Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS LƯƠNG THỊ HỒNG VÂN 2. TS. NGUYỄN GIA BÌNH Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cơ thể ngƣời có khoảng 40 lít dịch trong đó 25 lít nằm trong các tế bào gọi là dịch nội bào, 15 lít nằm bên ngoài tế bào gọi là dịch ngoại bào. Dịch ngoại bào gồm có huyết tƣơng, dịch kẽ, dịch bạch huyết, dịch ổ mắt, dịch tiêu hóa, dịch não tủy (DNT)… Dịch ngoại bào đƣợc vận chuyển trong máu tuần hoàn, có sự trao đổi giữa máu và các mô qua thành mao mạch [6]. Trong các dịch cơ thể nói trên đều chứa các chất vô cơ và hữu cơ hòa tan nhƣ protein, glucose, canxi, photpho, kali Khi các trị số về hàm lƣợng của những chất này vƣợt khỏi giới hạn sinh lý cho phép (cao hoặc thấp hơn) thì chúng phản ánh những trạng thái bệnh lý nào đó của cơ thể con ngƣời [2], [6]. Ngoài các dịch cơ thể bình thƣờng kể trên, có một số dịch xuất hiện với lƣợng nhiều hơn bình thƣờng biểu hiện bệnh lý nhƣ dịch màng phổi (DMP), dịch màng bụng (DMB), dịch màng tim… gây hiện tƣợng tràn dịch. Dựa trên chỉ số protein là chính và các chất khác có trong dịch mà phân biệt là dịch thấm (transsudat) hoặc dịch tiết (exsudat). Dịch thấm gặp trong các trƣờng hợp thận hƣ, xơ gan có tràn dịch phúc mạc, suy tim. Dịch tiết thƣờng do nguyên nhân nhiễm khuẩn, lao, ung thƣ. Vì vậy khi chẩn đoán một bệnh nào đó có dựa vào xét nghiệm dịch chọc dò (là các dịch đƣợc lấy ra từ màng phổi, màng tim, dịch khoang phúc mạc hoặc dịch tràn từ các khớp lớn), ngƣời ta thƣờng quan tâm nhiều đến chỉ số protein trong đó có hay không có và có bao nhiêu trong một đơn vị tính (ví dụ g/l hoặc mg/dl). Trƣớc đây các nhà chuyên môn chỉ sử dụng phƣơng pháp định tính trong quy trình xét nghiệm dịch chọc dò, những phƣơng pháp này chỉ cho phép trả lời câu hỏi có hay không có protein trong dịch chọc dò mà thôi. Hơn nữa, chỉ một nhiễm tạp nhỏ trong quá trình xét nghiệm cũng sẽ dẫn tới làm sai lệch kết quả, làm mất thời gian, gây tâm lý lo ngại cho bệnh nhân. Hiện nay, với nhiều thành Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2 tựu của khoa học kỹ thuật nói chung và kỹ thuật xét nghiệm nói riêng đã cho phép các nhà sinh học có thể định lƣợng protein nhằm xác định chính xác hàm lƣợng protein có mặt trong bất cứ một sinh phẩm nào, trong đó có các dịch chọc dò của ngƣời. Hay việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu các chỉ thị protein bệnh trong chẩn đoán. Các kỹ thuật này nếu đƣợc nghiên cứu thành công và áp dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm của các bệnh viện sẽ giúp các bác sĩ chẩn đoán bệnh chính xác hơn và từ đó đƣa ra biện pháp điều trị bệnh phù hợp, kịp thời có hiệu quả hơn. Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính đa hình protein trong một số loại dịch chọc dò của người và tìm giới hạn phát hiện định lượng protein nhằm thay thế các phản ứng định tính”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Xác định đƣợc tính đa hình của hệ protein trong từng loại dịch chọc dò nhằm hƣớng tới chỉ thị protein trong chẩn đoán bệnh. - Xác định đƣợc giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong các dịch chọc dò nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho các phản ứng định tính protein đang dùng tại các bệnh viện của Việt Nam. 3. Nội dung nghiên cứu: - Phân tích hàm lƣợng protein trong các loại dịch chọc dò: DNT, DMP và DMB của nhóm bệnh nhân đƣợc nghiên cứu. - Định tính protein trong DNT bằng phản ứng Pandy, trong DMP và DMB bằng phản ứng Rivalta. - Xác định giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DNT nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho phản ứng Pandy. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3 - Xác định giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DMP và DMB nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho phản ứng Rivalta. - Xác định tính đa hình của protein trong các loại dịch chọc dò đƣợc nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di. 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài Sử dụng đặc điểm hóa sinh về protein trong các dịch chọc dò làm cơ sở khoa học cho các chẩn đoán cận lâm sàng của các bệnh liên quan đến dịch chọc dò. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng về các dịch chọc dò nghiên cứu 1.1.1. Khái niệm về dịch chọc dò Dịch chọc dò là các dịch đƣợc lấy ra từ màng phổi, màng tim, khoang của não và tủy, khoang phúc mạc hoặc dịch tràn từ các khớp lớn Có 2 loại dịch khác nhau về bản chất là dịch tiết và dịch thấm. Dịch thấm gặp trong các trƣờng hợp thận hƣ, xơ gan có tràn dịch phúc mạc, suy tim. Dịch tiết thƣờng do nguyên nhân nhiễm khuẩn, lao, ung thƣ [2]. 1.1.2. Dịch não tủy - Nguồn gốc DNT Toàn bộ các khoang của não và tủy có thể tích vào khoảng 1600 ml và khoảng 150 ml thể tích này chứa DNT. DNT có trong các não thất, trong các bể chứa quanh não, trong các khoang chứa màng nhện của não và tủy [6]. DNT đƣợc bài tiết bởi các đám rối màng mạch của các não thất, chủ yếu là hai não thất bên. Ngoài ra DNT cũng đƣợc bài tiết bởi màng ống nội tủy, màng nhện và một phần do não bài tiết qua các khoang mạch đi vào trong não. Các đám rối màng mạch bài tiết DNT thông qua sự vận chuyển tích cực ion Na + qua các tế bào biểu mô nằm ở phía ngoài của đám rối [6]. - Đặc điểm, tính chất, chức năng của DNT DNT là dịch không màu. DNT có hàm lƣợng protein rất thấp khoảng 20 đến 30 mg/dl và hầu nhƣ không có tế bào (5 bạch cầu lympho/mm3), nồng độ ion Na + bằng nồng độ ion Na + của huyết tƣơng, nồng độ ion Cl - cao hơn 15%, nồng độ K + thấp hơn 40% và nồng độ glucose thấp hơn 30%. Bình thƣờng áp suất DNT của ngƣời ở tƣ thế nằm nghiêng là 100 đến 200 mm H 2 O, ở tƣ thế ngồi là 200 mm H 2 O [6]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 5 Chức năng quan trọng nhất của DNT là đệm cho não ở trong hộp sọ cứng. Vì tỷ trọng của não và DNT tƣơng tự nhau nên não nổi trong dịch, vì vậy một va chạm vào đầu sẽ làm toàn bộ não chuyển động đồng thời và không một phần nào của não bị xoắn lại vào lúc đó. DNT cũng đóng vai trò của một bình chứa để thích nghi với những thay đổi thể tích của hộp sọ. Trong một chừng mực nào đó, DNT cũng là nơi trao đổi chất dinh dƣỡng của hệ thần kinh. Tuy nhiên phần lớn quá trình trao đổi chuyển hóa của não đƣợc thực hiện trực tiếp với máu [6]. 1.1.3. Dịch màng phổi - Nguồn gốc DMP Khoang màng phổi gồm một lá tạng bao phủ bên ngoài phổi và một lá thành phủ mặt trong thành ngực. Bình thƣờng trong khoang màng phổi có 10 - 20 ml dịch lỏng để hai lá trƣợt lên nhau dễ dàng, dịch lỏng này đƣợc tiết ra từ màng phổi lá thành, và đƣợc hấp thu chủ yếu ở bạch mạch lá thành màng phổi và một phần lá tạng. Loại dịch lỏng này gọi là DMP [21]. - Đặc điểm, tính chất và chức năng DMP Ở ngƣời bình thƣờng, DMP có thể tích khoảng 0,1 - 0,2 ml/kg. Trong DMP có khoảng 1000 - 5000 tế bào/mm 3 . Trong đó, 3 - 70 % mesothelial, 30 - 75% monocytes, 2 - 30% lymphocytes, 10% granulocytes. Hàm lƣợng protein không quá 2 g/dl. Hàm lƣợng glucose tƣơng đƣơng hàm lƣợng glucose trong huyết tƣơng. LDH nhỏ hơn 50% nồng độ trong huyết tƣơng [21]. DMP có tác dụng bôi trơn hai lá màng phổi khi chúng trƣợt lên nhau trong chu kỳ thở. Khi DMP có nhiều gọi là tràn dịch màng phổi (TDMP), xảy ra do thay đổi chênh lệch thuỷ tĩnh hoặc do thay đổi tính thấm màng phổi [21]. - Hiện tƣợng TDMP TDMP là sự tích tụ dịch bất thƣờng trong khoang màng phổi. TDMP đƣợc chia thành TDMP dịch thấm và TDMP dịch tiết. TDMP dịch thấm xuất Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 6 hiện khi có sự thay đổi các yếu tố toàn thân có ảnh hƣởng đến sự hình thành và hấp thu DMP làm cho DMP tích tụ. TDMP dịch tiết xuất hiện khi có sự thay đổi bề mặt của màng phổi hoặc thay đổi tại các mao mạch màng phổi làm tích tụ DMP [23]. 1.1.4. Dịch màng bụng - Nguồn gốc DMB DMB hay còn gọi là dịch báng hoặc dịch phúc mạc. Phúc mạc là một thanh mạc phủ tất cả các thành của ổ bụng, bao bọc các tạng thuộc bộ máy tiêu hoá và che phủ phía trƣớc, hoặc phía trên các tạng tiết niệu và sinh dục. Phúc mạc gồm có 2 lớp, lớp thanh mạc và lớp dƣới thanh mạc. Lớp thanh mạc là lớp tế bào thƣợng mô trơn láng óng ánh và tiết ra một lớp dịch mỏng làm thấm ƣớt phúc mạc để trƣợt lên nhau dễ dàng. DMB là loại dịch có đƣợc do sự tích tụ các chất lỏng tự do trong khoang phúc mạc [7], [28]. - Đặc điểm, tính chất và chức năng DMB DMB có thể là dịch thấm hoặc dịch tiết. DMB bình thƣờng không vƣợt quá 5ml dịch thấm. DMB thƣờng có màu vàng rơm, xuất hiện vẩn đục là do sự hiện diện của các bạch cầu trung tính. Ngoài ra trong dịch còn có các chất béo trung tính. DMB là một chất lỏng có vai trò nhƣ một chất bôi trơn trong khoang bụng. DMB có tác dụng làm ẩm bên ngoài của các cơ quan và giảm ma sát các nhu động của cơ quan trong quá trình tiêu hóa [7]. - Hiện tƣợng tràn dịch màng bụng (TDMB) TDMB là một dấu hiệu lâm sàng phổ biến có nhiều nguyên nhân nhƣ: xơ gan (75%), các bệnh ác tính (10%), suy tim (5%) và các nguyên nhân khác (10%) [28]. 1.2. Một số phƣơng pháp nghiên cứu protein dịch chọc dò 1.2.1. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu định tính protein Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 7 - Định tính protein bằng phản ứng Xantoprotein Dinitrotyrozin (màu vàng) Thể quinoit của dinotrotyrozin Muối natri của dinitrotyrozin (màu da cam) Hình 1.1. Sơ đồ cơ chế của phản ứng Xantoprotein [9] Đây là những phản ứng đặc trƣng cho những protein có chứa acid amin vòng nhƣ phenilalanin, tirozin, tryptophan. Khi đun nóng dung dịch protein với HNO 3 đậm đặc tạo thành dẫn xuất nitơ màu vàng. Khi thêm dung dịch kiềm vào sẽ tạo thành muối có cấu tạo quinoit màu da cam. Ngƣợc lại, các protein không chứa acid amin vòng nhƣ gelatin không cho phản ứng này [9]. - Định tính protein bằng phản ứng Millon tyrozin Thủy ngân – nitrotyrozin(màu đỏ) Hình 1.2. Sơ đồ cơ chế của phản ứng Millon [9] Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 8 Thuốc thử millon là hỗn hợp các muối nitrat và nitric thủy ngân đƣợc hòa tan trong HNO 3 . Khi thuốc thử tác dụng với nhân phenol của tyrozin sẽ tạo nên hợp chất nitrotyrozin thuỷ ngân có màu đỏ. Phản ứng Millon đƣợc dùng để phát hiện protein chứa tyrozin và các hợp chất phenol [9]. - Định tính protein bằng phản ứng Adamkievic Tryptophan Bis – 2-tryptophanalilmetan Hình 1.3. Sơ đồ cơ chế của phản ứng Adamkievic [9] Trong môi trƣờng acid, tryptophan phản ứng với nhiều loại andehit tạo thành những sản phẩm ngƣng kết có màu đỏ tím đặc trƣng. Phản ứng Adamkievic đƣợc dùng để phát hiện protein chứa tryptophan [9]. - Định tính protein bằng phản ứng tủa với TCA (acid tricloacetic) TCA là một acid hữu cơ có khả năng làm kết tủa protein trong dung dịch. Khi cho TCA vào dung dịch thì nó làm kết tủa protein sau đó ta đem lọc và rửa kết tủa sẽ thu đƣợc protein. Phƣơng pháp này chỉ dùng cho các protein tan trong nƣớc và có độ chính xác tƣơng đối cao [9]. 1.2.2. Các phƣơng pháp thƣờng dùng trong nghiên cứu định lƣợng protein - Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử folin. Phƣơng pháp này sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thủ folin tác dụng lên gốc tyrozin, tryptophan, histidin, để tạo phức màu xanh đặc trƣng có độ hấp thu [...]... Phƣơng pháp xử lý số liệu Phân tích và xử lý số liệu bằng thống kê trong sinh - y học [16], [20] Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 32 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả định tính và định lƣợng protein trong các dịch chọc dò nghiên cứu 3.1.1 Thu nhận các loại dịch chọc dò dùng trong nghiên cứu Hình 3.1 Các mẫu dịch chọc dò dùng trong nghiên cứu Ghi chú: Mẫu 1:... [2], Balfe và cs (2009) [28] Để xác định hàm lƣợng protein tổng số và tìm ra giới hạn phát hiện của xét nghiệm định lƣợng protein trong DNT, DMP, DMB nhằm thay thế hoặc bổ trợ cho các phản ứng định tính Pandy và Rivalta chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng protein tổng số trong các loại dịch chọc dò kể trên và đồng thời tiến hành xét nghiệm Pandy đối với DNT, xét nghiệm Rivalta với DMP và DMB Số hóa... chiều, thủy phân protein trong gel, sau đó nhận dạng bằng khối phổ đang là một trong những cách tiếp cận thƣờng đƣợc sử dụng nhất trong nghiên cứu proteomics [32], [33] 1.3 Một số xét nghiệm sinh hóa dịch chọc dò và ý nghĩa của việc nghiên cứu protein dịch chọc dò 1.3.1 Một số xét nghiệm sinh hóa dịch chọc dò dùng trong chẩn đoán Xét nghiệm đạm và LDH (lactic dehydrogenase): Đây là một trong những xét... Các tác giả đã phát hiện ở nhóm bệnh nhân này, DMP màu đỏ máu chiếm đa số (64,8%), tế bào lympho tăng trong DMP Đây là những căn cứ quan trong chẩn đoán lâm sàng phát hiện nguyên nhân gây tràn dịch sớm [13] 1.4.3 Tình hình nghiên cứu sinh hóa DMB ở Việt Nam và trên thế giới DMB cũng là một trong những loại dịch chọc dò của ngƣời nhƣng các nghiên cứu về loại dịch này trên thế giới và cũng nhƣ ở Việt... nhàng lên mặt dung dịch acid acetic vừa pha một vài giọt dịch chọc dò (DMP, DMB) Quan sát hiện tƣợng: + Nếu những giọt dịch chọc dò chìm xuống đáy cốc, vẩn đục trắng nhƣ khói thuốc lá thì phản ứng dƣơng tính + Nếu dung dịch acid acetic vẫn trong thì phản ứng âm tính [2] 2.4.3 Điện di biến tính SDS-PAGE xác định sự đa hình protein trong từng loại dịch Sử dụng phƣơng pháp điện di biến tính (SDS-PAGE) Kỹ... proteomics đang trở thành cơ sở cho sự phát triển của genomics chức năng Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh y học, là nền tảng cho sự phát triển các sản phẩm chẩn đoán và chữa bệnh trong tƣơng lai 1.4 Sơ lƣợc tình hình nghiên cứu sinh hóa các dịch chọc dò ở Việt Nam và trên thế giới 1.4.1 Tình hình nghiên cứu sinh hóa DNT ở Việt Nam và trên thế giới. .. cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng các loại dịch chọc dò cho mục đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lý, đã và đang đƣợc minh chứng qua những thành tựu thu đƣợc trong nhiều thập kỷ qua Lƣợng thông tin phong phú do các nghiên cứu về protein dịch chọc dò thu đƣợc hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên cứu genome Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật... 4: DNT Đánh giá cảm quan các loại dịch trong nghiên cứu (hình 3.1) chúng tôi nhận thấy các mẫu DNT thu đƣợc không màu và trong suốt Các mẫu DMP và DMB thu đƣợc thấy có màu vàng rơm đậm hoặc nhạt, trong suốt hoặc vẩn đục Kết quả đánh giá cảm quan của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây đã công bố về các loại dịch trên của một số tác giả nhƣ Trịnh Bỉnh Dy và cs (2006) [6], Nguyễn... thế giới DNT là một trong số các dịch chọc dò đƣợc nhiều nhà khoa học trong nƣớc và thế giới quan tâm nghiên cứu Hầu hết các nghiên cứu đều coi đây là một đối tƣợng cần phân tích để đƣa ra những dấu hiệu trong chẩn đoán DNT là thành phần liên quan tới hầu hết các hoạt động của hệ thống thần kinh trung ƣơng Hiện nay, DNT đƣợc sử dụng để nghiên cứu các bệnh liên quan tới việc mất cân bằng các thành phần... DMP đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới khẳng định có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm nguyên nhân gây TDMP [31] Các nhà khoa học tại Đại học Y khoa Wonkwang Hàn Quốc (2013) đã tiến hành nghiên cứu DMP của bệnh nhân ung thƣ phổi ác tính phát hiện protein phản ứng C có liên quan mật thiết tới quá trình viêm ác tính Định lƣợng protein phản ứng C trong DMP có thể hoàn thiện để trở thành một xét nghiệm . protein trong một số loại dịch chọc dò của người và tìm giới hạn phát hiện định lượng protein nhằm thay thế các phản ứng định tính . 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: - Xác định đƣợc tính đa hình. XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH Chuyên ngành:. XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH PROTEIN TRONG MỘT SỐ LOẠI DỊCH CHỌC DÒ CỦA NGƯỜI VÀ TÌM GIỚI HẠN PHÁT HIỆN ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NHẰM THAY THẾ CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH