BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP QUY TRÌNH PHÁT HIỆN LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỦY HẢI SẢN ðÔNG LẠNH Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Sinh viên thực hiện : Lê Phạm Liên Hằng MSSV: 0811110019 Lớp: 08CSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2011 PHIẾU CAM ðOAN Em tên Lê Phạm Liên Hằng là sinh viên khoa môi trường và công nghệ sinh học. Em xin cam ñoan ñề tài ñồ án tốt nghiệp này do chính em tự nghiên cứu tài liệu và làm. Không sao chép dưới mọi hình thức. Nếu có sao chép, em xin chịu xử lý của trường. i MỤC LỤC Danh mục các hình iv Danh mục các bảng, sơ ñồ iv LỜI MỞ ðẦU 1 CHƯƠNG 1: MỞ ðẦU 3 1.1: ðặt vấn ñề 3 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 4 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 5 2.1: Giới thiệu về thủy hải sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 5 2.1.1. Giới thiệu chung về thủy hải sản 5 2.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản Việt Nam 6 2.1.3. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản trên thế giới 6 2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Listeria monocytogenes 8 2.2.1. Lịch sử phát hiện 8 2.2.2 Phân loại 10 2.2.3. ðặc ñiểm chung của chi Listeria 11 2.2.4. ðặc ñiểm hình thái và kháng nguyên 12 2.2.5. Cấu trúc 14 2.2.5.1. Cấu trúc di truyền 14 2.2.5.2. Cấu trúc tế bào 15 2.2.6. Yếu tố ñộc lực 18 2.2.6.1. Tổ hợp gen của Listeria monocytogen 18 2.2.6.2. ðộc tố listeriolysin A (LLO) 19 2.2.6.3. Vai trò của yếu tố ñộc lực 19 2.2.7. Bệnh và triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra22 ii 2.2.7.1. Bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra 22 2.2.7.2.Các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra 26 2.2.8. Cơ chế gây bệnh 26 2.2.9. Tình hình nhiễm listeria monocytogenes ở Việt Nam và trên thế giới 29 2.2.10. Nguyên tắc ñiều trị 31 2.2.11. Cách phòng ngừa 33 CHƯƠNG 3:PHƯƠNG PHÁP XÁC ðỊNH VI KHUẨN L.MNOCYTOGENES 34 3.1. Phương pháp xác ñịnh truyền thống 34 3.1.1. Nguyên lý và phương pháp 34 3.1.2. Phạm vi phát hiện vi khuẩn 34 3.1.3. Dụng cụ sử dụng 3 3.1.4.Môi trường ñể nuôi cấy 34 3.1.5.Quy trình phân tích vi khuẩn Listeria Monocytogenes 35 3.1.5.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes 35 3.1.5.2. Thuyết minh quy trình 37 3.2. Phương pháp hiện ñại 43 3.2.1. Phương pháp ELISA 43 3.2.1.1. Nguyên tắc 43 3.2.1.2. Quy trình thực hiện phân tích 44 3.2.2. Phương pháp lai phân tử 45 3.2.2.1.Nguyên tắc 46 3.2.2.2. Cách làm 46 3.2.3.Phương pháp PCR 47 3.2.3.1. Nguyên tắc 47 3.2.3.2. Cách làm 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 iii 4.2. Kiến nghị 51 Tài liệu tham khảo 52 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes 8 Hình 2.2. Vi khuẩn Listeria monocytogenes 10 Hình 2.3. Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes 16 Hình 2.4. Lông roi của vi khuẩn Listeria monocytogenes 17 Hình 2.5. Cơ chế xâm nhập vào tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes21 Hình 2.6. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Listeria monocytogenes 27 Hình 3.1. Thử nghiệm Catalase 39 DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ðỒ Bảng 2.1 Dùng ñể phân biệt các loài Listeria 13 Sơ ñồ 3.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes 36 Sơ ñồ 3.2. Quy trình phát hiện Listeria monocytogenes 44 1 LỜI MỞ ðẦU Listeria monocytogenes những năm gần ñây nổi lên như một tác nhân gây bệnh từ thực phẩm quan trọng. ðây là một loại trực khuẩn Gram dương ngắn, nhỏ, không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển ñộng xoay tròn quanh trục thân thành từng ñợt rất ñặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Chúng có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy ñơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9. Trên môi trường thạch rắn, khuẩn lạc của chúng trông như những giọt sương trong suốt, hơi nhuốm màu lam nhạt khi nhìn qua anh sang phản chiếu dưới góc 45 0 . Về mặt sinh hóa Listeria monocytogenes dễ bị nhầm với những vi sinh vật như Lactobacillus, Brochothrix, Erysipelothrix và Kurthia. Một số thử nghiệm sinh hóa ñã ñược áp dụng ñể phân biệt Listeria monocytogenes với các loài Listeria khác như Listeria innocua, Listeria welshimeri và Listerisamurrayi. Xác ñịnh kiểu huyết thanh cũng là một cách ñịnh danh quan trọng ñối với vi sinh vật này. Listeria thuộc loại ưa lạnh, có thể phát tirển ở nhiệt ñộ thấp ñến 2,5 0 C và cao ñến 44 0 C. Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý việc làm vệ sinh ống dẫn lạnh trên trần vì ñó là nơi có ñiều kiện thuận lợi cho Listeria phát triển và tích tụ. Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa ñược biết. Bệnh bắt ñầu từ ñường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các ñại thực bào và gây nhiễm trùng máu. Vi khuẩn tác ñộng lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể xâm nhập vào bào thai trong bệnh mẹ gây sẩy thai, ñẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi. Listeria monocytogenes ñã ñược phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau như thịt, cá, rau, sữa và cà bề mặt nước. Cần lưu ý kiểm tra sự hiện diện của vi sinh vật ở mọi công ñoạn trong quá trình chế biến thực phẩm, từ môi trường, nguyên 2 liệu, ñiều kiện sản xuất, vận chuyển ñến sản phẩm cuối cùng. Nấu chín thực phẩm là một biện pháp hữu hiệu ñể giảm nguy cơ nhiễm bệnh. 3 CHƯƠNG I: MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề. - ðất nước ta có nhiều ñiều kiện thuận lợi ñể phát triển ngành nuôi trồng thủy hải sản. Bờ biển Việt Nam khá dài và rộng, lại nằm trong vùng giao nhau giữa các dòng nước và có khí hậu nhiệt ñới nên trữ lượng hải sản rất dồi dào và có giá trị kinh tế cao. Vì vậy, ngành ñánh bắt nuôi trồng thủy hải sản ở nước ta không ngừng phát triển, không những ñáp ứng mhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường nước ngoài như: Trung Quốc, ðài Loan, Hàn Quốc, Nhật, Mỹ, Anh…. Chất lượng vệ sinh thực phẩm hiện nay ñang là mối quan tâm hàng ñầu khi xuất khẩu thực phẩm sang các quốc gia khác, ñặc biệt là ñối với mặt hàng thủy hải sản ñông lạnh. - Tuy nhiên, việc xuất khẩu thủy hải sản của nước ta ñang gặp khá nhiều khó khăn và một trong nhửng vấn ñề ñó là việc nhiễm các tác nhân gây bệnh, gây ñộc như: dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh…. và Listeria monocytogenes là một trong những tác nhân gây bệnh và gây ngộ ñộc trong sản phẩm thủy hải sản ñông lạnh. - Trong vấn ñề ngộ ñộc thực phẩm, vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra bệnh Losteriosis. Ca ñầu tiên của bệnh Listeriosis ñã ñược nói ñến cách ñây 70 năm, nhưng phải ñợi ñến những năm 1980, vi khuẩn Listeria monocytogenes mới ñược chính thức xác nhận là tác nhân gây ngộ ñộc từ thực phẩm. Listeria monocytogenes hình thành nên các triệu chứng như; sốt, khó chịu, ñau lưng. Nếu ñộc tố ñủ mạnh, chúng sẽ gây ra ngộ ñộc thực phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng như: nôn mửa, tiêu chảy, ñau quặn bụng, nhức ñầu… 4 - Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn như vậy, chúng tôi quyết ñịnh thực hiện ñề tài: “quy trình phát hiện Listeria trong thủy sản ñông lạnh”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu. - Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes trong thủy sản và tìm hiểu các phương pháp xác ñịnh Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thủy sản ñông lạnh. [...]... n: Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua Listeria wells Listeria seeligeri Listeria grayi (loài này hi n bao g m c loài c p dư i Listeria murayi.) - Trong ñó, các loài này ch có 2 loài gây b nh qua th c nghi m và t nhiên, Listeria monocytogenes và Listeria ivanovii Trư c kia, chúng gây b nh cho ngư i và ñ ng v t, sau này chúng gây b nh ch y u cho ñ ng v t C 2 loài này và loài Listeria. .. này, thêm 7 loài khác ñư c xác ñ nh: Listeria invanovii (trư c ñây g i là Listeria monocytogenes serovar5), Listeria innocua, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri, Listeria muarrayi, Listeria grayi và Listeria denitrificans Listeria denitrificans ñư c phân lo i là Jonesia denitrifocans Listeria murrays và Listeria grayi t ng ñư c cho là có khác bi t so v i các loài Listeria khác ñ ñ m b o cho s thành... S phát hi n này có th gi i thích vai trò c a LLO trong quá trình xâm nhi m c a Listeria monocytogenes Sau quá trình th c bào, môi trư ng acid c a không bào ch a t bào vi khu n s ho t hoá LLO Chính ñ c t này xúc ti n quá trình ly gi i không bào và vi khu n xâm nh p vào t bào ch t, trong khi ñó pH cao hơn s làm gi m ho t tính c a LLO 2.2.6.3 Vai trò c a y u t ñ c l c _ Listeria monocytogenes t n t i trong. .. chính c a các loài Listeria là kháng nguyên thân (O) và kháng nguyên lông (H) .Quy trình ñ nh type huy t thanh hi n nay d a trên các kháng nguyên này, ñã phân lo i ñư c 6 nhóm huy t thanh (1/2, 3, 4, 5, 6 và 7) và phân lo i sâu hơn thành các serovar cho t t c các loài tr Listeria grayu và Listeria invanoii Trong khi Listeria invanoii và Listeria welshimeri có th ñư c phân bi t v i Listeria monocytogenes. .. b nh do vi khu n Listeria monocytogenes gây ra 2.2.7.1 B nh do vi khu n Listeria monocytogenes gây ra - Nhi m Listeria ph n mang thai: H i ch ng này xu t hi n trong kho ng m t ph n ba các trư ng h p nhi m Listeria m c dù t l này có th cao hơn nhi u trong các ñ t d ch H u h t các trư ng h p nhi m khu n ñ u xãy ra vào 3 tháng cu i c a thai kỳ ða s ph n mang thai b nhi m Listeria monocytogenes có d... i Listeria monocytogenes Ví d , m t s ch ng Listeria seeligeri có th không phân bi t ñư c v m t kháng nguyên so v i ch ng thu c Listeria monocytogenes nhó, huy t thanh ½ Cũng c n lưu ý r ng, m c dù có 13 serovar c a Listeria monocytogenes m i ñư c xác ñ nh hi n nay, trong khi hơn 90% các ch ng phân l p trên lâm sang ch thu c v 3 serovar: 1/2a; 1/2b va 4b, ñi u này làm h n ch giá tr c a k thu t này trong. .. gây b nh c a vi khu n Listeria monocytogenes - T lâu, các nhà khoa h c ñã phát hi n ra r ng vi khu n Listeria lây lan t t bào này sang t bào khác trong cơ th con ngư i - Sau khi xâm nh p vào cơ th qua ñư ng tiêu hóa, Listeria monocytogenes ti p t c di chuy n qua d dày r i ñi vào các mô ru t non c a v t ch , bao g m các t bào bi u mô và các ñ i th c bào c a m ng Peyer Trong su t quá trình di chuy n chúng... màng i − Nhi m Listeria tr sơ sinh: 22 G n gi ng như các trư ng h p nhi m khu n liên c u nhóm B nhi m Listeria tr sơ sinh, tr sơ sinh có th ñư c chia thành hai nhóm kh i phát s m và mu n Kh i phát s m là bi u hi n nhi m khu n trong vòng 5 ngày, nh t là kho ng 48 gi sau sinh B nh kh i phát mu n thì phát b nh sau 5 ngày t khi sinh, trung bình là 14 ngày T l t vong cao t i 60% cho nhóm kh i phát s m và 25%... xãy ra sau khi tr ñư c sinh ra dã ñư c ghi nh n trong nhi u báo cáo v các nhóm nhi m Listeria kh i phát mu n B nh kh i phát mu n hay có viêm màng não ho c viêm não màng não ( 90% các trư ng h p) Kh i phát muôn thư ng âm th m hơn so v i th b nh kh i phát s m v i nh ng tri u ch ng thư ng g p như tr bú kém ho c b bú, khó ch u và s t 23 - Nhi m Listeria Nhi m Listeria ngư i trư ng thành ngư i trư ng thành... tiêu ch y nh ng ngư i b suy gi m mi n d ch - Nhi m khu n ñ ng v t: Trong s các ñ ng v t, b nh do Listeria monocytogenes tác ñ ng chuyên bi t trên gia súc, c u và dê v i th i gian 25 b nh t 2-6 tu n ð ng v t b nhi m Listeria monocytogenes ch y u là qua th c ăn b nhi m Listeria monocytogenes, qua ñư ng hô h pho c do ti p xúc tr c ti p S phát b nh xãy ra kèm theo s suy gi m mi n d ch ñ i v i tác nhân gây . trình phát hiện Listeria trong thủy sản ñông lạnh . 1.2. Mục tiêu nghiên cứu. - Tìm hiểu tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes trong thủy sản và tìm hiểu các phương pháp xác ñịnh Listeria monocytogenes. thiệu về thủy hải sản và tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 5 2.1.1. Giới thiệu chung về thủy hải sản 5 2.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản Việt Nam. Sơ ñồ 3.1. Quy trình kiểm nghiệm vi khuẩn Listeria monocytogenes 36 Sơ ñồ 3.2. Quy trình phát hiện Listeria monocytogenes 44 1 LỜI MỞ ðẦU Listeria monocytogenes