ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Ngô Thị Hà NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Ngô Thị Hà NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TĂNG THỊ CHÍNH Thái Nguyên - 2013 MỞ ĐẦU Việt Nam nƣớc nông nghiệp Sản xuất nông nghiệp lĩnh vực sản xuất quan trọng phát triển Việt Nam Trong trồng trọt giữ vai trị quan trọng số yếu tố gắn liền với trồng trọt phân bón nhằm nâng cao suất trồng cho mùa màng bội thu Theo thống kê Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, năm Việt Nam sử dụng triệu phân urê, khoảng 600 nghìn phân DAP lƣợng tƣơng đƣơng loại phân khác [18] Tuy nhiên theo đánh giá Viện Dinh dƣỡng Quốc tế, phân bón đóng góp khoảng 30 – 35% tổng trọng lƣợng trồng [19] Do đó, sử dụng phân bón hóa học không hợp lý gây ô nhiễm môi trƣờng Bên cạnh đó, sản phẩm phân bón vi sinh có ƣu điểm nhƣ: thân thiện với mơi trƣờng, giúp cân sinh thái, không nguy hại sức khỏe ngƣời Để hƣớng tới nơng nghiệp xanh thân thiện mơi trƣờng phân bón vi sinh lựa chọn hàng đầu Nhƣng việc áp dụng sản phẩm phân bón vi sinh vào nơng nghiệp cịn gặp nhiều khó khăn: hiệu khơng tức thì, quy mơ sản xuất chƣa đủ đáp ứng, chất lƣợng sản phẩm chƣa ổn định Vì vậy, nghiên cứu để hoàn thiện nâng cao chất lƣợng phân bón vi sinh việc làm cần thiết Trong đó, việc tuyển chọn đánh giá hoạt tính chủng vi sinh vật khâu quan trọng quy trình tạo chế phẩm phân bón vi sinh Để góp phần phát triển nông nghiệp nƣớc đồng thời bảo vệ môi trƣờng hƣớng tới nghiên cứu loại phân bón cố định đạm tự nhiên, thân thiện với môi trƣờng, giá thành phải tiến hành thực luận văn tốt nghiệp với tên đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng vi khuẩn cố định nitơ tự phục vụ cho sản xuất chế phẩm vi sinh” Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Nội dung nghiên cứu: - Tuyển chọn số chủng vi khuẩn cố định nitơ từ giống phịng Vi sinh vật mơi trƣờng - Nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng (nguồn cacbon, nồng độ cacbon, nguồn nitơ nồng độ CaCO3) lên khả sinh trƣởng hoạt tính cố định nitơ chủng vi khuẩn cố định nitơ tuyển chọn - Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy nhƣ nhiệt độ, pH, độ cấp khí lên khả sinh trƣởng hoạt tính cố định nitơ chủng vi khuẩn cố định nitơ tuyển chọn - Tiến hành thử nghiệm trồng phịng thí nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài: - Ý nghĩa khoa học: + Giúp học viên củng cố hệ thống lại kiến thức học nghiên cứu khoa học + Biết đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý phân tích số liệu, cách trình bày báo cáo khoa học - Ý nghĩa thực tiễn: + Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn cố định nitơ có hoạt tính cố định nitơ cao để sản xuất phân hữu vi sinh + Từ kết ban đầu đề tài tạo tiền đề cho nghiên cứu khoa học Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng vi khuẩn cố định nitơ tự Cố định nitrogen – khả đồng hóa nitơ phân tử số vi sinh vật dùng nitrogen để cấu tạo lên tất hợp chất chứa nitrogen tế bào Khả có nhiều vi sinh vật sống tự đất nƣớc: loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn dinh dƣỡng quang năng, vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn khử sulfat, số Mycobabacterium, Proactinomyces, Actinomyces nấm, tảo lam (vi khuẩn lam – ND) v.v Ngoài khả cố định nitơ vi khuẩn nốt sần (giống Rhizobium) sống cộng sinh rễ họ đậu có ý nghĩa quan trọng việc làm giàu nitơ cho đất Ngồi vi khuẩn nốt sần lồi giống Azotobacter Clostridium có khả cố định nitơ tự do.[2][3] 1.1.1 Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter) Các lồi Azotobacter thuộc lồi vi sinh vật cố định nitơ hoạt động Trong số lồi Azotobacter đƣợc miêu tả lồi đƣợc nghiên cứu nhiều Az chroococcum, Az agilis Az vinelandii Az chroococcum loài chủ yếu đất đồng cỏ Trong ao hồ thƣờng gặp Az agilis Các lồi nói khác đặc điểm sinh trƣởng mơi trƣờng đặc, kích thƣớc, hình thái tế bào số đặc điểm sinh lý học Az chroococcum tạo khuẩn lạc nhầy, lồi lan, lúc đầu khơng màu, sau biến thành màu nâu tối, trí đến đen nhƣng khơng làm nhuộm màu môi trƣờng khuẩn lạc Đặc điểm Az vinelandii Az agilis có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng – lục lam – lục, sắc tố khuếch tán vào môi trƣờng [9][10], [12] Khi cịn non tế bào Azotobacter có khả di động, hình que đầu trịn, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, đồng chất, tế bào chất nhuộm màu Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ đồng Chiều dài tế bào thay đổi từ – μm đến - 6μm Các tế bào Az agilis có kích thƣớc lớn (5-6μm) Dần tế bào hình que chuyển thành hình cầu hay hình bầu dục lớn với đƣờng kính lên tới 4μm, hình dạng khơng cố định Khi có tiêm mao rụng tế bào trở lên bất động, bọc bao nhầy, tế bào chất xuất cấu tạo dạng hạt, tế bào trịn phủ lớp vỏ dày chuyển thành kén Hình dạng tế bào Azotobacter chu kì biến đổi chúng phụ thuộc vào tuổi giống điều kiện phát triển.[25] Hình1.1 Azotobacter Tất lồi Azotobacter sống dị dƣỡng Để dùng nguồn cacbon, chúng sử dụng nhiều nguồn hữu khác – monosaccarit, disaccarit, số polysaccarit nhiều rƣợu, axit hữu bao gồm hợp chất thơm Nguồn nitơ Azotobacter khơng nitơ phân tử mà cịn muối ammon, nitrat, nitrit, aminoaxit Tùy thuộc vào hợp chất chứa nitơ có mơi trƣờng mà q trình cố định nitơ môi trƣờng bị ức chế nhiều hay Azotobacter có nhu cầu lớn photpho canxi Để cố định nitơ phân tử cách mạnh mẽ chúng cần có molybden bor Azotobacter nhận đƣợc lƣợng từ q trình oxy hóa hợp chất hữu thành CO2 H2O Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Phần lớn Azotobacter phát triển pH lớn khơng gặp chúng đất chua Đặc trƣng đất chua lồi Az indicum Chúng phát triển mơi trƣờng có pH Azotobacter cần có độ ẩm cao so với nhiều vi khuẩn khác, gặp chúng vùng khơ hạn Phần lớn chủng Azotobacter phân lập đƣợc từ thiên nhiên có khả cố định đƣợc 10mg N2 tiêu thụ hết 1g hợp chất cacbon Một số chủng Azotobacter điều kiện thích hợp có khả đồng hoá đƣợc đến 300 mg N2/1g hợp chất cacbon Nhiều nghiên cứu cho biết phát triển chung với số vi khuẩn khác Azotobacter có hoạt động cố định nitơ cao so với nuôi cấy riêng rẽ Azotobacter đem phần nitơ đồng hoá đƣợc đƣa vào môi trƣờng dƣới dạng NH4+, axit amin protein Sự phát triển cố định nitơ Azotobacter đất chịu ảnh hƣởng mật thiết khu hệ vi sinh vật đất Bên cạnh nhóm vi sinh vật có ảnh hƣởng tốt phát triển Azotobacter (tổng hợp chất hoạt động sinh học, phân giải thức ăn hữu bền vững) cịn có nhiều nhóm vi sinh vật có khả làm ức chế phát triển Azotobacter (cạnh tranh thức ăn, sản sinh chất kháng sinh,…) Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ Azotobacter trồng Azotobacter thƣờng xuyên có mặt vùng rễ trồng với số lƣợng cao nhiều so với vùng rễ Số lƣợng chúng biến đổi phụ thuộc vào loại cây, giai đoạn phát triển nhiều yếu tố sinh thái, địa lý khác Ngƣời ta chứng minh đƣợc Azotobacter không phát triển bề mặt rễ mà phát triển đất xung quanh rễ Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Azotobacter có tác dụng làm tăng nguồn thức ăn nitơ cho trồng Trung bình tiêu thụ hết 1g chất sinh lƣợng, Azotobacter có khả đồng hố đƣợc khoảng 10-15 mg nitơ phân tử Phân bón vi sinh vật Azotobacter đƣợc coi phân bón vi sinh vật đƣợc ứng dụng sớm Sau trình nghiên cứu, nhà khoa học khám phá Azotobacter khơng có khả cố định nitơ mà cịn có khả sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trƣởng thực vật, số vitamin hoạt chất ức chế sinh trƣởng số vi nấm gây bệnh vùng rễ số trồng Sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ tự từ chủng vi khuẩn Azotobacter đƣợc sản xuất Mỹ, Úc Nga đƣợc sử dụng nhiều nơi giới mang lại hiệu kinh tế xã hội tƣơng đối cao Ở Việt Nam, sản phẩm phân bón vi sinh vật chứa vi khuẩn cố định nitơ tự (Azotobacter) đƣợc khảo nghiệm hiệu lực trồng đồng ruộng đƣợc đƣa vào danh mục loại phân bón đƣợc phép sử dụng Việt Nam [26] 1.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ kỵ khí Clostridium Nhiều loại thuộc giống Clostridium có khả cố định nitơ khơng khí: Cl Pastuerianum, Cl Butỷium, Cl Acetobutylicum, Cl Felsineum Chúng thuộc nhóm phân loại, nhƣng khác đặc điểm hình thái học sinh lý sinh hóa học Cl Pasteurianum có khả đồng hóa nitơ phân tử mạnh mẽ Tế bào loại trực khuẩn lớn, dài 1,5 - 8μm rộng 0,8 – 1,3μm [7, 8] Đây nhóm dị dƣỡng hóa hữu cơ, nguồn hữu chúng sử dụng: monosaccarit, disaccarit, số polysaccarit nhiều rƣợu, axit hữu bao gồm hợp chất thơm Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium Trong hệ thống cố định nitơ sinh học, cố định nitơ cộng sinh vi khuẩn nốt sần (Rhizobium) họ đậu quan trọng nhất, ƣớc tính đạt 80 triệu năm, tƣơng đƣơng với lƣợng phân đạm vơ tồn giới sản xuất năm 1990 Trong hệ thống cố định nitơ sinh học này, nốt sần nhà máy phân đạm mini, chủ vừa chỗ trú ngụ đồng thời nguồn cung cấp lƣợng cho trình cố định nitơ vi khuẩn nhận lại lƣợng đạm từ trình cố định nitơ để cung cấp cho trình tổng hợp đạm thân, lá, hoa quả.[3] Vi khuẩn Rhizobium tồn đất, xâm nhập vào lơng hút rễ đậu kích tác tạo thành nốt sần nên đƣợc gọi vi khuẩn nốt sần Giữa đậu vi khuẩn nốt sần hình thành mối quan hệ cộng sinh nghĩa quan hệ mà hai bên cần có dựa vào để phát triển, vi khuẩn nốt sần tổng hợp đạm từ nitơ khơng khí cung cấp cho ngƣợc lại trồng cung cấp dƣỡng chất cần thiết để vi khuẩn nốt sần tồn sinh trƣởng.[5] Hình dáng, kích thƣớc, màu sắc vị trí nốt sần khác nhau, phản ánh tình trạng liên kết vi khuẩn nốt sần hiệu cố định nitơ Căn vào hiệu cố định nitơ, hai loại nốt sần đƣợc phân biệt, nốt sần hữu hiệu nốt sần vơ hiệu Dựa vào số lƣợng, kích thƣớc màu sắc thịt nốt sần, đánh giá đƣợc hiệu trình cố định nitơ lạc chủng vi khuẩn tƣơng ứng Rễ có mật độ nốt sần hữu hiệu cao, chứng tỏ việc sử dụng phân vi khuẩn nốt sần mang lại hiệu tốt Số lƣợng khối lƣợng nốt sần đƣợc kiểm tra tốt vào thời kì hoa rộ Để đánh giá tác dụng biện pháp nhiễm vi khuẩn nốt sần khả nhiễm vi khuẩn đƣợc bón, cần kiểm tra nốt sần thời kỳ 4-5 tuần tuổi Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Vi khuẩn Rhizobium loại trực khuẩn gram âm không sinh nha bào, hiếu khí Kích thƣớc tế bào dao động 0,5-1,2.2,0-3,5, khuẩn lạc thuộc nhóm S, nhày lồi, màu trắng trắng đục, kích thƣớc khuẩn lạc dao động 2,3-4,5mm sau tuần ni mơi trƣờng thạch Vi khuẩn Rhizobium có tiên mao, có khả di động đƣợc, chúng thích hợp pH từ 6,5-7,5, nhiệt độ 25-28oC, độ ẩm 50-70% Khi già có số loại tạo đƣợc nang xác, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu nhạt Vi khuẩn Rhizobium gồm nhiều loài khác nhau: Rh.leguminosarum, Rh.phaseoli, Rh.trifolii, Rh.japonicum, Rh.meliloti, Rh.cicer, Rh.simplese, Rh.vigna, Rh.robinii, Rh.lotus,… 1.2 Quá trình cố định nitơ sinh học Nitơ nguyên tố trơ khó liên kết hóa học với nguyên tố khác, khơng có chất xúc tác điều kiện đặc biệt khác, khơng ngừng bị chuyển hóa chu trình khép kín tác động sinh học hay hóa học khác Dƣới tác động hoạt động hóa học sinh học, nitơ phân tử chuyển thành đạm vô cơ, sau chuyển thành đạm thực vật động vật thơng qua q trình chuyển hóa Một phần đạm thực vật dƣới dạng tàn dƣ phần đƣợc trồng sử dụng, phần lại bị rửa trôi bay hoạt động vi sinh vật đất có khả phân giải đạm Quá trình đạm chịu ảnh hƣởng lớn chế độ canh tác Nitơ đồng thời yếu tố dinh dƣỡng vô quan trọng không với sinh vật bậc cao mà với sinh vật nhỏ bé mà mắt thƣờng khơng nhìn thấy đƣợc Trong tự nhiên nitơ phân tử tồn dƣới dạng khí chiếm 78% thể tích khơng khí[17], song chất nitơ lại sử dụng đƣợc làm nguồn dinh dƣỡng cho sinh vật Để trồng sử dụng nguồn tài nguyên làm chất dinh dƣỡng, nitơ khơng khí phải đƣợc chuyển hóa thơng qua q trình cố định nitơ (cố định đạm), nitơ phân tử đƣợc chuyển hóa thành amơni Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 54 khả phát triển sinh sản Nhiều trƣờng hợp vi sinh vật bị chết Khả gây chết chúng từ từ không xảy đột ngột nhƣ nhiệt độ cao Dựa vào đặc tính mà ngƣời ta tiến hành cất giữ thực phẩm nhiệt độ thấp, bảo quản giống vi sinh vật nhiệt độ thấp Đối với nhiệt độ cao Nhiệt độ cao thƣờng gây chết vi sinh vật cách nhanh chóng Đa số tế bào sinh dƣỡng vi sinh vật bị chết 60 800C Một số khác chết nhiệt độ cao Đặc biệt bào tử có khả tồn nhiệt độ > 1000C Nhiệt độ cao thƣờng gây biến tính protit, làm hệ enzym không hoạt động đƣợc, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt Do tầm quan trọng nhiệt độ nên chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định ảnh hƣởng nhiệt độ lên khả sinh trƣởng sinh hoạt tính cố định nitơ chủng vi khuẩn TN2 Kết thu đƣợc đƣợc trình bày hình 3.11 1.00E+10 Mật độ (CFU/ml) 1.00E+09 1.00E+08 1.00E+07 1.00E+06 1.00E+05 1.00E+04 1.00E+03 24 48 72 Thơì gian (h) 25 30 35 40 Hình 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên sinh trƣởng chủng TN2 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 55 Kết hình 3.11 cho thấy, thay đổi nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hƣởng mạnh đến khả sinh trƣởng chủng TN2 Khi nhiệt độ thấp hay cao 30oC làm giảm khả sinh trƣởng chủng TN2 -Ở 250C mật độ tế bào đạt cực đại 108CFU/ml sau 48h nuôi cấy -Ở 300C cho mật độ tế bào đạt cực đại xấp xỉ 1010CFU/ml cao trong nhiệt độ nuôi cấy -Khi nhiệt độ nuôi cấy 350C mật độ vi sinh vật đạt cực đại ≤ 108CFU/ml, giảm khoảng 100 lần so với 300C -Khi nhiệt độ nuôi cấy lên tới 400C mật độ tế bào vi sinh vật đạt cực đại ≤ 107CFU/ml giảm khoảng 1000 lần so với 300C Qua cho thấy, chủng TN2 sinh trƣởng tốt khoảng nhiệt độ 25 – 350C , nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu 300C Kết đánh giá ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính cố định ni tơ chủng chủng TN2 đƣợc trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 Hàm lƣợng NH+4 dịch nuôi cấy, mg/l Thời gian nuôi cấy (h) 250C 300C 350C 400C 24 1,23 1,65 0,87 0,43 48 1,98 2,86 1,56 0,89 72 1,72 2,49 1,09 0,69 Kết bảng 3.10 cho thấy, khả cố định nitơ tự chủng TN2 tốt nhiệt độ nuôi cấy 300C Khi nuôi cấy nhiệt độ 250C chủng TN2 cố định nitơ tốt Nhƣng nhiệt độ ni cấy > 30300C Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 56 khả cố định ni tơ tự chủng giảm từ 2-3 lần kết cho thấy chủng TN2 vi khuẩn ƣa ấm nhiệt độ sinh trƣởng khả cố định nitơ tốt 300C 3.3 Thử nghiệm trồng phịng thí nghiệm Sau nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện ni cấy lên sinh trƣởng nhƣ hoạt tính cố định nitơ chủng TN2, tiến hành nuôi cấy để thu nhận sinh khối chủng TN2 để thí nghiệm đánh giá tác động trồng quy mơ phịng thí nghiệm mồng tơi Kết thí nghiệm đƣợc thể thơng qua hàm lƣợng nitơ đất đƣợc thể hình 3.12 0.5 0.93 1.12 0.34 1.07 1.5 1.53 1.62 0.68 Nitơ dễ tiêu đất (mg/l) 2.5 2.08 2.32 2.64 Dc tn1 tn2 ngày tn3 tn4 ngày25 Hình 3.12 Ảnh hƣởng chủng TN2 đến hàm lƣợng nitơ đất đất Kết hàm lƣợng NH+4 đất hình 3.13 cho thấy: ngày đầu tiên, hàm lƣợng NH+4 đất thí nghiệm có bổ sung dịch ni cấy chủng TN2 thí nghiệm cao so với mẫu ĐC, dịch nuôi cấy chủng TN2 có chứa hàm lƣợng nitơ vi khuẩn cố định Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 57 trình ni Tuy nhiên, sau 25 ngày thí nghiệm, hàm lƣợng nitơ đất mẫu thí nghiệm lại có biến động khác Ở mẫu ĐC, TN3 TN4 hàm lƣợng nitơ đất sau 25 ngày thí nghiệm giảm so với ngày đầu tiên: mẫu ĐC giảm 50%, mẫu TN3 giảm 46%, TN4 giảm 64,7% Trong mẫu TN1 TN2 hàm lƣợng nitơ đất sau 25 ngày thí nghiệm lại cao so với ngày đầu: TN1 tăng 33,9%, TN2 tăng 34,1% Qua cho thấy hàm lƣợng nitơ mẫu đất thí nghiệm biến động khác Tuy nhiên, dựa vào kết hàm lƣợng nitơ đất chƣa nói lên đƣợc hiệu chủng TN2 đất trồng Do vậy, cần phải đánh giá sinh trƣởng mồng tơi qua strinhf thí nghiệm Kết đánh giá tỷ lệ sống sót, chiều cao lƣợng mồng tơi đƣợc trình bày bảng 3.11 hình 3.13 Bảng 3.11 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn TN2 cố định nitơ lên sinh trưởng mồng tơi Chiều cao Trọng lƣợng Tỉ lệ sống sót, (cm/cây) (g/cây) % ĐC 3,14 2,34 30 TN1 4,08 3,01 47 TN2 4,91 3,94 43 TN3 3,9 3,06 53 TN4 3,66 3,12 37 Mẫu Thí nghiệm Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 58 4.91 60.00% 53.00% 50.00% 3.94 40.00% 37.00% 3.06 3.12 30.00% 2.34 3.01 3.66 43.00% 30.00% Tỷ lệ sống sót 47.00% 3.9 4.08 3.14 Chiều cao, trọng lượng TB (cm, g) 20.00% 10.00% 0.00% DC TN1 Chiều cao TN2 Trọng lượng TN3 TN4 Tỉ lệ sống Hình 3.13 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn TN2 cố định nitơ lên sinh trƣởng mồng tơi Kết bảng 3.11 hình 3.13 cho thấy, chiều cao, trọng lƣợng tỉ lệ sống sót mồng tơi sau 25 ngày thí nghiệm cho thấy tiêu mẫu ĐC thấp so với mẫu TN Về tỷ lệ sống sót mẫu thí nghiệm TN1 TN3 có tỷ lệ sống sót cao TN2 TN4 Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót lại không tỷ lệ thuận tỷ lệ nghịch với lƣợng dịch nuôi cấy chủng TN2 bổ sung vào đất Điều cho thấy tỷ lệ sống sót khơng phụ thuộc vào tỷ lệ dịch nuôi cấy bổ sung mà phụ thuộc nhiều vào chất lƣợng giống ban đầu Đối với hai tiêu chiều cao trọng lƣợng cho kết tƣơng đƣơng TN1, TN3, TN4 TN2 cho kết cao đạt 4,91cm/cây 3,94g/cây Có thể giải thích điều nhƣ sau: TN3, TN4 lƣợng dịch ban đầu bổ sung cao (15% 20%) nên hàm lƣợng NH+4 ban đầu đất cao Tức hàm lƣợng NH4+ đất cao gây ức chế hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 Điều phù hợp với nghiên cứu tác giả George J Sorger Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 59 (1968), môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung NH4Cl hoạt tính nitrogennase Azotobacter giảm Theo thời gian lƣợng NH+4trong đất giảm trồng sử dụng với ức chế hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 từ đầu dẫn đến giảm lƣợng nitơ bổ sung vào đất nên hàm lƣợng nitơ giảm mạnh sau 25 ngày thí nghiệm Cùng với lƣợng NH+4 giảm mạnh chiều cao trọng lƣợng TN3 TN4 giảm so với TN2 lƣợng nitơ không cung cấp đủ cho q trình sinh trƣởng Cịn TN1 lƣợng dịch bổ sung thấp 5% nên hàm lƣợng nitơ đƣợc tạo không đủ để đáp ứng cho sinh trƣởng trồng Kết rằng, TN2 với lƣợng dịch bổ sung 10% có khả kích sinh trƣởng tốt Từ kết cho thấy, bổ sung dịch nuôi cấy chủng TN2 với tỷ lệ 5, 10, 15 20% vào đất trồng có khả kích thích sinh trƣởng trồng tỷ lệ thích hợp cho sinh trƣởng trồng 10% (TN2) Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 60 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu rút số kết luận nhƣ sau: Đã đánh giá khả cố định nitơ 19 chủng vi khuẩn giống phòng Vi sinh vật môi trƣờng tuyển chọn đƣợc chủng TN2 có hoạt tính cố định nitơ cao (hàm lƣợng NH4+ dịch nuôi cấy đạt 2.44mg/l) Đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn TN2 cho thấy chủng vi khuẩn vi khuẩn gram am, thuộc chi Azotobacter Đã lựa chọn lựa đƣợc nguồn dinh dƣỡng tỷ lệ thích hợp cho mơi trƣờng ni cấy chủng vi khuẩn TN2 là: lactoza 2%; (NH4)2SO4 0,1%; CaCO3 0,5% Chủng vi khuẩn TN2 sinh trƣởng cố định nitơ tự tốt điều kiện ni cấy: thể tích dịch ni cấy bình nón 2/10V nhiệt độ nuôi 300C độ pH Khi nuôi cấy chủng TN2 mơi trƣờng có thành phần dinh dƣỡng điều kiện ni cấy nhƣ trên, mật độ tế bào đạt ≥ 1010CFU/ml hàm lƣợng NH4+ dịch nuôi cấy 2.79mg/l sau 48 h Kết thử nghiệm bƣớc đầu cho thấy, bổ sung dịch nuôi cấy chủng TN2 vào đất trồng mồng tơi có tác dụng cải thiện suất trồng cải thiện hàm lƣợng nitơ tự đất Tỷ lệ dịch bổ sung vào đất thích hợp cho phát triển mồng tơi 10% Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 61 KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu đạt đƣợc, đƣa số kiến nghị nhƣ sau: - Cần tiếp tục nghiên cứu hồn thiện qui trình tạo chế phẩm vi sinh từ chủng TN2 để sản xuất ứng dụng vào thực tiến - Cần tiếp tục thử nghiệm đánh giá hiệu cố định ni tơ tự chủng TN2 lên số trồng khác -Cần tính tốn chi phí, hiệu chế phẩm phân bón vi sinh so với sản phẩm loại thị trƣờng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1.Kiều Hữu Ảnh, Giáo trình Vi sinh vật học 1, NXB Khoa học kỹ Thuật, 2006 2.Lê Duy Hoàng Chƣơng (2008) Phân lập định danh vi khuẩn cố định nitơ họ đậu Luận văn tốt nghiệp Đại học, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục, 2000 4.Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Nhƣ Thành, Dƣơng Đức Tiến( 2004) Vi sinh vật học nông nghiệp Nhà xuất Đại học Sƣ Phạm, trang 179-185 Trần Cẩm Vân „ Giáo trình vi sinh vật đất‟ trƣờng đại học tổng hợp Hà Nội 6.Trần Tú Thuỷ, Vũ Thuý Nga, Phạm Văn Toản, Nguyễn Ngọc Quyên, Lê Văn Nhƣợng, Nguyễn Lan Hƣơng(2005) Sử dụng vi sinh vật cố định đạm phân giải lân để sản xuất phân hữu Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam, Viện công nghệ sinh học-CNTP, Đại học Bách Khoa Hà Nội Tài liệu tiếng anh Anton Hartmann and Jose Ivo Baldani( 2006) The genus Azospirillum, Prokaryote pp 115-140 B-R Chandrasekar, G Ambrose and N.Jayabalan( 2005) Influence of biofertillizers and nitrogen source level on the growth and yield of Echoniochloa frumentacea (roxb) Link, Journal of Agricultural Technology Vol 1, No Pp.223-234 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 63 Dan H Jone(1920) Furth studies on the growth cycle of Azotobacter Journal of Bacteriology Vol 5, No $ Pp 325-341 10.Dhamangaonkar Sachin N(2009) Effect of Azobacter chroococcum (PGPR) on the growth of Bamboo (Bambusa bamboo) and Maise (Zea mays) plants Biofrontier Vol 1.Issue 1.pp 24-31 11 Don J Brenner, Noel R Krieg James T Staley(2005) Bergey‟s Manual of Systematic Bacteriology Springe Second edition, Vol.2 Part B.pp 384401 12 G.V Mali and M.G Bodhankar (2009) Antifungal and phytohormone production potential of Azotobacter chroococcum isolates from Groundnut ( Arachis hypogeal L.) Asian J.exp Sci Vol.23.No 1.pp.293-297 13.I.K Kurdish Z.T Bega, A.S Gordienko and D.I.Dyrenko(2008) The effect of Azotobacter vinelandii on plant seed germination and adlhesion of these bacteria to Cucumber roots Applied Biochemistry and Microbiology Vol 45 No.1.pp.400-404 14 Ridvan Kizilaya (2009) Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp Strains isolated from soils in different ecosystems and relationship between them anh the microbiologial proprrties of soils Journal of Enviromental Biology Vol 30 No 1.pp 73-82 15 Suliasih, Sri Widawati (2005) Isolate and identification of Phosphate solubilizing and Nitrogen fixing bacteria from soil in Wamena biological, Garden, Jayawijaya, Papua Biodiversitas Vol.60.No 5.pp.175-177 16 Winogradsky S (1938) Surla morphologie et l‟oecologie des Azotobacter Ann Inst Pasteur Vol 60.pp 351-400 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 64 17 Zahera Abbass and Yaacov Okon(1993) Plant growtn promotion by Azotobacter paspali in the rhizosphere Oil Boil Boichem Vol 25,No.8.pp 1075-1083 Tài liệu internet 18.http://www.cuctrongtrot.gov.vn/ctt/chuyentrang/default.aspx?type=tin&id =8851 19 http://diendan.tuvantuyensinh.vn/viewtopic.php?f=27&t=439 20 http://diendan.tuvantuyensinh.vn/viewtopic.php?f=27&t=439 21 http://vi.wikipedia.org/wiki/7_(s%E1%BB%91) 22 http://tinphanbon.com/cac-loai-phan-bon/phan-bon-vi-sinh.html 23 http://vi.scribd.com/doc/68949131/TCVN-Phanbon 24.http://luanvan.co/luan-van/tim-hieu-phan-bon-vi-sinh-15/ 25 thuvienso.khcnbackan.gov.vn/chitietPhannganh/tabid/ /Default.aspx 26 http://www.humixvn.com/fertilizer/?id=292 27 http://hhchusepepper.com/index.php?home=content&iddv=22 28.http://www.sinhk33.com/2013/01/cac-nhom-visinh-vat-tong-hopdam.html 29.http://www.vinachem.com.vn/PortletBlank.aspx/5D5EA4308B2D411781 E156089616C5A4/View/So-3-2007/2399/?print=25368410 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 65 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đại cƣơng vi khuẩn cố định nitơ tự 1.1.1 Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter) 1.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ kỵ khí Clostridium 1.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium 1.2 Quá trình cố định nitơ sinh học 1.3 Đại cƣơng phân bón vi sinh 1.3.1 Giới thiệu chung phân bón vi sinh vật 1.3.2 Lịch sử phát triển phân bón vi sinh 12 1.3.3 Các loại phân bón vi sinh [25] 13 1.3.4 Một số điểm cần ý sử dụng phân vi sinh vật [27] 18 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu nghiên cứu .22 2.3 Môi trƣờng sử dụng .22 2.4 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 22 2.5 Địa điểm thời gian nghiên cứu .23 2.5.1 Địa điểm nghiên cứu 23 2.5.2 Thời gian nghiên cứu .23 2.6 Phƣơng pháp phân tích 23 2.6.1 Phƣơng pháp xác định mật độ vi sinh vật 23 2.6.2 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý .24 2.6.3 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 24 2.6.4 Phƣơng pháp chuẩn bị chủng giống .25 2.6.5 Phƣơng pháp xác định nitơ dễ tiêu 25 2.7 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.7.1 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng 26 2.7.2 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy 27 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 66 2.8 Thử nghiệm trồng phịng thí nghiệm 28 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định nitơ tự 29 3.1.1 Một số đặc điểm chủng vi khuẩn cố định nitơ tự 29 3.1.2 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cố định nitơ cao 31 3.1.3 Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn TN2 .33 3.1.4 Đặc điểm sinh hóa 35 3.2 Ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng nuôi cấy điều kiện nuôi cấy .36 3.2.1 Ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng 36 3.2.2 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy 48 3.3 Thử nghiệm trồng phịng thí nghiệm 56 KẾT LUẬN .60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .62 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 67 DANH MỤC HÌNH Hình1.1 Azotobacter Hình 3.2 Ảnh nhuộn gram tế bào chủng vi khuẩn TN2 33 Hình 3.3 Một số hình ảnh phản ứng sinh hóa chủng TN2 36 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nguồn cacbon lên sinh trƣởng chủng TN2 .38 Hình 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ lactoza lên sinh trƣởng chủng TN2 41 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nguồn nitơ lên sinh trƣởng chủng TN2 44 Hình 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 .45 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ CaCO3 lên sinh trƣởng chủng TN2 46 Hình 3.9 Ảnh hƣởng độ pH lên sinh trƣởng chủng TN2 49 Hình 3.10 Ảnh hƣởng độ cấp khí lên sinh trƣởng chủng TN2 51 Hình 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên sinh trƣởng chủng TN2 .54 Hình 3.12 Ảnh hƣởng chủng TN2 đến hàm lƣợng nitơ đất đất 56 Hình 3.13 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn TN2 cố định nitơ lên sinh trƣởng mồng tơi 58 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 68 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh mục số giống vi sinh vật đƣợc sử dụng sản xuất phân bón vi sinh vật Việt Nam [24][29] 11 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn cố định nitơ tự 29 Bảng 3.2 Kết hoạt tính cố định nitơ chủng vi khuẩn 32 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn TN2 34 Bảng 3.4 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn TN2 35 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 39 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactoza đến hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 42 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nguồn CaCO3 đến hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 47 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng độ pH đến hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 50 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng độ cấp khí lên hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 .52 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính cố định nitơ chủng TN2 55 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng chủng vi khuẩn TN2 cố định nitơ lên sinh trƣởng mồng tơi 57 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ... HỌC KHOA HỌC Ngô Thị Hà NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201... “ Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng vi khuẩn cố định nitơ tự phục vụ cho sản xuất chế phẩm vi sinh? ?? Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Nội dung nghiên cứu: ... định nitơ chủng vi khuẩn cố định nitơ tuyển chọn - Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy nhƣ nhiệt độ, pH, độ cấp khí lên khả sinh trƣởng hoạt tính cố định nitơ chủng vi khuẩn cố định nitơ