Đang tải... (xem toàn văn)
II.NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Khái niệm Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy đầu tiên của tế bào saukhi tách từ mô hay cơ quan trước lần cấy truyền đầu tiên. Đặc điểm nuôi cấy sơ cấp Thành phần tế bào trong giai đoạn này rất hỗn độn. Kết thúc nuôi cấy sơ cấp khi tế bào được cấy truyền sang một dụng cụ khác. Các tế bào không mong muốn trong nuôi cây sơ cấp gọi là tế bào nhiễm. Các tế bào nhiễm được loại bỏ bằng cơ học hoặc enzyme hoặc môi trường chọn lọc Thu nhận sử lý mẫu: B1 xác định vị trí mô B2 khử trùng,đưa vào bảo quản trong dung dịch đệm B3 đưa đến phòng thí nghiệm chuyển sang dd đệm mới + kháng sinh. Tách rời các tế bào: Tách bằng cơ học: dùng dao, kéo cắt rời các mảnh mô mục đích làm tế bào tách ra thành tế bào đơn lẻ Hiệu quả của tách cơ học Thu được ít tế bào đơn Không áp dụng được với mẫu hiếm Sức sống tế bào cao Tăng hiệu quả tiếp xúc enzyme. Áp dụng cho mẫu lớn không khan hiếm. Tách bằng enzyme: Sử dụng enzyme: phá vỡ các liên kết giữa các tế bào trong khối mô. Hiệu quả khi tách băng enzyme. Thu được nhiều tế bào đơn Áp dụng được với hầu hết các mô Hiệu quả không mong muốn Sức sống tế bào giảm Nếu không bất hoạt enzyme sẽ ảnh hưởng tới thí nghiệm sau. Các enzyme thường dùng Pronase Dispace Trypsin collagenase hyaluronidase Nuôi cấy thu tế bào: Quá trình cơ bản của nuôi cấy Loại bỏ dịch nổi trong dịch tách tế bào bằng ly tâm 10000v Dùng khoảng 1ml môi trường cho vào ống eppendorf để tạo huyền phù Huyền phù được đưa vào bình nuôi cấy ,lắc đều. Binh nuôi cấy được ủ trong điều kiện thich hợp,thường là nhiệt độ 3737,5. Môi trừơng nuôi sẽ được thay đổi liên tục khoảng 2448h .do tế bào sinh trưởng tạo CO2 Tế bào phát triển thành lớp đơn trong bình.
!"# $%&'%() *+,-%(. /"0"1 2%3% 4 %( 5*%(. BÀI TIỂU LUẬN BÀI TIỂU LUẬN 678*9:%;<=>?*@,AB!8 • 1CD(EF1 G • HIJ • 3J =1CD (E)F1G =1CD (E)F1G 1.Điều kiện hóa, lý 1.Điều kiện hóa, lý 2.Mức độ vô trùng 2.Mức độ vô trùng 3.Bề mặt nuôi cấy 3.Bề mặt nuôi cấy 4.Người thao tác 4.Người thao tác 5.Thiết bị nuôi cấy 5.Thiết bị nuôi cấy 6.Dụng cụ nuôi cấy 6.Dụng cụ nuôi cấy (I$ KL #MNO L PQNL-R1+MSTJ1GUC &!VNWM2 X YGZ$2 X YT5 X $J% PG(.F1#R[#\UD(E)H]J1GU^# 1NK1#J%K1#M(.J%G KD5$ /_K- `JHa bGG(.1JHaK-cJHdeS 1JHa#IHdN()NSM(cNSHdNJ f _B$D(E)F1G HG(EM'HL#^#GK_B$NS gD(EGhGL)J%^#F1G (I$ $P3GZ &HNCiJ1Sj& F1G jGZG#1 +MekkMG(.jJD(cKlGZmTF+ &!#n_5X X Mo#NemempMK1HMIMq#;&MNr $P3GZ &HNCiJ1Sj& F1G jGZG#1 +MekkMG(.jJD(cKlGZmTF+ &!#n_5X X Mo#NemempMK1HMIMq#;&MNr ,[ *^qJN#HqN#NL^UN1U1eS1e- stL#NJNHGmm)(U1JMGHC1[U[ ,[U(cJ^N)J1JGmG#u(cJ^N)J1G#GGmGTJ1e- C ,[ *^qJN#HqN#NL^UN1U1eS1e- stL#NJNHGmm)(U1JMGHC1[U[ ,[U(cJ^N)J1JGmG#u(cJ^N)J1G#GGmGTJ1e- C 4.Thiết bị nuôi cấy Để nuôi cấy tbdv phòng thí nghiệm cần phải được trang bị: 1+ • *+DFDvw#: tủ lạnh, tủ lạnh sâu,bình nitrogen lỏng, máy làm đá • *+ tủ cấy, tủ ấm • *+HCN(cmáy đếm hồng cầu, đếm khuẩn lạc => kiểm tra mật độ tế bào ở thời điểm nhất định • *+KlGZqHS nồi khử trùng, tủ sấy, máy rửa dụng cụ, đèn Jệt trùng, hệ thống lọc…. • *+F#H1thường là các kính hiển vi có gắn camera, kết nối với màn hình lớn,gắn với máy ảnh *+QGcK1 &-ek: máy pha hóa chất, máy votex,máy li tâm, máy khuấy từ, máy đo pH… 2!kk • Pipet( các loại) • Các hộp • Các đĩa nuôi( 30mm, 60mm, 100mm) • Bình Roux • Đĩa nhiều giếng • Spinner • Mũi kim => dụng cụ được lựa chọn phù hợp với nuôi cấy phẳng hay 3D % D Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fi]h level [...]... khác nhau + Nhân dòng các tế bào trên agar hoặc dung dịch có độ nhớt cao như methocell ( sử dụng vs tế bào bám dính) VD: với tế bào Hela – S3,CHO + Nuôi cấy tế bào ở dạng dung dịch (sử dụng với tế bào không bám dính) VD: tế bào máu Phương pháp pha loãng Pha loãng là giai đoạn cuối của quá trình nuôi cấy thứ cấp Phương pháp pha loãng: Đối với tế bào CHO: Tế bào CHO - Tế bào đơn Nuôi cấy trong bình... CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Khái niệm Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy đầu tiên của tế bào saukhi tách từ mô hay cơ quan trước lần cấy truyền đầu tiên Đặc điểm nuôi cấy sơ cấp Thành phần tế bào trong giai đoạn này rất hỗn độn Kết thúc nuôi cấy sơ cấp khi tế bào được cấy truyền sang một dụng cụ khác Các tế bào không mong muốn trong nuôi cây sơ cấp gọi là tế bào nhiễm Các tế bào nhiễm được... 100.000 tế bào/ 1ml lấy 200 microlit của dung dịch 100.000 tế bào/ ml thêm môi trường đạt 20ml ( pha loãng 100 lần) thu được dung dịch nòng độ 1000 tế bào/ ml Lấy 200microlit dung dịch này pha loãng 100 lần thu đượcnồng độ 10 tế bào/ 1ml dịch pha loãng nuôi cấy trong đĩa peptri ( 3 đĩa mỗi đĩa 5ml) điều kiện 5%CO2 lấy 5ml dung • - Môi trường cho pha loãng Tế bào CHO môi trường Ham’s F12 Tế bào TẾ BÀO GỐC... 1.Thu nhận mẫu 3.Nuôi cấy tế bào 2.Tách rời tế bào Thu nhận sử lý mẫu: B1 xác định vị trí mô B2 khử trùng,đưa vào bảo quản trong dung dịch đệm B3 đưa đến phòng thí nghiệm chuyển sang dd đệm mới + kháng sinh Tách rời các tế bào: Tách bằng cơ học: • dùng dao, kéo cắt rời các mảnh mô mục đích làm tế bào tách ra thành tế bào đơn lẻ •Hiệu quả của tách cơ học Thu được ít tế bào đơn Không áp dụng... vỡ màng tế bào nên sẽ được bất hoạt bằng huyết thanh b) Nhân dòng: - Khái niệm: Nhân dòng là quá trình chọn ra 1 loại tế bào duy nhất từ một đĩa nuôi cấy chứa nhiều loại tế bào - Quá trình nhân dòng có hiệu quả cao, thấp khác nhau đối với các dòng tế bào khác nhau, có 2 nhóm: + Dòng tế bào liên tục: (continuous cell line, established cell line): có khả năng phân chia được liên tục + Dòng tế bào giới... trường cũ Rửa và tách các tế Chọn lọc các tế bào bào Chuyển sang môi trường nuôi cấy * Tách rời các tế bào: - Việc tách rời các tế bào được tiến hành bằng enzyme trypsin, một protease trong nhóm serin - Trypsin: là 1 enzyme kiềm tính điểm hình,hoạt động ở pH trung tính hơi kiềm (6 – 9), tối ưu ở pH 8 – 9, rất bền trong môi trường axit yếu - Đặc tính: Trypsin sẽ làm cuộn tròn tế bào do vậy các liên kết... trypsin để thu nhận tế bào đơn Chú ý: - Nếu sử lý chưa đủ thời gian sẽ thu được cụm tế bào Nếu sử lý quá lâu sẽ làm các tế bào giảm sức sống Trypsin Là một protease enzyme, tìm thấy trong hệ tiêu hóa của động vật có xương sống, có vai trò thủy phân protein trong thức ăn - Cách pha loãng: Tế bào đã co tròn bổ xung chất ức chế trypsin hoặc môi trường(gấp 5 lần thể tích enzyme) Pha loãng tế bào đạt nồng độ... được các tế bào đã gần như lão hóa không thể sử dụng cho các ứng dụng của việc nuôi cấy tế bào động vật -Dụng cụ nhân dòng : Đĩa peptri Bình Flask Đĩa nhiều giếng - Khi các quần thể tế bào có sự khác biệt rõ ràng thì có thể phân tách chúng bằng những thao tác trực tiếp bằng tay, dưới kính hiển vi - Có những trường hợp 1 quần thể tế bào tưởng như cùng 1 loại, sự thật lại chứa nhiều loại tế bào thì ta...Hệ thống phân tách tế bào Hệ thống phân tách và phân chia tế bào tự động bằng công Hệ thống kiểm tra chất lượng tế bào nghệ tế bào hạt Máy đếm khuẩn lạc Thiết bị hỗ trợ hút dịch Hệ thống phân tích và ghi hình ảnh • • • • So sánh thiết bị làm bằng nhựa và thủy tinh Nhựa Ưu... bào đơn Không áp dụng được với mẫu hiếm Sức sống tế bào cao Tăng hiệu quả tiếp xúc enzyme Áp dụng cho mẫu lớn không khan hiếm Tách bằng enzyme: • • Sử dụng enzyme: phá vỡ các liên kết giữa các tế bào trong khối mô Hiệu quả khi tách băng enzyme Thu được nhiều tế bào đơn Áp dụng được với hầu hết các mô • Hiệu quả không mong muốn Sức sống tế bào giảm Nếu không bất hoạt enzyme sẽ ảnh hưởng . level Fourth level Fi]h level Hệ thống phân tách tế bào Hệ thống kiểm tra chất lượng tế bào Hệ thống phân tách và phân chia tế bào tự động bằng công nghệ tế bào hạt P1KaNS *+QGcTe+ %LCJix. rời các mảnh mô mục đích làm tế bào tách ra thành tế bào đơn lẻ • Hiệu quả của tách cơ học Thu được ít tế bào đơn Không áp dụng được với mẫu hiếm Sức sống tế bào cao Tăng hiệu quả Jếp. hoặc môi trường chọn lọc 1.Thu nhận mẫu 1.Thu nhận mẫu 2.Tách rời tế bào 2.Tách rời tế bào 3.Nuôi cấy tế bào 3.Nuôi cấy tế bào 6G ^#HIJ *HlNOv ,