1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay đổi rất khác nhau ở các quần thể dân cư và các vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Nơi có tỷ lệ ung thư vòm cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen, trong khi ở châu Âu lại có tỷ lệ rất thấp. Các nước đông nam Á, trong đó có Việt nam có tỷ lệ UTVMH trung bình. Virut Epstein- Barr (EBV), các yếu tố môi trường khác và sự nhạy cảm di truyền đều cho là liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mũi họng và EBV là yếu tố được nghiên cứu nhiều nhất. EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không biệt hóa và duy trìcác thể nhiễm tiềm ẩn I và II, trong đó EBV biểu lộ các gen quan trọng là EBNA1, LMP1 và LMP2. EBNA1 giúp duy trì bộ gen EBV trong tế bào chủ, trong khi LMP1 lại là một gen có chức năng quan trọng liên quan đến dẫn truyền tín hiệu, chống lại sự chết theo chương trình của tế bào và có khả năng sinh ung thư cho các tế bào bị nhiễm. Các gen này nằm cách xa nhau trong bộ gen EBV và được biểu lộ bởi sự hoạt hóa các promoter khác nhau. EBNA1 được biểu lộ ở các thể nhiễm tiềm ẩn nhờ sự hoạt hóa các promoter: Cp, Wp và Qp. Tuy nhiên, trong ung thư vòm mũi họng hai promoter Cp và Wp không hoạt động mà chỉ có Qp điều hòa biểu lộ gen EBNA1. Methyl hóa ADN vùng promoter là một trong các yếu tố ngoại di truyền có vai trò rất quan trọng trong điều hòa biểu lộ genMức độ methyl hóa diễn ra ở các vị trí của đảo CpG tại vùng promoter và exon1 có vai trò trong điều hòa biểu lộ gen, có thể làm giảm biểu lộ hoặc không biểu lộ hoàn toàn một gen mà bình thường vẫn được biểu lộ. Việc xác định mức độ methyl hóa vùng promoter của một gen có ý nghĩa quan trọng trong tìm hiểu cơ chế bệnh sinh của bệnh liên quan đến chức năng gen đó trong nhiều quá trình bệnh lý ác tính , đồng thời dấu ấn này cũng có thể góp phần trong chẩn đoán sớm các bệnh ung thư. Ngoài ra, khi dùng các chất hóa học để làm mất methyl hóa thì có tác dụng làm gen hoạt động trở lại và thực hiện chức năng của chúng, giúp cho việc điều trị những rối loạn hay các bệnh lý khác nhau. 2 Hiện nay, nhờ những tiến bộ của sinh học phân tử người ta có thể xác định được mức độ methyl hóa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ bộ gen. Các kỹ thuật này dựa vào những nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất phức tạp, nhưng có những kỹ thuật đơn giản và thông dụng. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa sau khi xử lýADN bằng phương pháp bisulfite để xác định mức độ methyl hóa các promoter Wp, Cp và Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, đồng thời phát triển PCR đa mồi đối với các promoter đó. Việc phát triển PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa không chỉ giúp ích cho nghiên cứu ngoại di truyền ở mức độ ADN của EBV mà còn rất nhiều gen khác liên quan đến ung thư, đặc biệt là các gen ức chế ung thư. Đề tài này nhằm mục đích sau: 1. Phát triển phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa xác định mức độ methyl hóa ở các promoter Wp, Cp và Qp của EBV ở các tế bào dòng B95-8, Namalwa và Raji. 2. Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu này xác định mức độ methyl hóa 3 promoter điều hòa biểu lộ gen EBNA1 của EBV trong các mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.Tình hình ung thư vòm mũi họng trên thế giới và Việt Nam. Ung thư vòm mũi họng (UTVMH), một khối u phát triển từ các tế bào biểu mô nằm ở vị trí cửa mũi sau và vòm họng, là loại bệnh đứng hàng đầu trong số các ung thư vùng đầu mặt cổ với tính chất dịch tễ học khá đặc biệt là liên quan tới địa lý[3]. Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi trên thế giới có thể xếp thành 3 vùng rất khác nhau: Khu vực có tỷ lệ mắc cao nhất là miền Nam Trung Quốc và Grơnlen với tỷ lệ mới mắc từ 30 - 40/100.000 dân/năm . Ngược lại, vùng có tỷ lệ mắc thấp, gồm châu Âu, Mỹ chỉ từ 0,7 - 1/100.000 dân/ năm [4]. Còn lại là vùng có tỷ lệ mắc trung bình nhưng ngày càng có xu hướng tăng lên, đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee và đông nam Á với tỷ lệ từ 8 - 12/100.000 dân. Ở Việt nam UTVMH đứng hàng thứ 5 trong các ung thư nói chung và đứng hàng đầu trong các ung thư ở vùng đầu mặt cổ [1] 1.2. Những yếu tố nguy cơ liên quan đến UTVMH 1.2.1. Vai trò của virut Epstein-Barr . Virut Epstein-Barr (EBV), là một trong các yếu tố môi trường và được nghiên cứu nhiều nhất cho thấy có liên quan chặt chẽ của nó với UTVMH. Người ta phát hiện thấy EBV có mặt trong 100% các khối u vòm mũi họng thể ung thư biểu mô không biệt hóa (UCNT). Ngoài ra, các sản phẩm gen của EBV là EBER, EBNA1 và LMP-1,-2 đã được xác định ở hầu hết các mẫu sinh thiết UTVMH hoặc ở tổn thương quá sản tại biểu mô vòm họng gồm những dòng tế bào tiền ác tính nhiễm EBV. Điều này phù hợp với giả thuyết cho rằng EBV là một trong những yếu tố khởi phát trong cả quá trình nhiều bước dẫn đến sự phát triển của UTVMH [5] Ngoài việc phát hiện EBV và sản phẩm của nó trong khối u vòm họng, người ta cũng xác định được các kháng thể chống EBV trong huyết thanh bệnh nhân. Lượng kháng thể IgG và IgA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH cao hơn 8 - 10 lần so với những bệnh nhân ung thư đầu mặt cổ khác hoặc người khỏe về lâm sàng Đặc biệt IgA/VCA (kháng nguyên vỏ của EBV), một xét nghiệm sử dụng rộng rãi, thường qui ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam có giá trị để theo dõi và phát hiện nguy cơ mắc UTVMH, đồng thời cũng có giá trị là một dấu ấn quan trọng 4 theo dõi tái phát sau điều trị bệnh khi nó tăng cao [6,7]. Người ta cho rằng sự tái hoạt hóa, sao chép và nhân lên của EBV là hiện tượng xảy ra trong suốt quá trình phát triển của UTVMH và nó tương quan với nồng độ IgA/VCA. 1.2.2. Môi trường sống và thói quen sinh hoạt Nhiều tác giả đã đề cập đến môi trường sống như khí hậu, bụi, khói ô nhiễm liên quan đến UTVMH, nhưng được nói đến nhiều nhất là tập quán ăn uống. Nhiều nghiên cứu bệnh - chứng được tiến hành đã thu được những kết quả phù hợp với ý kiến cho rằng, tập quán ăn cá mối của người Trung Quốc (vùng Quảng Đông) là nguyên nhân quan trọng gây UTVMH, mối liên quan này lớn hơn nếu ăn cá muối ngay từ nhỏ. Dùng cá muối hàng ngày có thể làm tăng tỷ lệ UTVMH lên 1.8 đến 7.5 lần [8]. Sử dụng thuốc là cây cỏ cũng liên quan đến UTVMH thông qua hoạt hóa EBV hoặc trực tiếp thông qua ảnh hưởng đến tăng trưởng đến các tế bào chuyển dạng do EBV [9]. Các bằng chứng khác như hút thuốc lá hoặc dùng formadehyde có giá trị thấp trong bệnh sinh ung thư vòm họng. 1.2.3. Yếu tố di truyền Người ta thấy rằng người Trung Quốc sinh ra ở Bắc Mỹ có một tỷ lệ mắc thấp hơn so với những người sinh ra ở đất nước Trung Quốc, nhưng tỷ lệ mắc chuẩn vẫn cao hơn dân số nói chung . Điều đó cho thấy rằng yếu tố di truyền có vai trò trong bệnh sinh của UTVMH. Nghiên cứu ở Trung quốc chỉ ra rằng UTVMH có mối liên quan đến HLA-A2, B14 và B46[10]. Ở Việt Nam, các kháng nguyên A11, A2, B17 và liên kết mất cân bằng A2-B17, A11- B17 có liên quan đến UTVMH [2]. Việc xác định các gen khác liên quan với tính cảm thụ bệnh lý cũng đã được nghiên cứu: CYP 2E1 (chuyển hóa nitrosamine), glutathion transferase M1 . Cơ chế tác động của chúng cho đến nay vẫn chưa được rõ ràng, song điều hiện nay đã và đang được khẳng định là sự phát triển UTVMH là do sự phối hợp tác động của 3 yếu tố là môi trường sống, EBV và HLA 1.3. Virut Epstein-Barr 1.3.1. Sinh học của EBV Trên thực tế, hơn 90 % người trưởng thành trên thế giới nhiễm EBV và nó tồn tại lâu dài trong cơ thể nhiễm. Việc lây nhiễm EBV chủ yếu thông qua nước bọt và ở 5 lứa tuổi rất sớm của đời sống con người mà thường không có triệu chứng. Ngoài ra, EBV có thể được lây nhiễm qua máu, tổ chức và cũng có thể qua sữa của mẹ truyền sang con, thậm chí là thông qua quan hệ tình dục. EBV nhân lên trong tế bào biểu mô tuyến nước bọt, sau đó qua biểu mô vòm họng rồi xâp nhập vào tế bào lympho B qua thụ thể CD21 trên bề mặt tế bào. Sau khi đi vào nhân tế bào, EBV tồn tại ở dạng vòng là chủ yếu và tự nhân lên nhờ nguyên liệu của tế bào. Tuy nhiên, EBV cũng tích hợp vào ADN của nhiễm sắc thể tế bào chủ, ví dụ ở tế bào dòng Namalwa, nó tích hợp vào nhiễm sắc thể ở vị trí 1p35. Ở thể nhiễm tiềm ẩn trong lympho B, EBV biểu lộ rất ít kháng nguyên, hơn nữa với số lượng tế bào nhiễm quá thấp (1 tế bào lympho B/1ml máu) do đó EBV khó bị tiêu diệt bởi hệ miễn dịch. Khi ở thể dung giải, EBV nhân lên nhiều và giải phóng ra ngoài rồi lại nhiễm vào các tế bào lympho khác, chúng đến tuyến nước bọt và hình thành chu kỳ nhân lên EBV trong cơ thể. Với những tế bào biểu mô không biểu lộ rexeptơ CD21, người ta cho rằng virut có thể vào bằng những cách sau: Khả năng thứ nhất: có thể xảy ra là sự tiếp cận giữa tế bào biểu mô vòm họng và tế bào nhiễm EBV. Tế bào B đi vào chu trình dung giải, bung ra các bản sao của virus, cung cấp một số lượng lớn các hạt virus mới cho các tế bào khác trên một diện rộng . Và khả năng thứ hai: virus vào tế bào biểu mô bởi hiện tượng thực bào qua trung gian rexeptơ với IgA Sixbey and Yao. Ngoài ra, phân tử MHC lớp II cũng có thể là con đường chính virus xâm nhập vào tế bào biểu mô. Ngoài các tế bào lympho B và tế bào biểu mô, đôi khi EBV còn bị tấn công bởi các tế bào máu khác như đai thực bào, lympho T hoặc tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer cell). 1.3.2. Cấu trúc của EBV EBV thuộc loại virut herpes, gamma-1, chiều dài bộ gen của nó khoảng 172- kb và ADN là chuỗi đôi, GC chiếm 60% tổng số nucleotid EBV hình thành phân tử DNA dạng vòng ở tế bào bị nhiễm bởi đầu TR (terminal repeat) của nó (hình 1A). Khi xử lý EBV của dòng tế bào B95-8 bằng emzym cắt giới hạn BamHI, các đoạn gen tạo ra được ký hiệu theo bảng chữ cái và theo thứ tự kích thước giảm dần (hình 1B). Thuật ngữ sử dụng cho từng đoạn như sau: Mỗi chữ cái là ký hiệu cho từng đoạn (A, B …), khung đọc mở trái hoặc phải và tiếp theo là thứ tự (0,1,2,3…) ví dụ 6 như BARF0 và BARF1. Toàn bộ bộ gen EBV của dòng tế bào B95-8 được giải trình tự gen đầu tiên, và có mã số tại ngân hàng gen là V01555. Các EBV sản xuất khoảng 100 kháng nguyên khác nhau (các phân tử protein lớn) trong thể dung giải của nó, ngược lại, chỉ có khoảng 10 kháng nguyên được sản xuất trong các thể nhiễm tiềm ẩn Reddy, Raslan, Gooneratne, Kathuria and Marks[2] Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của EBV: A) Cấu trúc EBV dạng vòng biểu thị các vùng promoter và các gen thể nhiễm tiềm ẩn: EBER1 và 2: EBV Early RNA, EBNA1-6: EBV Nuclear Antigen, LMP1 và2: Latent Membrane Protein. B) EBV ở dạng thẳng gồm các đoạn gen được tạo ra sau khi xử lý với enzym giới hạn BamH1 và vị trí các gen của thể tiềm ẩn. 1.3.3. Thể tiềm ẩn của EBV Giống như tất cả các virut herpes, EBV có thể tồn tại dạng không hoạt động trong tế bào bị nhiễm. Ở thể này, EBV biểu lộ 12 gen, nhưng chỉ có 10 gen trong số này được dịch mã để tổng hợp protein, bao gồm 6 loại protein là kháng nguyên nhân (EBV Nuclear Antigen ): EBNA1, 2,3A,3B,3C, -LP; 3 loại protenin màng tiềm ẩn (Latent Membrane Protein): LMP1, LMP2A và 2B; 2 loại RNA không mã hóa protein (EBV Early RNA): EBER1 và2. Có bốn thể tiềm ẩn được phân loại dựa trên sự biểu lộ gen của virut,được liệt kê ở bảng dưới đây. BamHI B A A 7 Bảng 1: Các thể tiềm ẩn của EBV Thể tiềm ẩn Biểu lộ gen EBV Người thường và các bệnh liên quan 0 EBER1 & 2 LMP2A +/- Người thường I EBER1 & 2 EBNA1 U lympho Burkitt, UTVMH II EBER1 & 2 EBNA1 LMP1 LMP2A&2B UTVMH, U lympho Hodgkin, U lympho tế bào T, ung thư tuyến nước bọt. III EBER1&2 EBNA1- 6 LMP1 LMP2A & B U lympho sau ghép tạng. U lympho ở bệnh nhân AIDS, bạch cầu đơn nhân nhiễn khuẩn, LCL. 1.3.4. Các gen EBV của thể tiềm ẩn 1.3.4.1. EBNA1 Protein EBNA1 của EBV thuộc dòng tế bào B95-8 có trọng lượng khoảng 66- 95 kDa và chiều dài là 641 axit amin. Kích thước này được thay đổi ở các chủng khác nhau do sự khác nhau ở đoạn lặp lại glycin- alanin (Gly-Ala) Hennessy and Kieff. Các cấu trúc cơ bản của EBNA1 được chia thành bốn vùng rõ ràng: một vùng cơ bản nằm ở đầu N gồm 89 acid amin, vùng lặp lại Gly-Ala gồm 239 acid amin, vùng cơ bản ngắn và một vùng gắn DNA ở đầu C có chiều dài từ axit amin 459-641 Ambinder, Mullen, Chang, Hayward and Hayward (Hình 2). Hình 2. Cấu trúc của EBNA1 Basic Gly-Ala repeats Bas i c DNA-binding NH 2 COOH 1 33 83 90 328 382 459 604 6 EBNA1 là protein biểu lộ hầu như tất cả các tế bào nhiễm EBV Andersson-Anvret, Klein, Forsby and Henle và nó đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì episom của EBV (dạng vòng) trong nhân tế bào chủ, cũng như chức năng phiên mã của virut Yates JL. Vùng gắn ADN của protein EBNA1 tương tác với hai khu vực nằm ở vùng oriP của promoter Cp, bao gồm gia đình lặp đi lặp lại FR (Family of Repeat) có chứa 20 đoạn nucleotid có trình tự lặp, đoạn DS (Dyad Symmetry) có 4 vị trí gắn, và một vùng có hai vị trí gắn sau promoter của Qp. Liên kết EBNA1 với vùng FR có ái tính cao nhất so với DS và Qp và khi gắn với FR thì nó điều hòa phiên mã các gen EBNA. Các gen này được biểu lộ dưới sự kiểm soát của promoter Cp hay Wp. EBNA1 cũng có thể liên kết với các intron đầu tiên xuôi chiều của promoter Qp làm tự điều hòa biểu lộ protein EBNA1. Ở các thể nhiễm tiềm ẩn I và II, các promoter Cp và Wp không hoạt động và biểu lộ của EBNA1 được thực hiện bởi Qp. Cp và Wp không hoạt động do các yếu tố phiên mã và methyl hóa ADN Robertson, Hayward, Ling, Samid and Ambinder. 1.3.4.2. EBNA2 Protein EBNA2 có trọng lượng phân tử từ 75-105 kDa. Do có trình tự gen khác nhau ở các chủng EBV mà người ta xếp thành EBNA2A và EBNA2B, cũng là dấu ấn quan trọng để xếp loại EBV typ I và typ II Aitken, Sengupta, Aedes, Moss and Sculley . Các protein EBNA2A và EBNA2B chứa 484 và 443 axit amin một cách tương ứng và giống nhau về trình tự khoảng 57%. EBNA2 là một trong những protein virut đầu tiên được biểu lộ ở các tế bào lympho B bị nhiễm EBV, nó xuất hiện khoảng 24-48 giờ sau khi nhiễm EBV trong nuôi cấy tế bào in vitro Murray and Young. Protein này là một chất kích hoạt phiên mã một số gen của virut và tế bào bao gồm cả những gen như CD21, CD23, Bcl-2 và c-myc, và là cần thiết cho sự bất tử của tế bào B trong in vitro. EBNA2 không gắn trực tiếp với ADN, nhưng tác động thông qua các protein in khác như RBP-JK), PU1 các protein khác của tế bào. 1.3.4.3. Gia đình EBNA3 ( EBNA3A, 3B và 3C) Các gen trong gia đình EBNA3 bao gồm EBNA3A, 3B và 3C nằm ở giữa bộ gen EBV, có cấu trúc exon-intron tương tự và có trọng lượng phân tử từ 140-180 kDa. Các chuỗi acid amin EBNA3A, 3B và 3C giữa EBV typ I và II có giống nhau ở 84%, 80% và 72% một cách tương ứng . Các protein này hoạt động có chức năng phiên mã và cũng có thể tương tác với các protein RBP-JK Robertson ES. 1.3.4.4. EBNA-LP Các protein EBNA dẫn đầu EBNA-LP có kích thước khác nhau từ 20- 130 kDa, là kết quả của hoạt động promoter Wp. Cùng với EBNA2, EBNA- LP là một trong những protein đầu tiên biểu lộ sau nhiễm EBV vào tế bào lympho B in vitro 1.3.4.5. LMP1 Protein LMP1 được phiên mã từ vùng BNLF1 nằm ở gần cuối đầu 3' của bộ gen EBV và có trọng lượng khoảng 60-66kD, tùy thuộc vào chủng virus [104, 105]. Ở chủng EBV của tế bào dòng B95-8, protein này có 386 axit amin và chia thành ba vùng,(i) một vùng đầu N gồm 24 axit amin, (ii) sáu vùng xuyên màng kỵ nước được kết nối bởi ba vòng bên ngoài và hai vòng nội bào(iii) một vùng đầu C có 200 axít amin bao gồm hai lĩnh vực chức năng quan trọng Hennessy, Fennewald, Hummel, Cole and Kieff được gọi là vùng hoạt hóa CTAR1 (C-Terminal Activation Region 1: aa194-232) và CTAR2 ( aa 351-386). LMP1 tham gia ba chức năng chính là chuyển dạng, di căn và chống lại chết theo chương trình LMP1 được coi là sản phẩm của một gen sinh ung thư vì nó có thể làm chuyển dạng các nguyên bào sợi động vật gặm nhấm. Biểu hiện của LMP1 cũng tác động ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của tế bào biểu mô, ức chế sự biệt hóa của chúng, gây biến đổi hình thái của một số dòng tế bào biểu mô , và làm tăng biểu hiện của các yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR Miller WE. 1.3.4. 6. LMP2A/2B LMP2 được mã hóa bởi chỗ ghép nối hình thành dạng vòng của EBV [119]. LMP2 có hai loại là LMP2A và LMP2B, và chỉ khác nhau là LMP2A có thêm đoạn 119 acid amin ở đầu N tận còn LMP2 thì không có. Mặc dù chưa biết được chức năng cụ thể của LMP2B, nhưng việc biểu lộ nhiều của nó cho thấy rằng nó đóng vai trò quan trọng trong sinh học của EBV. Trong khi chức năng của LMP2A đã được xác định trong các tế bào B. Tuy nhiên, protein này biểu lộ ở một tỷ lệ thấp trong các khối u vòm họng. 1.4. Yếu tố ngoại di truyền Ngoại di truyền là nghiên cứu các cơ chế làm không biểu lộ gen mà không liên quan đến sự thay đổi trình tự nucleotid của gen. Những biến đổi ngoại di truyền có thể di truyền được từ thế hệ tế bào này sang tế bào khác. Khi nói đến ngoại di truyền người ta thường nhấn mạnh 3 yếu tố là: methyl hóa ADN, sửa chữa histon và nucleosom. Các thay đổi này là độc lập với nhau và methyl hóa xảy ra ở mức độ ADN trong khi 2 yếu tố còn lại diễn ra ở mức độ protein. 1.4.1. Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen. Methyl hóa ADN là sự kiện diễn ra do một gốc CH3 liên kết đồng hóa trị với vị trí cacbon số 5 của Cytosin nằm ở vị trí hai nucleotid Cytosin- Guanin viết tắt là CpG (p là liên kết phosphodieste). Khi CpG tập hợp nhiều trong khoảng 200bp tại một ví trí nào đó trong gen có GC chiếm hơn 50% thì [...]... sánh mức độ methyl hóa ở promotor Wp trong 2 phản ứng PCR đơn mồi và PCR đa mồi đặc hiệu Phản ứng Methyl hóa Wp Tổng PCR đơn mồi PCR đa mồi M (Methyl) U(Không methyl) Tổng Nhận xét: n 3. 2.2 So sánh mức độ methyl hóa ở promotor Cp trong 2 phản ứng PCR đơn mồi và PCR đa mồi đặc hiệu Phản ứng Cp Tổng PCR đơn mồi PCR đa mồi Methyl hóa M U Tổng Nhận xét: n 3. 2 .3 So sánh mức độ methyl hóa ở promotor Cp trong. .. phản ứng PCR đơn mồi và PCR đa mồi đặc hiệu Phản ứng Methyl hóa Qp PCR đơn mồi Tổng PCR đa mồi M U Tổng n Nhận xét: CHƯƠNG 4 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 1 Bàn luận về sự thay đổi các thông số là thành phần của kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa 2 Bàn luận về mức độ methyl hóa của các promoter Wp, Cp và Qp của EBV ở các khối u vòm họng 3 Bàn luận về cơ chế điều hòa biểu lộ gen EBNA1 trong ung thư vòm mũi họng. .. Cp Qp Biểu đồ 3. 1 .3 Nhận xét3.1.4 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu ở 6 nồng độ (NA) mồi khác nhau: Bảng 3. 1.4 (+/-) % Nồng độ mồi (NA) NA1 NA2 NA3 NA4 NA5 NA6 (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Promotor Wp Cp Qp Biểu đồ 3. 1.4 Nhận xét: 3. 1.5 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi ở 6 nồng độ ADN (NB)khác nhau: Bảng 3. 1.5 (+/-) % Nồng độ ADN... mồi + Chạy kỹ thuật PCR đa mồi đặc hiệu 2 .3. 2 Biến số và chỉ số nghiên cứu: - Các chỉ số nghiên cứu về PCR đơn mồi và đa mồi đặc hiệu methyl hóa được nghiên cứu bao gồm các thông số về nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi, Nồng độ Mg++, và lượng DNA làm khuôn mẫu - Các biến số nghiên cứu của mẫu sinh thiết bệnh nhân là mức độ methyl hóa hay không methyl hóa các promoter của EBNA1 2 .3. 3 Phương pháp thu thập thông... các thông số của nồng độ mồi, DNA khuôn mẫu, Nồng độ Mg++, Nhiệt độ gắn mồi Các ảnh minh họa kèm theo 3. 1.1 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đơn mồi ở 6 nồng độ (N) mồi khác nhau: Bảng 3. 1.1 (+/-) % Nồng độ mồi (NoA) NoA1 NoA2 NoA3 NoA4 NoA5 NoA6 (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Promotor Wp Cp Qp Biểu đồ 3. 1.1 Nhận xét: 3. 1.2 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng. .. và chỉ số nghiên cứu: 15 - Các chỉ số nghiên cứu về PCR đơn mồi và đa mồi đặc hiệu methyl hóa được nghiên cứu bao gồm các thông số về nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi, Nồng độ Mg++, và lượng DNA làm khuôn mẫu 15 - Các biến số nghiên cứu của mẫu sinh thiết bệnh nhân là mức độ methyl hóa hay không methyl hóa các promoter của EBNA1 15 2 .3. 3 Phương pháp thu thập thông tin 15 2.4 Phương pháp... trường sống và thói quen sinh hoạt 4 1.2 .3 Yếu tố di truyền .4 1 .3 Virut Epstein-Barr 4 1 .3. 1 Sinh học của EBV 4 1 .3. 2 Cấu trúc của EBV 5 1 .3. 3 Thể tiềm ẩn của EBV 6 1 .3. 4 Các gen EBV của thể tiềm ẩn 7 1.4 Yếu tố ngoại di truyền 10 1.4.1 Methyl hóa ADN và điều hòa biểu lộ gen 10 1.4.2 Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1 12 ĐỐI TƯỢNG... mã không gắn được vào vùng đó của DNA Hình 3: Một cơ chế không biểu lộ gen bởi methyl hóa ADN A) Hai nucleotid CpG ở vùng promoter không methyl hóa, cho phép thực hiện phiên mã trong các tế bào bình thư ng B) Phiên mã bị chặn bởi tăng methyl hóa trong vùng promoter 1.4.2 Methyl hóa ADN các promotor của EBNA1 EBNA1 được biểu lộ trong tế bào nhiễm nhờ sự hoạt hóa của các promoter khác nhau ở những thể... methyl hóa Khi chúng bị methyl hóa ở vùng promoter dẫn đến hai cơ chế điều hòa biểu lộ gen: Một là, ức chế các yếu tố điều hòa biểu lộ gen gắn vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Cytosin, cơ chế này được minh họa trong Hình 3 sHai là, có các protein gắn đặc hiệu với CpG methyl hóa dẫn đến cơ chế làm mất axetyl của histon và làm cấu trúc sợi chromatin co lại, cuối cùng dẫn đến các yếu tố phiên mã không... và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đơn mồi ở 6 nồng độ ADN (N ‘)khác nhau: Bảng 3. 1.2 (+/-) % Nồng độ ADN (NoB) NoB1 N0B2 NoB3 NoB4 NoB5 NoB6 (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Promotor Wp Cp Qp Biểu đồ 3. 1.2 Nhận xét: 3. 1 .3 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đơn mồi ở 6 nồng độ Mg ++ (NC)khác nhau: Bảng 3. 1 .3 Nồng độMg ++ (NoC) (+/-) % NoC1 NoC2 NoC3 NoC 4 NoC5 NoC6 (+) (-) (+) . ở các tế bào dòng B95-8, Namalwa và Raji. 2. Ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu này xác định mức độ methyl hóa 3 promoter điều hòa biểu lộ gen EBNA1 của EBV trong các mẫu sinh thiết bệnh nhân ung thư. đến ung thư, đặc biệt là các gen ức chế ung thư. Đề tài này nhằm mục đích sau: 1. Phát triển phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hóa xác định mức độ methyl hóa ở các promoter Wp, Cp và Qp của EBV. (-) Wp Cp Qp Biểu đồ 3. 1 .3. Nhận xét3.1.4. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu ở 6 nồng độ (NA) mồi khác nhau: Bảng 3. 1.4 (+/-) % Promotor Nồng độ mồi (NA) NA1 NA2 NA3