BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** TRỊNH MINH HỢP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN ðỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA HÜBNER) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** TRỊNH MINH HỢP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN ðỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA HÜBNER) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62. 62. 05. 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1: GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH 2: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI - 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị nào. Các tài liệu trích dẫn ñược chỉ rõ nguồn gốc và mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cám ơn. Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2012 Tác giả luận án Trịnh Minh Hợp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Lời ñầu tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến GS. TS. Lê Trần Bình và PGS. TS. Phan Hữu Tôn, những người thầy ñã tận tình dìu dắt, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học và Viện ðào tạo Sau ñại học, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh ñạo và các cán bộ Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố ñã ủng hộ, tạo ñiều kiện giúp ñỡ về mọi mặt ñể tôi thực hiện ñề tài này. ðặc biệt, xin chân thành cảm ơn các ñồng nghiệp Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực vật ñã trợ giúp tôi hoàn thành ñề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh ñạo và cán bộ nghiên cứu của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng chân thành cảm ơn gia ñình, người thân và bạn bè ñã cho tôi ñộng lực, chia sẻ với tôi mỗi khi gặp khó khăn trong quá trình thực hiện ñề tài. Hà Nội, ngày 06 tháng 6 năm 2012 Tác giả luận án Trịnh Minh Hợp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Trang Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Ký hiệu và chữ viết tắt trong luận án ix Danh mục bảng trong luận án xi Danh mục hình trong luận án xiv MỞ ðẦU ………………………………………………………………. 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài ………………………………………… 1 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài ……………………… 2 2.1. Ý nghĩa khoa học của ñề tài ………………………………… 2 2.2. Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài ………………………………… 3 3. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài ………………………………… 3 3.1. Mục ñích của ñề tài ……………………………………… 3 3.2. Yêu cầu của ñề tài ………………………………………… 3 4. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài …………………… 4 4.1. ðối tượng nghiên cứu của ñề tài ………………………… 4 4.2. Phạm vi nghiên cứu của ñề tài …………………………… 4 5. ðóng góp mới của luận án ……………………………… 4 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… iv Trang Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ……………… 5 1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam 5 1.1.1. Sơ lược về cây bông …………………………………… 5 1.1.2. Tình hình sản xuất bông trên thế giới ………………… 5 1.1.3. Tình hình chọn tạo và sản xuất bông ở Việt Nam ……… 6 1.2. Sâu hại bông và tổn thất gây ra ………………………………… 9 1.2.1. Sâu hại bông ……………………………………………… 9 1.2.2. Tổn thất do sâu hại bông và chi phí phòng trừ ………… 11 1.3. Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu 12 1.4. Ý nghĩa của trồng bông Bt kháng sâu ………………………… 14 1.4.1. Tăng năng suất ……………………………………………. 14 1.4.2. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu ………………………………. 14 1.5. Sơ lược lịch sử khám phá gen Bt ………………………………. 16 1.6. Tái sinh cây bông 17 1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma ……………… 17 1.6.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo ña chồi …………………. 22 1.7. Chuyển gen cây bông ………………………………………… 23 1.7.1. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ………… 24 1.7.2. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua ñường ống phấn 28 1.7.2.1. Cơ chế của chuyển gen PTP ………………………… 28 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… v Trang 1.7.2.2. Tiến bộ của chuyển gen PTP ở cây bông …………… 30 1.7.2.3. Thuận lợi và khó khăn của chuyển gen PTP ……… 30 1.7.2.4. Yếu tố ảnh hưởng ñến hiệu quả chuyển gen PTP … 32 1.7.2.5. Nguyên tắc cơ bản trong thao tác vi tiêm ……… 33 1.8. Sàng lọc và ñánh giá cây chuyển gen ………………………… 33 1.8.1. Sàng lọc tế bào, mô ho ặc cây chuyển gen nhờ gen chỉ thị chọn lọc ………………………………………………… 34 1.8.1.1. Gen chỉ thị chọn lọc …………………………………. 34 1.8.1.2. Gen chỉ thị chọn lọc thông dụng …………………… 35 1.8.2. Xác ñịnh sự có mặt của gen chuyển trong tế b ào cây chuyển gen ……………………………………………… 37 1.8.2.1. Xác ñịnh sự có mặt của gen chuyển trong tế b ào bằng PCR …………………………………………… 37 1.8.2.2. Xác ñịnh sự gắn kết và s ố bản sao gen chuyển bằng Southern blot ………………………………………… 39 1.8.3. ðánh giá s ự biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen …………………………………………… 41 1.8.3.1. ðánh giá hoạt ñộng phiên mã c ủa gen chuyển bằng Northern blot ………………………………………… 41 1.8.3.2. ðánh giá hoạt ñộng dịch mã của gen chuyển bằ ng Western blot …………………………………………. 42 1.8.4. ðánh giá tính kháng sâu của cây bông chuyển gen Bt …… 43 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… vi Trang Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1. Vật liệu nghiên cứu …………………………………………… 46 2.1.1. Giống bông ……………………………………………… 46 2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn ………………. 46 2.1.3. Cặp mồi ñặc hiệu …………………………………………. 48 2.1.4. Hoá chất ………………………………………………… 48 2.1.5. Máy móc, thiết bị …………………………………………. 49 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu …………………………. 49 2.2.1. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens …… 49 2.2.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma ………… 49 2.2.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo ña chồi 51 2.2.1.3. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens 53 2.2.2. Chuyển gen vào cây bông bằng vi tiêm vào b ầu nhụy qua ñường ống phấn ………………………………………… 55 2.2.2.1. Xác ñịnh thông số vi tiêm …………………………… 55 2.2.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T 0 ……………… 55 2.2.3. Sàng lọc, ñánh giá cây bông chuyển gen …………………. 56 2.2.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh ……. 56 2.2.3.2. ðánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR ………… 57 2.2.3.3. ðánh giá tính kháng sâu xanh của cây chuyển gen …. 57 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… vii Trang Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………………………… 60 3.1. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens ……… 60 3.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma … 60 3.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo ña chồi …………………. 71 3.1.3. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens 78 3.1.3.1. Xác ñịnh thông số chuyển gen ………………………. 78 3.1.3.2. Thực hiện chuyển gen ………………………………. 84 3.2. Chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng vi tiêm vào b ầu nhụy qua ñường ống phấn …………………………………… 90 3.2.1. Xác ñịnh thông số vi tiêm ………………………………… 91 3.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T 0 …………………… 94 3.3. Sàng lọc, ñánh giá cây bông chuyển gen ………………………. 97 3.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh …………. 97 3.3.1.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin … 97 3.3.1.2. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin ……. 100 3.3.2. ðánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR ……………… 107 3.3.3. ðánh giá tính kháng sâu xanh của cây bông chuyển gen 110 3.3.3.1. ðánh giá tính kháng sâu xanh của 7 dòng chuy ển gen thế hệ T 2 giống Coker312 và SSR60F ……… 110 3.3.3.2. ðánh giá tính kháng sâu xanh của 80 dòng chuy ển gen thế hệ T 2 giống LRA5166, MCU9 và TM1 … 111 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp ……………………… viii Trang 3.3.3.3. ðặc tính kháng sâu xanh của các dòng chuy ển gen thế hệ T 2 …………………………………………… 115 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ……………………………………………. 120 1. Kết luận ………………………………………………………… 120 2. ðề nghị …………………………………………………………… 121 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ðà CÔNG B Ố CÓ LIÊN QUAN ðẾN ðỀ TÀI ……………………………………………. 122 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………. 123 PHỤ LỤC ……………………………………………………………… 141 [...]... ng trên cây bông (Matthews, 199 4) [87] nhưng s loài sâu h i có t m quan tr ng v m t kinh t ch kho ng 7-8 loài H u h t các loài sâu h i bông chính thu c b cánh v y (Lepidoptera) Các loài sâu b cánh v y h i bông quan tr ng nh t l sâu h ng (Pectinophora gossypiella), ti p ñ n l sâu xanh (Helicoverpa armigera) , sâu loang (Earias spp .), sâu xám (Agrotis spp .), sâu xanh b p (Helicoverpa zea), sâu khoang... (Spodoptera literoralis), sâu xanh thu c l (Heliothis virescens) và sâu xanh Úc (Helicoverpa punctigera) (James, 200 2) [73] Sâu xanh (Helicoverpa armigera) l sâu h i ph bi n nh t, tìm th y 30/33 nư c tr ng bông l n, tương ñương v i 90% s qu c gia; ti p theo l sâu h ng, tìm th y 82% s qu c gia; m t s Diparopsis spp ñư c tìm th y (Spodoptera spp .) 63% s sâu khác như sâu loang và qu c gia, sâu xanh da l ng... U 1.1 Sơ l c v cây bông, tình hình s n xu t bông th gi i và Vi t Nam 1.1.1 Sơ l c v cây bông Cây bông (Gossypium sp .) thu c chi Bông (Gossipyum), h C m Quỳ (Malvaceae) Chi Bông có 45-50 loài, trong ñó, 40-45 loài nh b i (2n = 2x = 2 6) và 5 loài t b i (2n = 4x = 5 2) Có 4 loài bông tr ng tr t: 2 loài nh b i l loài bông C châu Á (G arboreum L. ) và bông C châu Phi (G herbaceum L. ), có trung tâm kh i... ng bông, ñ c bi t l gi ng bông Vi t Nam - T o ra m t s dòng bông chuy n gen kháng sâu xanh cao (t l gi t sâu ≥ 80 %) l m v t li u quý cho ch n t o gi ng bông kháng sâu trong nư c 3.2 Yêu c u c a ñ tài - Chuy n ñư c gen CryIAc vào m t s gi ng bông b ng phương pháp chuy n gen thông qua A tumefaciens và vi tiêm vào b u nh y qua ñư ng ng ph n - Sàng l c, ñánh giá và ch n l c ñư c m t s dòng bông chuy n gen. .. ) và ðông Phi (C châu Phi); và 2 loài t b i l loài bông Lu i (G hirsutum L. ) và bông H i ð o (G barbadense L. ), có trung tâm kh i nguyên trung M (Lu i) và trung tâm Nam M (H i ð o) (Brubaker et al., 1999 [28]; Endrizzi et al., 1984 [43]; Fryxell, 1992 [50 ]) Loài bông C châu Á ñư c tr ng ch y u bông C châu Phi ch ñư c tr ng n ð và Pakistan, loài vùng khô h n c a châu Phi và châu Á Hi n nay, loài bông. .. l ng và m c ñ gây h i c a các lo i sâu h i có th khác nhau ph thu c vào ñi u ki n vùng sinh thái, ch ñ canh tác, mùa v gieo tr ng Tuy nhiên, thành ph n sâu h i ph bi n các vùng có th phân thành 2 nhóm chính: (i) nhóm sâu mi ng nhai, g m các lo i gây h i chính như sâu xanh (Helicoverpa armigera) , sâu xanh da l ng (Spodoptera exigua), sâu loang (Earias vittella), sâu h ng (Pectinophora gossypiella),... sinh và có th chuy n gen vào b t kỳ gi ng bông nào M c dù, cũng có như c ñi m như quy mô chuy n gen l n, t n nhi u công lao ñ ng, ph thu c vào ngo i c nh, nhưng phương pháp chuy n gen này ñang ngày càng ñư c quan tâm s d ng Xu t phát t nh ng cơ s trên, ñ tài Nghiên c u ng d ng phương pháp chuy n gen ñ t o dòng bông (Gossypium hirsutum L. ) kháng sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner)” ñư c ti n hành 2... 17-20 l n/v (Nguy n Thơ và cs, 200 1) [12] Trong 10 năm g n ñây, thi t h i do sâu xanh ñã gi m ñáng k , nhưng cũng chi m t i 20-30% s n l ng Như v y, trên th gi i cũng như Vi t Nam, các loài sâu h i bông ch y u l sâu xanh, sâu h ng, sâu loang, sâu xám, sâu xanh ngô, sâu khoang, sâu xanh thu c l và sâu xanh Úc T n th t do chúng gây ra cho s n xu t bông r t l n ðây cũng l các ñ i tư ng ñư c phòng tr b... ng bông kháng sâu b cánh v y, thu c 5 nhóm nh , mang các gen Bt khác nhau ñã ñư c ñăng ký b n quy n s d ng, g m: (i) nhóm mang gen CryIAc, ñ i di n l gi ng Bollgard® (Bollgard® cotton); (ii) nhóm mang ñ ng th i 2 gen CryIAc và CryIIAb, ñ i di n l gi ng BollgardII (BollgardII cotton); (iii) nhóm mang gen CryIF, ñ i di n l gi ng 281-24-236 (281-24-236 event); (iv) nhóm mang ñ ng th i 2 gen CryIAc... công tác ch n t o gi ng bông truy n th ng và l m cơ s áp d ng ñ ch n t o các lo i gi ng cây tr ng kháng sâu khác 2.2 Ý nghĩa th c ti n c a ñ tài - K t qu nghiên c u c a ñ tài t o ra dòng bông chuy n gen kháng sâu xanh ñ l m v t li u quý cho chương trình ch n t o gi ng bông kháng sâu, nh m cung c p cho s n xu t bông hàng hóa trong nư c - Nh có gi ng bông chuy n gen kháng sâu xanh s d ng trong s n xu . TRỊNH MINH HỢP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN ðỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L. ) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA HÜBNER) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP . ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** TRỊNH MINH HỢP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN ðỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L. ) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA. những cơ sở trên, ñề tài Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen ñể tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L. ) kháng sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner)” ñược tiến hành. 2. Ý nghĩa khoa học