Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  NGUYỄN THỊ MINH THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những nội dung trình bày trong luận văn này là do tôi tìm hiểu, nghiên cứu dƣới sự hƣớng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và sự cộng tác, giúp đỡ của các cộng sự trong nhóm nghiên cứu. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án đã đƣợc sự đồng ý của cán bộ hƣớng dẫn và nhóm nghiên cứu, các tài liệu trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Thị Minh Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này. Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thị Mai Thu, cảm ơn nghiên cứu viên Phạm Thanh Tùng và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành các thí nghiệm trong luận văn. Tôi xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên; Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh và các Thầy, Cô khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tác giả Nguyễn Thị Minh Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. BỆNH HẠI CÂY ĐẬU TƢƠNG 3 1.1.1. Cây đậu tƣơng, đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng 3 1.1.2. Phân loại bệnh hại ở cây đậu tƣơng 4 1.1.3. Bệnh khảm lá do virus SMV và BYMV trên cây đậu tƣơng 11 1.2. HỆ GEN CỦA SMV VÀ BYMV 13 1.2.1. Đặc điểm của hệ gen ở SMV và BYMV 13 1.2.2. Gen CP của SMV và BYMV 15 1.3. KỸ THUẬT RNAi VÀ ỨNG DỤNG TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS 16 1.3.1. Các RNA ức chế nhỏ (siRNA và miRNA) 17 1.3.2. Cơ chế can thiệp RNAi 21 1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus 23 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1. Vật liệu 25 2.1.2. Hoá chất 26 2.1.3. Máy móc, thiết bị 26 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu 26 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1. PCR khuếch đại vùng CPi (SMV, BYMV) 27 2.2.2. Phƣơng pháp tách dòng gen 28 2.2.3. Phản ứng lai ghép gen CPi với vector pENTR TM /D-TOPO ® 33 2.2.4. Phƣơng pháp tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi bằng kỹ thuật Gateway 34 2.2.5. Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens mang vector chuyển gen 36 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV . 38 3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi CỦA SMV VÀ BYMV 39 3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pENTR TM /D-TOPO ® 39 3.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi(SMV-BYMV)] bằng kỹ thuật Gateway 42 3.3. KẾT QUẢ TẠO VI KHUẨN A.TUMEFACIENS MANG VECTOR CẤU TRÚC RNAi CHỨA VÙNG GEN CPi [pGW –CPi(SMV-BYMV)] . 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Cặp base BYMV Bean yellow mosaic virus (Virus khảm vàng đậu tƣơng) CS Cộng sự CP Coat protein (protein vỏ) cDNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid E.coli Escherichia coli IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside IhpRNA Intron hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc mang intron) Kb Kilo base kDa KiloDalton LB Luria Bertani miRNA Micro - RNA OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RISC RNA – inducing silencing complex RNA Ribonucleic Acid RNAi RNA interference siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus (Virus khảm lá ở đậu tƣơng) TAE Tris acetat EDTA X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-D-galactosidase WB Washing buffer (dung dịch rửa) Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT 30 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pENTR TM /D-TOPO ® 33 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng LR 35 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh lá và quả đậu tƣơng bị bệnh khảm lá đậu tƣơng (Soybean mosaic virus-SMV) 13 Hình 1.2 Sơ đồ các gen trong hệ gen của SMV 14 Hình 1.3 Sự tạo thành miRNA từ gen trong nhân tế bào 20 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng trong nghiên cứu 25 Hình 2.2 Sơ đồ mô tả các bƣớc thiết kế vector mang cấu trúc RNAi bằng kỹ thuật Gateway(Karimi et al., 2002) 27 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vùng CPi của SMV và BYMV 38 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR kiểm tra dòng tế bào E.coli mang vùng gen CPi với cặp mồi SMV-CPi- F/BYMV-CPi-R 39 Hình 3.3 Sơ đồ mô tả phản ứng lai ghép đoạn gen CPi vào vector pENTR TM /D-TOPO ® tạo vector tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) 41 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc với cặp mồi M13-F/M13-R 42 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid pEN-CPi (SMV- BYMV) 43 Hình 3.6 Sơ đồ mô tả phản ứng LR tạo vector pGW –CPi(SMV- BYMV 45 Hình 3.7 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 47 Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc A. tumefaciens 50 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao. Cây đậu tƣơng là có nốt sần ở rễ có khả năng cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tƣơng không những mang lại hiệu quả kinh tế mà còn góp phần cải tạo đất trồng trọt. Hiện nay, năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng ở mức thấp là do nhiều nguyên nhân, trong đó có các bệnh do côn trùng, vi khuẩn và virus gây ra. Hiện nay ngƣời ta đã xác định đƣợc khoảng 20 loài bệnh hại ở cây đậu tƣơng, trong đó có các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn cho ngành sản xuất đậu tƣơng. Virus gây bệnh bệnh khảm lá Soybean mosaic virus (SMV) và bệnh khảm vàng lá Bean yellow mosaic virus (BYMV) đƣợc lan truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp muội ở ngoài đồng là chủ yếu. Khi bị bệnh lá đậu tƣơng có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn khảm mạnh và biến dạng, đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại, phát triển chậm, quả ít và biến dạng, thƣờng lép. Hiện nay mới dừng ở biện pháp phòng mà chƣa có thuốc trị hai loại virus SMV và BYMV. Các biện pháp phòng bệnh theo truyền thống thƣờng phức tạp, tốn thời gian, hiệu quả không cao và kém bền vững. Phƣơng pháp công nghệ sinh học hiện đại tạo cây chuyển gen kháng virus tỏ ra có hiệu quả cho các loài thực vật mà trong tự nhiên không có nguồn kháng bệnh hoặc nếu có sẵn. Ứng dụng kỹ thuật RNAi có thể tạo cây chuyển gen kháng lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật bằng cách chuyển các gen có nguồn gốc từ chính virus gây bệnh dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã - RNA interference (RNAi). Xuất phát từ lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn thạc sĩ là: “Thiết kế Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen mã hóa protein vỏ nhằm phục vụ chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm lá ở cây đậu tương". 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi phục vụ chuyển gen kháng bệnh khảm lá do virus SMV và BYMV ở cây đậu tƣơng. - Tạo đƣợc chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi chứa vùng CPi (SMV+BYMV) 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Thu thập thông tin về gen CP của hai loài virus SMV và BYMV gây bệnh khảm lá trên cây đậu tƣơng; 3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi(SMV-BYMV) bằng kỹ thuật Gateway. 3.3. Biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi(SMV-BYMV) vào vi khuẩn A. tumefaciens. Kiểm tra kết quả biến nạp bằng colony-PCR. [...]... gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen 1.3.1 Các RNA ức chế nhỏ (siRNA và miRNA) siRNA đƣợc tạo thành do sự phân cắt các dsRNA bởi Dicer,... cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tƣơng đã nhận thấy rằng, cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau 2 tuần triệu chứng nhiễm bệnh khảm lá do SMV biến mất và lƣợng SMV đã giảm đáng kể, tuy nhiên HC-Pro của SMV đã gây biến đổi hình thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây đậu tƣơng chuyển gen Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và đtg đã công bố kết quả tạo ra đƣợc một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc. .. từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp ở ngoài đồng vẫn là chủ yếu Soybean mosaic virus (SMV) thuộc Chi Potyvirus, Họ Potyviridae, là một trong những loại virus gây bệnh quan trọng nhất ở cây đậu tƣơng (Glycine max [L.] Merr) và bệnh khảm lá đậu tƣơng do SMV gây ra gặp ở hầu hết các quốc gia trên thế giới SMV có thể gây ra thiệt hại đáng kể về sản lƣợng, làm suy giảm năng suất đậu tƣơng tới 40% khi các cây. .. rộng, gây hại trên các cây trồng thuộc họ đậu nhƣ đậu xanh, đậu đen, lạc, đậu trạch,… làm giảm chất lƣợng hạt, hạt bị nhiễm bệnh hàm lƣợng các amino acid giảm Cây có thể nhiễm bệnh từ giai đoạn cây con đến khi thu hoạch Nấm gây hại ở các bộ phận của cây nhƣ lá, thân, cành, quả và hạt Giai đoạn cây con vết bệnh là các vết đốm màu nâu ƣớt, hơi lõm trên lá mầm và phát triển xuống thân, lá mầm bị bệnh thƣờng... dựng thƣ viện RNAi của tất cả các bệnh virus trên một đối tƣợng cây trồng cụ thể sẽ góp phần phục vụ cho việc sàng lọc các biểu hiện bệnh virus [28] Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (CP, Rep ) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc chứng minh bằng thực tế Nhiều giống cây trồng kháng virus đã tạo ra bằng kỹ thuật này đó là kháng PVY (Waterhouse... hại ở tất cả các thời vụ trồng đậu tƣơng, mức độ nhiễm bệnh ở mỗi thời vụ có khác nhau Vụ đậu tƣơng xuân và hè thu, bệnh thƣờng phát sinh gây hại nặng Còn ở vụ đậu tƣơng đông thì bệnh thƣờng phát sinh gây hại nhẹ hơn Hầu hết các giống đậu tƣơng đang gieo trồng ngoài sản xuất đều có thể nhiễm bệnh, bệnh có xu thế phát sinh gây hại nặng trên những giống đậu tƣơng nhập nội, lai tạo, có năng suất cao Số hóa. .. các cây thƣờng năm nhƣ virus gây bệnh lúa vàng lụi, bệnh vàng lá lúa, bệnh xoăn lá cà chua, bệnh virus khoai tây, bệnh khảm sọc lá hành tây Bệnh virus hại lúa, virus hại sắn đã từng huỷ diệt hàng chục vạn ha ở châu Á và châu Phi trong một thời gian ngắn chƣa tới 30 ngày từ một cánh đồng xanh tƣơi trở thành vàng úa, chết lụi Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hƣởng của bệnh tới phẩm chất của... Bệnh phát triển mạnh ở những vùng trồng đậu tƣơng có mƣa nhiều, bón phân không hợp lý Giống đậu tƣơng nhiễm bệnh cao là các giống AK 03, DT 84 Các giống đậu tƣơng DT 22, DT 90, DT 93 nhiễm bệnh ở mức thấp hơn Bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương Bệnh đốm gỉ: Trên lá, triệu chứng bệnh xuất hiện ở dạng đốm nhỏ nổi trên mặt lá nhƣ các mụn loét nên trông rất dễ nhầm lẫn với bệnh gỉ sắt đậu tƣơng do nấm gây. .. quyết định đến triệu chứng bệnh khảm lá ở cây đậu tƣơng, từ đó có các biện pháp hiệu quả để phòng trừ SMV cho đậu tƣơng 1.2.2 Gen CP của SMV và BYMV Cấu trúc gen CP Hệ gen của BYMV có kích thƣớc 9530 nucleotide, còn kích thƣớc của hệ gen ở SMV là 9588 nucleotide Gen CP của SMV có khoảng 798 nucleotide, mã hóa cho 265 amino acid; còn gen CP của BYMV có 830 nucleotide, mã hóa 276 aminoacid Một đặc điểm... rụng sớm Bệnh nặng thƣờng gây chết cây con Vết bệnh trên lá thƣờng biểu hiện các vết chết hoại có màu nâu đỏ trên gân lá, gây thối gân Bệnh có thể gây hại trên phiến lá là các vết bệnh hình bầu dục, màu nâu, hơi lõm, xung quanh có viền nâu đỏ, trên bề mặt vết bệnh có các chấm đen nhỏ là các đĩa cành của nấm gây bệnh Lá bị bệnh thƣờng quăn lại dễ bị rụng Trên thân cành, cuống lá và vỏ quả vết bệnh có . là: Thiết kế Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen mã hóa protein vỏ nhằm phục vụ chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm lá ở cây. lá ở cây đậu tương& quot;. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CPi phục vụ chuyển gen kháng bệnh khảm lá do virus SMV và BYMV ở cây đậu tƣơng MANG CẤU TRÚC RNAi CHỨA ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ NHẰM PHỤC VỤ CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH KHẢM LÁ Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC