có giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận chất thứ cấp năm 80 đối tượng thuốc lá, tam thất, hao, taxus Năm 1988, Phan Huy Bảo cs thông báo chọn dòng tam thất cho hàm lượng saponin cao Những thay đổi hàm lượng nicotine liên quan đến q trình phân hố mơ tái sinh công bố ( Nguyễn Đức Thành cs, 1991 ) Phần 4: DUNG HỢP PROTOPLAST VÀ LAI TẾ BÀO SÔMA I Dung hợp protoplast lai nhân Do khơng có vách xellulơ nên protoplast (tế bào trần) trở thành đối tượng lý tưởng việc nghiên cứu biến đổi di truyền thực vật Bằng phương pháp dung hợp hai loại protoplast tạo đươc lai sôma (lai nhân lai tế bào chất) Ngồi sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển bào quan nhân, lục lạp, ty thể chuyển vectơ mang gen mã hố cho số đặc điểm biết trước - 13 - Protoplast dung hợp tự nhiên Hiện tượng thường xảy sau tách protoplast từ loại Tần số dung hợp tự nhiên phụ thuộc vào giốâng Schieder & Vasil, 1980), cà độc dược (Datura inoxi) tần số đạt tới 8% (Schieder, 1974) Để dung hợp hai loại protoplast khác thường phải xử lý số tác nhân Một số tác giả dùng nước biển (Hofmeister, 1954; Binding, 1966, 1974), nitrat natri (Power & cs, 1970; Carlson, 1972), số khác sùng chất kích thích lectin hiệu suất dung hợp thấp (Hartman & cs, 1973; Burges & Fleming, 1974; Glimelus & cs, 1974) Hiệu suất dung hợp cao đạt cách xử lý protoplast ion Ca 2+ 37oC môi trường kiềm (pH=10,5) (Keller & Melchers, 1973; Binding, 1974; Schieder, 1974) Hiện phương pháp có hiệu sử dụng rộng rãi phương pháp dung hợp Kao đồng nghiệp (Kao & Michayluk, 1974; Constabel & Kao, 1974) Các tác giả dùng polyethylen glycol (PEG) có phân tử lượng cao (6000) để gắn protoplast với Quá trình dung hợp xảy làm lỗng dung dịch PEG môi trường nuôi cấy Khi PEG bị làm lỗng protoplast trở lại bình thường phần tiếp giáp hai protoplast bị vỡ trình dung hợp xảy Trong thời gian Wallin cs sử dụng thành công phương pháp (Wallin & cs, 1974) Nagata thay PEG rượu polyvinyl để dung hợp protoplast thuốc lá, cà rốt họ đậu (Nagata, 1978) Phương pháp sử dụng PEG có hiệu nhiều trường hợp dung hợp protoplast lồi khác lồi, dung hợp tế bào động vật trường hợp dung hợp protoplast thực vật với tế bào động vật (Pontecorvo, 1975; Jone & cs, 1976; Dudits & cs, 1976; Vasil, 1976; Vasil & cs, 1976) Về chế trình dung hợp Nagata Melchers nghiên cứu tỉ mỉ (Nagata & Melchers, 1978) Cuối năm 70 đầu 80 số tác giả đưa phương pháp dung hợp dòng điện (Sanda & cs, 1979; Zimmermann & Sheurich, 1981; Zimmermann, 1982; Zimmermann & Vienken, 1982; Vienken & cs, 1983) Bằng phương pháp này, tác giả đạt tần số dung hợp tới 60 80% Tuy tần số dung hợp có cao vấn đề tái sinh sản phẩm dung hợp lại gặp khó khăn Chỉ gần số tác giả nhận tái sinh sau sử dụng phương pháp dung hợp (Kohn & cs, 1985; Moricawa & cs, 1987) Khi dung hợp hai loại protoplast với thường có ba nguồn gen tham gia (nhân, lục lạp, ty thể ) kết hợp sản phẩm dung hợp Nếu dung hợp hai loại protoplast giống ta tạo sản phẩm đồng hợp gen (homogenome) Trong trường hợp dung hợp hai loại protoplast khác tạo sản phẩm dị hợp gen (heterogenome) Các sản phẩm đồng hợp gen tạo kiểu hình giống bố mẹ với mức bội thể gấp đôi Các sản phẩm dị hợp gen tạo tế bào dị nhân với hỗn hợp lục lạp ty thể Một hai nhân bị thối hố hai phân ly trình phân chia tế bào Sự thối hố phân ly nhân tế bào dị hợp gen tạo tế bào chứa tế bào chất hai loại protoplast có nhân Những tế bào kiểu gọi thể lai tế bào chất Muốn chọn thể lai sơma dung hợp protoplast sử dụng đặc điểm phối hợp, đặc điểm kháng sinh hố đột biến sắc tố, ngồi sử dụng đặc điểm khác tự nhiên loại protoplast - 14 - Melcher người sử dụng phối hợp hai đột biến bạch tạng để chọn sản phẩm dung hợp thuốc (Melchers & Labil, 1974) Một số tác giả khác sử dụng phương pháp tương tự thí nghiệm lai dại lồi P.innoxia (Schieder, 1977) khác lồi P Parodii + P.Hybrida (Cocking 1978), N Tabacum + N Glauca (Evans & cs, 1978) Sự phối hợp đột biến tự dưỡng thiếu nitrate reductase, thiếu axit amin vitamin mẫn cảm với nhiệt độ nhiều tác giả sử dụng có kết (Schieder, 1974; Glimelius & cs, 1978; Muller & Grafe, 1978; Sidorov & cs, 1981; Sidorov & Maliga, 1982; Evola, 1983; Gebhardt & cs, 1983;Shimamoto & cs, 1983) Điều đáng ý đột biến sử dụng để chọn phối hợp phải đột biến lặn khác alen Đặc điểm kháng chất ức chế trao đổi chất sử dụng rộng rãi để chọn thể lai Power cs (1976) sử dụng actinomyxin để chọn thể lai P Parodii P Hybrida Maliga cs (1977, 1982) dùng kanamyxin streptomyxin để chọn thể lai thí nghiệm dung hợp lồi thuốc với Một số dòng tế bào lai chọn khác khả sinh trưởng tái sinh sản phẩm dung hợp loại protoplast (Carlson & cs, 1972; Power & cs, 1977), ưu phát triển lai (Cocking & cs, 1977; Schieder, 1978; Schieder & cs, 1978; Krumbiegel & Schieder, 1979; Dudits & cs, 1979; Lonnerndoker & Schieder, 1980), hình dạng khơng bình thường mô lai (Melchers & cs, 1978; Binding & Nehls, 1978) Năm 1977 Kao đưa phương pháp tách thể dung hợp học Phương pháp Gleba đồng nghiệp phát triển sử dụng phịng thí nghiệm (Gleba & Hofman, 1978; Gleba & cs, 1978; Gleba & Hofman, 1979) Cho đến dung hợp protoplast phương pháp hiệu để tạo lai sơma Nó cho phép tạo tổ hợp lai theo ý muốn Vấn đề phải nghiên cứu cải tiến phương pháp dung hợp, kỹ thuật nuôi cấy phương pháp chọnlọc Từ công trình lịch sử Carlson (Carlson & cs, 1972) đến phương pháp dung hợp protoplast nhà khoa học giới tạo lai sôma từ hàng trăm tổ hợp lai lồi, khác lồi khác chi Đây thành tựu lớn lao mà nhà khoa học đạt lĩnh vực lai sôma dung hợp protoplast Gần nhà nghiên cứu tạo lai sôma giống trồng có ý nghĩa kinh tế khoai tây, cà chua lúa (Handley & cs, 1986; O’Connell & Hasnon, 1986; Ausutin & cs, 1985, 1986; Helgeson & cs, 1986; Terada & cs, 1987; Guri cs, 1988) Qua ta thấy triển vọng lớn lao việc ứng dụng phương pháp để cải biến di truyền thực vật nhằm tạo giống đáp ứng với yêu cầu đòi hỏi thực tiễn II Lai tế bào chất Ngồi việc tạo thể lai sôma chứa dị hợp nhân, dung hợp protoplast cịn tạo thể lai tế bào chất (hay gọi lai sinh chất) Trong năm gần nhiều phòng thí nghiệm Pháp, Thụy Điển, Canada, Ixraen, Nga, Ucrain Hungary đầu tư nhiều cho nghiên cứu lĩnh vực này, đến số đặc điểm chống chịu thực vật chứng minh liên quan đến vật chất di truyền tế bào chất - 15 - Trong thời kỳ đầu, nhà nghiênn cứu cố gắng tạo thể lai tế bào chất cách đưa bào quan tách rời vào protoplast Potrykus người công bố chuyển lục lạp vào protoplast Petunia hybrida (cây yên) khơng có số liệu chứng minh chắn tồn lục lạp tế bào (Potrykus, 1973) Những cơng trình Carlson (1973), Bonnet & Erikson (1974 ) Kung ( 1975) tình trạng tương tự Vasil vợ ông công bố kết chuyển ty thể từ bất dục đực (BDĐ) ngô dã yên vào protoplast bình thường tái sinh (Vasil & Vasil, 1974; Vasil, 1976) Các tác giả xác định gen điều khiển tính BDĐ ngơ Những cơng trình vào lịch sử Từ đến khơng có cơng bố Sở dĩ hạn chế việc tách nhận bào quan nguyên vẹn giữ nguyên hoạt động chúng Đây vấn đề khó khăn trình tách làm sạch, bào quan bị giảm sức sống Ngồi chúng dễ bị ảnh hưởng tác nhân trình dung hợp Mặt khác cơng trình kể hiệu suất dung hợp thấp Bắt đầu từ năm 1978 đến nhà nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp hai loại protoplast, loại có d0ặc điểm di truyền lục lạp ty thể xác định để tạo lai tế bào chất Belliard cs (1978) người sử dụng thành công phương pháp Tuy nhiên tỷ lệ lai tế bào chất nhận cịn thấp việc phân tích di truyền lai nhận bị gặp nhiều khó khăn hình thành thể lai nhân Để khắc phục hạn chế trên, Zelcer đồng nghiệp lần sử dụng phương pháp dung hợp “cho nhận“ (Zelcer & cs, 1978) Ôâng dùng tia X để giết nhân loại protoplast Những protoplast bị chiếu xạ phân chia mà đóng góp tế bào chất trình tạo lai Zelcer dung hợp protoplast giết nhân (protoplast cho tế bào chấ) N Tabacum với protoplast nguyên vẹn (protoplast nhận) N Sylvestris Ôâng chuyển tính BDĐ (đặc điểm ty thể) từ N Tabacum sang N Sylvestris Các đặc điểm liên quan tới lục lạp chuyển thành công nhờ phương pháp (Beversdorf & cs, 1980; Menczel & cs, 1982; Aviv & cs, 1984; Fluhr & cs, 1983, 1984, 1985; Kemble & Barsby, 1988) Ngồi việc dùng tia phóng xạ để giết nhân dùng số chất hố học iodoacetate (Medgyey & cs, 1980), dùng ly tâm để loại bỏ nhân (Wallin & cs, 1977; Maliga & cs, 1982) Nhưng trường hợp tỷ lệ nhân sống sót cịn đáng kể Đối với đặc điểm di truyền lục lạp dễ dàng chọn lọc theo dõi sau dung hợp thị di truyền lục lạp đột biến lạp thể (Gleba & cs,1978), đột biến kháng sinh hố kháng số độc tố nấm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs, 1985), đột biến kháng thuốc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo & Maliga, 1982; Cseplo & cs, 1984) đột biến kháng chất diệt cỏ ( Gressel & cs, 1984) Đại phân tử enzim ribulozo 1,5 difotfat carbonxylase tổng hợp nhờ thông tin di truyền lục lạp sử dụng để nghiên cứu sinh hố lục lạp (Kung & cs, 1975) Phương pháp phân tích sinh hố xác phương pháp phân tích điện di đồ ADN lục lạp (cpADN) sau dùng enzim cắt giới hạn, cắt cpADN thành đoạn khác phân lập đoạn cắt điện di (Belliard & cs, 1978) Hiện phương pháp sử dụng rộng rãi nhiều phòng thí nghiệm giới Ngồi khả sử dụng - 16 - với tổ hợp lai nào, phuơng pháp cịn xác chophép xác định 1% hỗn hợp cpADN Khác với lục lạp đặc điểm liên quan tới ty thể thị để chọn ni cấy in vitro Một số tác giả dùng thị lục lạp để chọn (Medgyesy & cs, 1980; Menczel & cs, 1982) Trường hợp sử dụng lục lạp ty thể liên kết với theo chế Nghiên cứu hình thái hoa gíup cho việc xác định ty thể ngoại lai lai Tính BDĐ sử dụng làm thị để chọn đặc điểm ty thể thuốc Belliard & cs, 1979) dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980) Giống lục lạp phương pháp phân tích điện di đồ ADN ty thể (mtADN) sử dụng rộng rãi để xác định ty thể lai tế bào chất Belliard cs dùng phương pháp để nghiên cứu ty thể lai thí nghiệm dung hợp protoplast thuốc phát thấy tái tổ hợp mtADN lai (Belliard & cs, 1979) Tiếp sau Nagy cs (1981), Galun cs (1982) nhiều tác giả khác sử dụng phân tích mtADN để nghiên cứu theo dõi hoạt động ty thể lai tế bào chất Số phận lục lạp ty thể ngoại lai thể lai tế bào chất vấn đề nhà nghiên cứu quan tâm hàng đầu việc biến đổi di truyền tế bào chất có ý nghĩa thông tin di truyền lục lạp ty thể ngoại lai tồn hoạt động bình thường thể lai Những kết Kung (Kung & cs, 1975, 1977) Chen (Chen & cs, 1977) cho thấy lai N Glauca N Langsdorffii phần lớn chứa loại lục lạp (hoặc bố, mẹ) Trong cơng trình Belliard, tác giả xác định loại cpADN lai tế bào chất (Belliard & cs, 1978) Thành cs chứng minh thuốc nhận từ dung hợp protoplast hai loại khác tông Salpiglossis sinuata (cây cho lục lạp) N Tabacum (cây nhận lục lạp) chứa loại lục lạp S Sinuata (Thanh & cs, 1988) Trong vài trường hợp tác giả lại xác định hai loại lục lạp Một số tác giả khác thu kết tương tự (Aviv & cs, 1980, 1984; Glimelius, 1981; Bonnet & Glimelius, 1983) Mặc dù số cơng trình tác giả chứng minh tồn hai loại cpADN lai chưa thấy tượng tái tổ hợp cpADN Vấn đề tái tổ hợp cpADN thực vật bậc cao nhiều phịng thí nghiệm giới nghiên cứu, xong đến cuối năm 80 có hai công bố tái tổ hợp cpADN lai tế bào chất thuốc (Medgyesy & cs, 1985) lai tế bào chất thuốc khoai tây (Thanh & cs, 1989) Tái tổ hợp ADN lục lạp vấn đề có ý nghĩa, thơng qua tái tổ hợp cpADN tạo tổ hợp gen tế bào chất Đối với ty thể tồn cơng trình công bố cho thấy lai tế bào chất xảy tái tổ hợp mtADN (Belliard & cs, 1978; Nagy & cs, 1981, 1983; Clark & cs, 1986; Kemble, 1986; Robertson & cs, 1987) Kết tái tổ hợp tạo kiểu hình hoa mới, kiểu hình ổn định (Belliard & Pelletier, 1979) Tái tổ hợp mtADN xảy sau dung hợp protoplast hai giống thuốc có mtADN tương tự nhau, nhiên tái tổ hợp xảy nhiều dung hợp hai lồi thuốc khác N tabacum N Plumbaginifolia (Nagy & cs, 1981, 1983) - 17 - Cho đến nay, việc nhận lai tế bào chất kỹ thuật dung hợp protoplast thực chủ yếu lồi thuốc lá, cải bước đầu thành công khoai tây Tuy thành tựu đạt mang lại ứng dụng thực tiễn việc cải biến trồng Chuyển lục lạp giúp cho việc khơi phục suất cải dầu – Brasica napus (Bennerot & cs, 1974; Pelletier & cs, 1983) tạo giống trồng kháng chất diệt cỏ (Benversdof & cs, 1980; Binding & cs, 1982; Gressel & cs, 1984; Pelletier & cs, 1985) Lai tế bào chất dung hợp protoplast rút ngắn thời gian tạo dịng bất dục đực 4-5 năm Chuyển tính BDĐ thành công thuốc (Zelcer & cs, 1978; Aviv &Galun, 1980; Aviv & cs, 1980; Glimelius & cs, 1981; Uchimiya, 1982; Menczel & cs, 1983; Fluhr & cs, 1984) dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980; Izhar & cs, 1983, 1984; Boeshore & cs, 1983; Clark cs, 1985; Rothenbenrg & cs, 1985) Đặc biệt chuyển tính BDĐ để tạo hạt lai cải dầu mang lại lợi ích kinh tế (Pelletier & cs, 1985; Chetrit & cs, 1985) Phần 5: CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT: I Một số vấn đề chung chuyển gen thực vật Chuyển gen thực vật phát triển với phát triển kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật Nó trở thành phương tiện quan trọng để nghiên cứu sinh học thực vật Nó cho phép nghiên cứu cấu trúc điều khiển hoạt động gen Ngồi mở triển vọng chuyển gen có ý nghĩa kinh tế vào trồng Từ khám phá chuyển gen thực nhờ Agrobacterium tumefaciens (Klee & Rogers, 1989) nhà khoa học tin Arobacterium chuyển gen vào tất lồi Nhưng sau kết thực tế cho thấy chuyển gen Agrobacterium thực ngũ cốc hàng loạt kỹ thuật chuyển gen phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1989), kỹ thuật bắn gen (Klein & cs, 1989), kỹ thuật vi tiêm (Neuhaus & cs, 1987), kỹ thuật chuyển gen qua hạt phấn (Hess & cs, 1977 ; Ohta, 1986), kỹ thuật đường dẫn ống phấn (Luo & cs, Wu, 1988), kỹ thuật ủ hạt mô với ADN (Ledoux & cs, 1974), kỹ thuật nhiễm vi khuẩn (Grimsley & cs, 1986), sử dụng ADN virus (Gronenborn & Matzeit,1989), Kỹ thuật điện di (Linsay & Jones, 1990), dung hợp liposom (Ahokas, 1987), phương pháp vĩ tiêm (De la Pena & cs, 1987), phương pháp xử lý laser (Weber & cs, 1988) Đến nhờ cải tiến vectơ chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa (Hiei cs, 1994) Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Chuyển gen thực qua bước sau : -Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm - Phân lập gen -Gắn gen vào vectơ biến nạp -Biến nạp vào E Coli -Tách ADN plasmid - 18 - -Biến nạp vào mô tế bào thực vật -Chọn thể biến nạp -Tái sinh biến nạp -Chứng minh có mặt gen biến nạp tái sinh Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học hệ thống chuyển gen : -Khơng phải tồn tế bào thể tính tồn -Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genôm -Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả tái sinh biến nạp; số khác có hai khả năng; số tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng; số khác hồn tồn khơng có khả tái sinh biến nạp -Thành phần quần thể tế bào xác định lồi, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan -Cho đến gen chuyển vào tế bào có thành xellulơ Agrobacterium, virus, vi tiêm, bắn gen chuyển gen trực tiếp Khả xâm nhập gen vào genôm cách ổn định không tỷ lệ với thể tạm thời gen Các ADN khơng phải virus có genôm chưa bảo đảm gắn ổn định với genôm -Các ADN virus không chuyển rời từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào -ADN virus không xâm nhập vào genôm chủ, chuyển từ tế bào sang tế bào khác bị loại mô phân sinh II Các phương pháp chuyển gen Chuyển gen Agrobacterium Chuyển gen Agrobacterium phương pháp hữu hiệu dùng để chuyển gen thực vật Phương pháp dùng Ti plasmid A tumefaciens Ri plasmid A rhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào Ti plasmid gồm hai thành phần T-ADN vùng vir (virulence) T-ADN chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, nhờ mà gắn gen muốn chuyển nạp vào T-ADN để đưa vào tế bào T-ADN chức gen điều hồ sinh trưởng cục gen tổng hợp chất opine Đoạn cuối có 25 cặp bazơ lặp lại, đoạn vùng xâm nhập vào phân tử ADN thực vật Vùng vir gồm sáu nhóm từ virA đến virG virC virE có tác dụng tăng tần số biến nạp - 19 - Để thiết kế vectơ dùng cho biến nạp, trước hết cắt bỏ gen điều hồ sinh trưởng cục sau gắn thêm gen thị (kháng thuốc chất diệt cỏ) với đoạn điều khiển (promote) phù hợp để chọn thể biến nạp cuối gắn gen cần biến nạp Chuyển gen Agrobacterium thực có hiệu nhiều loại hai mầm như: thuốc lá, cà chua, khoai tây (Cheng cs, 1992), đậu tương (Hinchee & cs, 1988; Dhir & cs, 1992), (Perlak & cs, 1990), Arobidopsis, ngô (Gould & cs, 1991; Citovsky & cs, 1994) Những thành công lúa (Hiei & cs, 1994; Rashid & cs, 1996) làm cho phương pháp chuyển gen Agrobacterium trở nên hấp dẫn củng cố vị trí nhà tiền bối hy vọng từ đầu Cho đến chuyển gen thông qua Agrobacterium phương pháp cho tần số biến nạp cao xác định xâm nhập ổn định phương pháp chuyển gen (Chan & cs, 1993; Hiei & cs, 1994) Phương pháp nhiễm Agrobacterium virus Phương pháp nhiễm Agrobacterium virus phương pháp gắn ADN virus vào T-ADN Ti plasmid chuyển vào tế bào thực vật Khi vào tế bào ADN virus giải phóng để tạo virus hoạt động xâm nhập vào genôm tế bào gần vùng u Agrobacterium gây nên Bằng phương pháp Grimsley cs (1987) lần cho thấy khả chuyển gen ngũ cốc Agrobacterium Phương pháp chuyển gen trực tiếp Phương pháp chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1988) phương pháp chuyển ADN thông qua xử lý polyethylen glycol (PEG) Đây phương pháp chuyển gen cho hiệu cao.Bằng phương pháp nhận mang gen biến nạp ổn định di truyền qua hệ (Potrykus & cs, 1985) Phương pháp có ưu điểm như: tần số chuyển nạp đồng thời gen thị gen cần biến nạp cao; chuyển gen vào protoplast lồi Tuy nhiên vấn đề tái sinh từ protoplast cịn khó khăn số lồi Mặc dù có nhiều thành tựu ni cấy protoplast protoplast giống có giá trị kinh tế lúa, ngơ, l mì, đại mạch phần lớn việc tách nuôi tế bào phụ thuộc vào việc thiết lập hệ thống nuôi cấy phôi để làm nguyên liệu ban đầu mà điều dễ thực giống sản xuất Phương pháp bắn gen Phương pháp bắn gen phương pháp sử dụng hạt kim loại nặng bao bọc ADN bắn vào tế bào Bằng phương pháp biến nạp tất loại tế bào Người ta hy vọng phương pháp giải tất vấn đề chuyển gen, tần số biến nạp phương pháp bắn gen thấp thường xuyên nhận biến nạp khảm (cây có tế bàobiến nạp tế bào khơng biến nạp) Có thể nói đến số ưu điểm phương pháp bắn gen : -Thao tác dễ dàng -Bắn lần nhiều tế bào -Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nbuôi cấy, tế bào mô biệt hố mô phân sinh) - 20 - Cây đậu tương biến nạp nhận phương pháp (McCabe & cs, 1988) Nhiều phòng thí nghiệm nhận ngơ biến nạp thời gian (Fromm & cs, 1990; Gordom- Kamm & cs, 1990) Một vấn đề tồn quan trọng tần số biến nạp ổn định thấp theo Potrykus (1991) ưu điểm thực phương pháp bắn gen ứng dụng nghiên cứu thể tạm thời gen Nhưng năm gần có hàng loạt cơng bố biến nạp thành công lúa (Zhang & cs, 1996), đu đủ, mía, bơng khẳng định ưu việt phương pháp Phương pháp vi tiêm Phương pháp vi tiêm (microinjection) vào hợp tử phôi từ hạt phấn Phương pháp vi tiêm phương pháp sử dụng vi kim kính hiển vi đưa ADN vào tế bào định (Neuhaus & Spangenberg, 1990) Phương pháp tạo dòng biến nạp từ protoplast biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn cải dầu Giống phương pháp bắn gen, vi tiêm đưa ADN vào tế bào xác định có thành xellulơ Vi tiêm hạn chế bắn gen chổ phát tiêm tế bào thao tác cần khéo léo Vi tiêm có số ưu điểm sau : -Có thể tối ưu lượng ADN đưa vào tế bào -Có thể định đưa ADN vào loại tế bào -Có thể đưa cách xác chí vào tận nhân quan sát đuợc -Các tế bào có cấu trúc nhỏ hạt phấn tế bào tiền phôi hạn chế số lượng tiêm cách xác -Có thể thực nuôi cấy riêng rẽ tế bào vi tiêm -Có thể biến nạp giống Cho đến phương pháp kể nhận đuợc biến nạp Ngồi số phương pháp khác thực chưa có kết kết chưa khẳng định, phương pháp sau : -Phương pháp ủ hạt khô phôi dung dịch ADN -Phương pháp biến nạp thông qua hạt phấn Phương pháp dựa vào sở ADN xâm nhập vào hạt phấn giai đoạn nảy mầm di chuyển vào nhân tế bào hạt phấn hợp tử qua ống phấn (Hess, 1987) -Phương pháp đường dẫn ống phấn (Luo & Wu, 1988) Phương pháp tương tự phương pháp biến nạp thông qua hạt phấn đưa ADN vào hợp tử ống phấn -Phương pháp vĩ tiêm (macroinjection) Phương pháp sử dụng kim tiêm có đường kính lớn đường kính tế bào để đưa ADN vào tế bào, tế bào bị phá vỡ ADN xâm nhập vào tế bào bị thương sau chuyển vào tế bào bên cạnh (De la Pena & cs, 1987) -Phương pháp xung điện (electropoation) phương pháp này, dùng tuợng phóng điện để tạo lỗ màng tế bào làm cho việc đưa ADN vào tế bào dễ dàng hơn, - 21 - ADN tiếp giáp với màng tế bào Đối với protoplast, phương pháp xung điện có số kết khích lệ (Fromm & cs, 1987), chưa có chứng minh chắn cho biến nạp Hơn việc nuôi cấy protoplast số lồi gặp nhiều khó khăn -Ahokas (1989) sử dụng điện di để vận chuyển ADN vào mô phân sinh chồi từ hạt đại mạch để xem phương pháp điện di ADN qua mơ vận chuyển gen vào tế bào hay không Kết tác giả nhận thể tạm thời gen thị (GUS) không chứng minh biến nạp ổn định -Liposom có chứa ADN sử dụng phương tiện để đưa gen ngoại lai vào tế bào thông qua dung hợp (Caboche, 1990) vi tiêm vào không bào (Lucas, 1990) Cả hai phương pháp chưa thu đựợc kết -Phương pháp vi laser ứng dụng để tạo lỗ hổng màng tế bào sau ủ tế bào với dung dịch ADN Weber cs (1990) sử dụng phương pháp chuyển gen không cần vectơ, sau thời gian dài chưa có kết chắn xâm nhập ADN vào tế bào (1995) Guo cs kết hợp việc xử lý tế bào với dung dịch đẳng trương để rút bớt nước từ tế bào sau chuyển vào mơi trường thẩm thấu yếu có chứa ADN ngoại lai dùng laser tạo lỗ màng tế bào để ADN xâm nhập vào tế bào Bằng phương pháp tác giả quan sát thấy thể gen biến nạp sau xử lý tế bào tái sinh Phần 6: SỰ PHÁT TRIỂN VÀ THÀNH TỰU CỦA NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Ở VIỆT NAM Nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển Việt Nam sau chiến tranh kết thúc (1975) Phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào xây dựng viện Sinh học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Bước đầu phòng tập trung vào nghiên cứu phương pháp nuôi cấy điều kiện Việt Nam nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo protoplast Các kết nuôi cấy thành công bao phấn lúa thuốc công bố vào 1978 (Lê Thị Muội cs, 1978; Lê Thị Xuân cs, 1978) Tiếp thành cơng ni cấy protoplast thuốc khoai tây (Lê Thị Muội Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành Lê Thị Muội, 1980, 1981) Trong thời gian, phân viện KHVN thành phố Hồ Chí Minh muộn Đại học Nông nghiệp (ĐHNN1), Hà Nội viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (KHKTNNVN) phịng thí nghiệm cấy mơ khơng viện nghiên cứu (viện Di truyền nông nghiệp /DTNN; viện Rau trung ương /RQTƯ) mà số tỉnh sở sản xuất (Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Nghệ Tĩnh, Cần Thơ, ) Từ năm 80 trở lại đây, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh Những kết khích lệ đạt lĩnh vục nhân giống khoai tây (Viện công nghệ sinh học/CNSH, ĐHNN1, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (viện CNSH, ĐHNN1, viện DTNN, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ), số hoa Phong lan (phân viện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm chướng ( Viện CNSH, viện Lâm nghiệp ) Một số kết bước đầu ghi nhận lĩnh vực chọn dòng tế bào chọn dòng tế bào kháng thuốc (Lê Bích Thủy vả cs, 1994), chọn dịng chịu muối, chịu nước (Nguyễn Tường Vân cs, 1994; Đinh Thị Phòng cs, 1994) Các kết dung hợp tạo lai tế bào chất chuyển gen lục lạp thu kết lý thú (Nguyễn Đức Thành cs, 1988; Nguyễn Đức Thành cs, 1993, 1997) Nuôi cấy bao phấn - 22 - để tạo dòng ứng dụng nhiều viện CNSH DTNN Nuôi cấy dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen tạo dòng tế bào có hàm lượng chất sinh học quan trọng cao phát triển (Phan Huy Bảo Lê Thị Xuân, 1988; Phan Thị Bảy cs, 1995) KẾT LUẬN Tóm lại, cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật có ưu điểm : -Tạo hàng loạt cá thể phù hợp, giữ nguyên tính trạng mẹ -Rút ngắn rõ rệt thời gian chọn giống -Tái sinh, phục chế giống quí bị nhiễm bệnh virut, bị thối hóa Tạo giống bệnh, có phẩm chất tốt mong muốn -Giá thành giống rẻ nhờ giảm mặt sản xuất : 10 m2 kho cho ống nghiệm phịng thí nghiệm tương 10 ngồi đồng ( Heller cs, 1995) -Tạo nhanh chóng hệ đồng hợp tử cần cho phân tích di truyền ứng dụng thực tiễn Ngày với tiến kĩ thuật nuôi cấy mơ người ta sản xuất giống phịng thí nghiệm để đưa sản xuất nhanh chóng nhiều lần phương pháp cổ điển Nhờ kết mà người sản xuất 130.000 hồng năm cần có hồng gốc, so với phương pháp cũ giâm cành người sản xuất tối đa 50 mà Như vậy, với công nghệ suất người công nhân nông nghiệp tăng lên 2.500 lần- khơng có lĩnh vực kĩ nghệ sánh Kĩ thuật sản xuất giống phịng thí nghiệm cịn biện pháp hữu hiệu để xây dựng chương trình chọn lọc tối ưu Kĩ thuật ni cấy mơ cịn cho phép với qui trình dài có sản phẩm có tính di truyền hồn hảo sử dụng « bố mẹ lai » dùng để tạo dòng - 23 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Đái Duy Ban Lữ Thị Cẩm Vân, 1994: Công nghệ gen Công nghệ sinh học ứng dụng y dược học đại, NXB Y học Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học Kỹ thuật Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Lê Đình Lương, 2001: Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Thành, 2000: Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng: Thế kỷ 21- kỷ vàng công nghệ sinh học, Khoa học phổ thông, Xuân 1997 Nguyễn Như Khanh, 2006: Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục Trần Thế Thông: Công nghệ sinh học với nông nghiệp, Khoa học phổ thông, Xuân 1997 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2006: Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục 10 Công nghệ sinh nghesinhhoc/chuong15 học : http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/cong 11 Tạp chí sinh học, tập 28- số 4, tháng 12/2006 - 24 - - 25 - ... khoa học CDTBTV tế bào thực vật mang tính tồn Mỗi lồi thực vật có khả tái sinh khác Cơ sở thứ hai mô quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm số lượng lớn tế bào khơng đồng Vì quần thể tế bào ni cấy xem... ni cấy tế bào qui mô lớn đặc biệt việc sử dụng công nghệ nuôi tế bào thực vật qui mô công nghiệp Protoplast (tế bào trần) thực vật nguyên liệu đáp ứng nhiều mặt CDTBTV Protoplast hệ thống tế bào. .. đưa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mơ cơng nghiệp Những thành tích đạt lĩnh vực đặc biệt việc công nghiệp hố sản xuất Shikonin tế bào nuôi cấy tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật ni cấy