Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRỊNH XUÂN THẮNG ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LTP CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU XANH CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRỊNH XUÂN THẮNG ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LTP CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU XANH CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC Chuyên nghành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố. Tác giả Trịnh Xuân Thắng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin cảm ơn TS. Lê Văn Sơn, KTV Hoàng Hà ( Phòng công nghệ tế bào thực vật- Viện công nghệ sinh học). Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện khoa học sự sống- Đại học Thái Nguyên và ThS. Hoàng Văn Mạnh đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc thực hiện các nghiên cứu đề tài luận văn. Tôi cảm ơn ThS. Bùi Hồng Xuyến đã cung cấp hạt của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh- KTNN, Ban Giám hiệu Trường THPT Phú Lương, các đồng nghiệp, sự động viên của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian tôi học tập và làm luận văn. Tác giả Trịnh Xuân Thắng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ i Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình vẽ viii MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. CÂY ĐẬU XANH 4 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây đậu xanh 4 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu xanh 4 1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của đậu xanh 8 1.1.4. Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam 9 1.2. GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH 11 1.2.1. Hạn và cơ sở hoá sinh, sinh học phân tử của tính chịu hạn 11 1.2.2. Protein vận chuyển lipid và gen LTP (Lipid Transfer Protein) 13 1.3. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG 15 1.3.1. Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 15 1.3.2. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma 17 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. VẬT LIỆU, HA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 18 2.1.1. Vật liệu 18 2.1.2. Các hóa chất chuyên dụng 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.1.3. Thiết bị 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1. Nghiên cứu ngoài đồng ruộng 19 2.2.2. Thống kê sinh học 19 2.2.3. Phân tích hóa sinh 20 2.2.4. Phân tích sinh học phân tử 21 2.2.5. Địa điểm nghiên cứu 27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. ĐẶC ĐIỂM NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC DÒNG ĐẬU XANH CHỌN LỌC VÀ GIỐNG GỐC 28 3.1.1. Đặc điểm nông sinh học của các dòng đậu xanh chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ở thế hệ R2 28 3.1.2. Đặc điểm nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3 31 3.2. CHẤT LƯỢNG HẠT CỦA CÁC DÒNG ĐẬU XANH C NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƯỚC 34 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN LTP 35 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 35 3.3.2. Kết quả nhân gen LTP từ hệ gen của dòng D15 và giống gốc 36 3.3.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biế n E.coli DH5α 37 3.3.4. Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang vecto tái tổ hợp 38 3.3.6. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen LTP 40 3.3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen LTP của các dòng đậu xanh nghiên cứu 42 3.3.8. Kết quả so sánh trình tự amino acid của các dòng đậu xanh nghiên cứu 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid ASTT Áp suất thẩm thấu DNA Deoxyribose nucleic acid RNase Ribonuclease Bp Base pair EDTA Ethylene Diamin Tetraacetic acid CTAB Cetyl Trymethyl Amonium Bromide IPTG Isopropylthio- beta-D- glactoside LB Luria Bertani LTP Lipid transfer protein OD Optical densyti PCR Polymerase chain Reaction TAE Tris- acetic acid- EDTA X- gal 5- brom- 4- chlobo- 3- indolyl- β-D- galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh mụ c cá c thiế t bị sử dụ ng 18 Bảng 2.2. Thành phần của PCR 22 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR 23 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng 25 Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợpbằ ng enzym BamHI 26 Bảng 3.1 Đặc điểm và mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học và yếu tố cấu thành nên năng suất 29 Bảng 3.2. Đặc điểm, mức độ biến dị của một số tính trạng nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đậu xanh ở thế hệ R3 32 Bảng 3.3. Hàm lượng protein, lipid của các dòng đậu xanh và giống gốc 34 Bảng 3.4. Trình tự mồi nhân gen LTP 36 Bảng 3.5. Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP ở VC1973A và D15 42 Bảng 3.6. Vị trí sai khác trình tự nuclotide của gen LTP ở hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố trên GenBank . 44 Bảng 3.7. Vị trí sai khác amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A, D15 với các trình tự đã công bố trên Genbank 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 19 Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT 24 Hình 3.1. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô seo chịu mất nước thế hệ R2 28 Hình 3.2. Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước thế hệ R3 33 Hình 3.3. Quả và hạt của hai dòng D15 và D40 33 Hình 3.4. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ mô lá của giống đậu xanh VC1973A và dòng D15 35 Hình 3.5. Hình ảnh điện di kết quả nhân gen LTP 36 Hình 3.6. Hình ảnh khuẩn lạc 37 Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR 38 Hình 3.8. Kết quả điện di plasmid tinh sạch chứa đoạn gen LTP 39 Hình 3.9 . Kết quả điện di sản phẩm căt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme 39 Hình 3.10. Trình tự nucleoitde của gen LTP ở hai mẫu đậu xanh D15 và VC1973A 41 Hình 3.11. Trình tự nucleotide của gen LTP ở hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 với các trình tự đã công bố 43 Hình 3.12. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các trình tự gen LTP 44 Hình 3.13. So sánh trình tự amino acid gen LTP của hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 45 Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid của gen LTP hai mẫu đậu xanh VC1973A và D15 so với các mẫu trên Genbank 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là cây công nghiệp ngắn ngày trồng lấy hạt giữ vị trí quan trọng của nhiều nước châu Á và Việt Nam. Hạt đậu xanh chứa nhiều chất dinh dưỡng như: protein chứa khoảng 23%- 28%, 1.3% lipid, 4.79% chất sơ, 64.12% hydratcacbon, các loại Vitamin A, B 1 , B 2 , C. Một số nguyên tố khoáng và hàm lượng chất sắt rất cao. Nước ta trồng nhiều đậu xanh, hạt đậu xanh dùng làm thực phẩm, bột đậu xanh rang chín hòa với nước sôi là loại nước uống rất bổ dưỡng. Ngoài ra hạt đậu xanh còn là một loại dược liệu quí có tác dụng chữa một số bệnh như bệnh tiểu đường, bệnh phù thũng, giải nhiệt hà khí. Đặc biệt đậu xanh còn có tác dụng giải độc do thuốc và các chất kim loại. Trồng đậu xanh ngoài thu hạt ra các phụ phẩm còn được dùng làm thức ăn cho gia súc và trồng đậu xanh có tác dung cải tạo đất do rễ cây có những nốt sần chứa vi khuẩn cố định nitơ Rhizobium. Ở Việt Nam, cây đậu xanh được trồng lâu đời và phân bố ở nhiều vùng khác nhau trong cả nước, nhưng năng suất chưa cao. Quá trình biến đổi khí hậu toàn cầu đã dẫn đến những hiện tượng thời tiết cực đoan và làm cho khí hậu ngày càng diễn biến phức tạp. Việt nam, cũng là một trong những quốc gia chịu nhiều ảnh hưởng của biến đổi khí hậu. Sự thay đổi về lượng mưa trong năm và sự phân bố lượng mưa không đồng đều giữa các vùng, hiện tượng hạn hán kéo dài cùng với các yếu tố bất lợi khác đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển, làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng, trong đó có cây đậu xanh. Cây đậu xanh thuộc nhóm cây chịu hạn kém, vì vậy nghiên cứu nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu xanh trong điều kiện khí hậu hiện nay là một yêu cầu cấp thiết. Chọn dòng biến dị soma trong công nghệ tế bào thực vật là một trong các biện pháp công nghệ hiện đại được áp dụng để cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu xanh. [...]... gốc từ mô sẹo chịu mất nước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 - Nhân bản gen LTP bằng kỹ thuật PCR từ các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước - Tách dòng và xác định trình tự gen LTP từ các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước - So sánh trình tự gen, trình tự amino acid giữa các dòng đậu xanh nghiên cứu và các trình tự đã công... số đặc điểm nông sinh học và chất lượng hạt Xác định được sự sai khác trong trình tự gen LTP của dòng đậu xanh thuộc nhóm chịu hạn tốt và chịu hạn kém 3 Nội dung nghiên cứu - Phân tích di truyền số lượng của một số đặc tính nông sinh học của các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo mất nước ở các thế hệ R2, R3 - Đánh giá chất lượng hạt trên phương diện hoá sinh của một số dòng đậu xanh có nguồn gốc từ. .. và khả năng giữ nước của màng nhằm giúp cây trồng chống lại điều kiện khô hạn của môi trường Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu cho luận văn là: Đánh giá đặc điểm nông sinh học và so sánh trình tự gen LTP của một số dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước 2 Mục tiêu nghiên cứu Chọn được dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ưu việt về một số. .. tế, có hạt tròn, màu xanh nâu –bóng, chịu hạn kém Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của giống VC1973A bao gồm: D15, D40, D02, D20 do Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp 2.1.2 Các hóa chất chuyên dụng Hóa chất dùng trong các phân tích hóa sinh và phân tích sinh học phân tử gồm các loại hóa chất mua của các hãng của. .. K.H và cs (2003) đã phân lập thành công hai dạng khác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [36] Trình tự các amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mang tính bảo thủ cao ở thực vật Trong hạt đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm, nhóm nghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn trong mô sinh dưỡng thì mRNA của cả Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và thân, không có. .. Hạt của các dòng chọn lọc ở thế hệ R3 Trồng ngoài đồng ruộng Đánh giá đặc điểm nông học Phân lập gen LTP Dòng triển vọng Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.2.1 Nghiên cứu ngoài đồng ruộng Thí nghiệm trên đồng ruộng được tiến hành tại xã Phấn Mễ- Huyện Phú Lương Các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo mất nước và giống đối chứng được trồng trong cùng điều kiện và theo dõi sự phát triển của các dòng. .. đơn giản và nhóm protein phức tạp Trong nhóm protein đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số loại khác Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơ cho quá trình nảy mầm của hạt [12] Ngoài ra, protein của đậu xanh còn có một số đặc tính tốt khác như khả năng hút nước, hòa tan chất đạm của nó trong nước Bột đậu xanh và protein của nó còn có khả... trên Ngân hàng gen quốc tế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại cây đậu xanh Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek), có bộ NST 2n = 22, là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các nước Đông và Nam Á sau... địa lí phân bố Số lượng hạt trung bình trong 1 quả là một trong những yếu tố quyết định năng suất của đậu xanh Trung bình mỗi quả có 8 - 9 hạt Quả lớn nhất có đến 18 hạt [5] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh: Có 2 giai đoạn sinh trưởng và phát triển chủ yếu ở đậu xanh: - Các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng: Được... hoa, quả, hạt đậu Cây đậu xanh có đặc điểm sinh trưởng vô hạn hoặc bán vô hạn, nên việc xác định các thời kì sinh trưởng sinh thực thường gặp nhiều khó khăn, vì trên một cây đồng thời vừa có cả nụ, hoa, quả non và quả chín Vì vậy, thời kì sinh thực của đậu xanh chỉ mang tính chất tương đối [5], [12] Bên cạnh những cây lương thực có giá trị kinh tế như lúa, lạc, ngô, đậu tương thì đậu xanh cũng được . xác định trình tự gen LTP từ các dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước. - So sánh trình tự gen, trình tự amino acid giữa các dòng đậu xanh nghiên cứu và các trình tự đã công bố. phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu cho luận văn là: Đánh giá đặc điểm nông sinh học và so sánh trình tự gen LTP của một số dòng đậu xanh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu. DÒNG ĐẬU XANH CHỌN LỌC VÀ GIỐNG GỐC 28 3.1.1. Đặc điểm nông sinh học của các dòng đậu xanh chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ở thế hệ R2 28 3.1.2. Đặc điểm nông sinh học và yếu