Biểu hiện, tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố seb trong thực phẩm và môi trường

77 268 0
  • Loading ...
1/77 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 18/11/2014, 22:35

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN BÍCH LOAN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN BÍCH LOAN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGHIÊM NGỌC MINH Thái Nguyên - 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng sự nghiên cứu phòng Công nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 06 năm 2012 tới tháng 06 năm 2013. Tác giả Nguyễn Bích Loan Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa chất thiết bị trong suốt thời gian thực hiện luận văn tại phòng. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới KS. Nguyễn Thị Hoài Thu và các anh chị, cán bộ phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo trong nhà trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; các thầy cô Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 Học viên Nguyễn Bích Loan Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm 3 1.1.1. Tình hình nhiễm độc thực phẩm chung 3 1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố ruột Staphylococal enterotoxin B trên thế giới và Việt Nam 5 1.2. Một vài nét về tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 8 1.2.1. Đặc điểm hình thái 8 1.2.2. Đặc điểm phân loại 9 1.2.3. Tính chất và phân bố 11 1.2.4. Đặc điểm hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 12 1.2.5. Độc tố và khả năng gây bệnh 12 1.3. Nội độc tố ruột Staphyloccoccal enterotoxin B 16 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc 16 1.3.2. Cơ chế gây bệnh 18 1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng . 19 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 22 2.1.1. Đối tượng thí nghiệm 22 2.1.2. Chủng vi khuẩn và plasmid 22 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 2.1.3. Các bộ kit 22 2.1.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị 22 2.1.5. Môi trường và đệm 23 2.1.6. Phần mềm 23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 23 2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu 24 2.2.2.1. Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli BL21(DE3) 24 2.2.2.2. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) 25 2.2.2.3 Phương pháp xử lý enzym hạn chế 26 2.2.2.4. Biểu hiện protein Staphyloccoccal enterotoxin B trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) 27 2.2.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 28 2.2.2.6. Phương pháp sạc cột Ni - NTA 31 2.2.2.7. Phương pháp tinh sạch protein 32 2.2.2.8. Định lượng protein theo phương pháp Bradford 33 2.2.2.9. Phương pháp kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến 35 2.2.2.10. Phương pháp gây miễn dịch trên chuột 38 2.2.2.11. Phương pháp Western blot 39 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho protein tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B 41 3.1.1. Biến nạ pET21a+ mang gen seb vào chủng E. coli 41 3.1.2. Nghiên cứu biểu hiện gen seb với các điều kiện tối ưu 44 3.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp 46 3.3. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford 48 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 3.4. Kiểm tra độc tính của protein 50 3.4.1. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến (SEB2) ở liều tiêm 1xLD50 51 3.4.2. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến (SEB2) ở liều tiêm 3xLD50 và 10xLD50 51 3.5.Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng nguyên Staphylococcal enterotoxin B 54 3.5.1.Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C 54 3.5.2.Kết quả kiểm tra khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng nguyên 54 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Tài liệu Tiếng Việt 60 Tài liệu Tiếng Anh 61 Tài liệu internet 65 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg Microgram µl Microlit APS Ammonium persulphate ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm Bp Base pair BSA Bovine serum albumin Cs Cộng sự dH 2 O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Epp Eppendorf HRP Horseradish peroxidase IPTG Isopropyl- -D-thiogalactoside kDa Kilodalton Kb Kilobase LB Luria and Bertani Mg Miligam Ml Mililít MRSA Methicilline-resistant Staphylococcus aureus Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii NBB Native Binding buffer Ng Nanogram Nm Nanomet PBS Phosphate buffer saline S. aureus Staphylococcus aureus SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis SE Staphylococcal enterotoxin SEB Staphylococcal enterotoxin B TB Trung bình TBS Tris Bloting solution TTBS Tris Tween Blotting solution v/p vòng / phút Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Phân loại khoa học Staphylococcus aureus 10 2.1 Công thức pha gel tách (12%) 30 2.2 Công thức pha gel cô (5%) 30 2.3 Pha Nồng độ pha dung dịch BSA 34 2.4 Kí hiệu tên các eppendorf ở các nồng độ 35 3.1 Kết quả đo độ hấp thụ BSA ở bước sóng 595 nm 50 3.2 Nồng độ protein SEB sau tinh sạch 51 3.3 So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều 1xLD50 52 3.4 So sánh số chuột chết sau tiêm SEB1 và SEB2 ở liều 3xLD50 và 10xLD50 53 [...]... enterotoxin < /b> B (SEB) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố SEB trong thực phẩm và môi trường Mục tiêu nghiên cứu: Tạo được kháng < /b> nguyên < /b> tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> Staphylococcal < /b> enterotoxin < /b> B (SEB) đặc hiệu làm nguyên < /b> liệu phục vụ cho việc tạo kháng < /b> thể đa và đơn dòng phục vụ chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố ruột SEB do vi khuẩn tụ cầu vàng (S aureus) gây ra trong thực phẩm và môi trường Nội dung nghiên cứu: - Biểu.< /b> .. nóng ẩm và tiết ra độc tố Enterotoxin < /b> Trong các loại độc tố của tụ cầu thì Enterotoxin < /b> B (SEB) là một độc tố mạnh, gây tử vong cao và lại b n với nhiệt và môi trường nên còn được tổ < /b> chức y tế thế giới (WHO) và CDC cảnh b o có thể là một trong những tác nhân b lợi dụng trong khủng b sinh học Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S aureus và độc tố SEB gây nhiễm trùng nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm. .. Staphylococcal < /b> enterotoxin < /b> B tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> và tiềm năng ứng dụng Công nghệ sinh học hiện đại có khả năng tạo ra các protein tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có y sinh học, chống khủng b sinh học và chiến tranh sinh học Biểu < /b> hiện gen seb thành protein tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> không độc phục vụ nghiên cứu tạo vaccine an toàn nhằm ngăn ngừa ngộ độc thực phẩm do SEB gây nên Năm 2002, Lee và cs đã nghiên cứu tạo. .. dụng và áp dụng ở nhiều nơi như b nh viện, nhà hàng, các vùng quê; phương pháp này đòi hỏi cần có kháng < /b> thể đặc hiệu Do vậy việc biểu < /b> hiện và tinh < /b> sạch < /b> kháng < /b> nguyên < /b> SEB tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> không có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các kháng < /b> thể IgG đặc hiệu là cấp thiết Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Biểu < /b> hiện, < /b> tinh < /b> sạch < /b> kháng < /b> nguyên < /b> tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> Staphylococcal < /b> enterotoxin.< /b> .. tới F [2] Ono và cs (2008), đã phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm trong những độc tố ruột do S aureus tạo ra [27] Trong số các dạng độc tố ruột do S aureus sinh ra thì các độc tố SEA, SEB, SEC, SED là những độc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm * Cơ chế gây b nh: B ớc quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây b nh và vật chủ là sự b m dính (adherence)... Lowell và cs cũng nghiên cứu thấy SEB qua xử lý với formalin sẽ trở nên mất độc và được gọi là giải độc tố B của tụ khuẩn Khi chuột dùng qua đường mũi vaccine proteosome SEB giải độc tố sẽ tạo ra được mức cao kháng < /b> thể IgG kháng < /b> lại SEB trong máu và kháng < /b> thể IgA kháng < /b> lại SEB ở niêm mạc đường hô hấp và ruột Vaccine proteosome SEB giải độc tố này cũng đã chứng tỏ hiệu quả b o vệ tối ưu với 100% số khỉ thực. .. việc khảo sát thực trạng nhiễm mầm b nh S aureus trong thực phẩm, việc chế tạo và ứng dụng các b kít phát hiện nhanh các mầm b nh chủ yếu gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm ở Việt Nam nói chung và mầm b nh S aureus nói riêng là vô cùng cần thiết Hiện nay trên thế giới và Việt Nam cũng đã phát triển một số phương pháp phát hiện độc tố SEB dựa trên nguyên < /b> tắc liên kết miễn dịch như: Số hóa b i trung tâm... nghiên cứu: - Biểu < /b> hiện gen seb đột biến - Tinh < /b> sạch < /b> protein tái < /b> tổ < /b> hợp < /b> SEB đột biến - Định lượng protein SEB đột biến theo phương pháp Bradford - Kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến - Gây miễn dịch thực nghiệm trên chuột - Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng < /b> nguyên < /b> SEB b ng kỹ thuật Western blot Số hóa b i trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU... nhiều công sức và thời gian dài Do đó, khi b nh nhân ăn phải thức ăn b nhiễm độc tố của tụ cầu như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp b i vì SEB là một siêu kháng < /b> nguyên < /b> có độc tính mạnh, tác động nhanh, có thể dẫn tới tử vong ở người Trong các vụ ngộ độc thức ăn tập thể, ngộ độc do độc tố ruột của tụ cầu S aureus (Enterotoxin)< /b> được cho là phổ biến nhất do tụ cầu phát triển nhanh trong môi trường thực phẩm ở điều... số độc tố của chúng b n với nhiệt và khó b phân hủy ở nhiệt độ cao, một trong số đó phải kể tới là độc tố ruột Staphylococcal < /b> enterotoxin < /b> B (SEB) b n với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus gây ra Hiện nay, việc phòng b nh và điều trị b nh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây b nh Đứng trước tình hình này, b n . Biểu hiện, tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố SEB trong thực phẩm và môi trường Mục tiêu nghiên cứu: Tạo được kháng. NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN B CH LOAN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB. kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) đặc hiệu làm nguyên liệu phục vụ cho việc tạo kháng thể đa và đơn dòng phục vụ chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố ruột SEB do vi
- Xem thêm -

Xem thêm: Biểu hiện, tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố seb trong thực phẩm và môi trường, Biểu hiện, tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố seb trong thực phẩm và môi trường, Biểu hiện, tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố seb trong thực phẩm và môi trường

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay