BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN TRẦN ðẶNG DŨNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN ðẬU GÀ NHƯỢC ðỘC ðÔNG KHÔ CHỦNG C TRÊN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN TRẦN ðẶNG DŨNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN ðẬU GÀ NHƯỢC ðỘC ðÔNG KHÔ CHỦNG C TRÊN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM HÀ NỘI – 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là ñề tài nghiên cứu của tôi và các ñồng nghiệp. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, do tôi khảo sát nghiên cứu, có sự giúp ñỡ của các ñồng nghiệp trong cơ quan. Tôi xin cam ñoan, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Trần ðặng Dũng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành bản luận văn này, ngoài sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân còn có sự hướng dẫn tận tình của thầy hướng dẫn khoa học PGS. TS. Cù Hữu Phú, PGS. TS Nguyễn Hữu Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến thầy hướng dẫn, người ñã giành nhiều thời gian quý báu tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban giám ñốc Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương. - Tập thể cán bộ công nhân viên trong phân xưởng vacxin virus ñông khô – Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương - Ban ñào tạo sau ñại học – Trường ñại học Nông Nghiệp Hà Nội. ðã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ñình, người thân, bạn bè, ñồng nghiệp - Những người luôn tạo ñiều kiện, ñộng viên, giúp ñỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày … tháng … năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Trần ðặng Dũng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii 1. MỞ ðẦU 1 1.1. ðẶT VẤN ðỀ 1 1.2. MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. VIRUS ðẬU GÀ VÀ BỆNH ðẬU GÀ 4 2.2. MIỄN DỊCH HỌC CỦA BỆNH ðẬU GÀ 17 2.3. NHỮNG YÊU CẦU CƠ BẢN TRONG SẢN XUẤT VACXIN ðẬU GÀ 20 2.4. ðÔNG KHÔ VACXIN 23 2.5. PHÒNG BỆNH BẰNG VACXIN 26 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1. ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31 3.2. NỘI DUNG 31 3.3. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 32 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38 4.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VIRUS ðẬU GÀ NHƯỢC ðỘC CHỦNG C TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP 38 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 4.1.1. Khảo sát ñặc tính gây phá hủy tế bào của virus giống ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 38 4.1.2. Kết quả xác ñịnh hiệu giá virus giống trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp qua các lần cấy chuyển (TCID 50 ) 41 4.1.3. Kiểm tra các chỉ tiêu thuần khiết, an toàn và tính sinh miễn dịch của lô giống gốc thích ứng trên môi trường nuôi cấy tế bào 43 4.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACXIN 48 4.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin ñậu gà nhược ñộc ñông khô nuôi cấy trên môi trường tế bào. 48 4.2.2. Xác ñịnh liều gây nhiễm thích hợp của virus ñậu gà chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 50 4.2.3. Xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể thu hoạch huyễn dịch sau khi gây nhiễm virus ñậu gà chủng C 52 4.2.4. Xác ñịnh tỷ lệ phối trộn chất bổ trợ và huyễn dịch virus 54 4.3. ðÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG VACXIN ðẬU GÀ ðƯỢC SẢN XUẤT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP 56 4.3.1 Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và chân không của vacxin ñông khô 56 4.3.2. Kết quả kiểm tra vô trùng 58 4.3.3. Kết quả kiểm tra an toàn 59 4.3.4. Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch 61 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 5.1. KẾT LUẬN 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic CAM CEF Chorioallantoic membrane (Màng rung niệu) Chick embryo fibroblast (Tế bào xơ phôi gà) CEK Chick embryo kidney (Tế bào thận phôi gà) CEL Chick embryo liver (Tế bào gan phôi gà) CK Chick kidney (Tế bào thận gà) CPE REV Cytopathic effect (Bệnh lý tế bào) Reticuls endotheliosis virus ARN Acid ribonucleic EID 50 50% Egg-infective dose (Liều gây nhiễm trứng 50%) LD 50 50 percent Lethal Dose M Membrain (Protein màng) MEM Minimal essential medium (Môi trường cần thiết tối thiểu) OIE Office International des Epizooties (Tổ chức Dịch tế Thế giới) PBS Phosphate buffered saline (Dung dịch muối ñệm) PCR SPF TCID 50 TCN TN Polymerase chain reaction Specific pathogen free (Sạch bệnh) Median tissue culture infective dose (Liều gây nhiễm tế bào 50%) Tiêu chuẩn ngành Thí nghiệm TK Thymidine kinase Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1: Kết quả khảo sát ñặc tính gây phá hủy tế bào của virus giống ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 39 4.3: Kết quả kiểm tra vô trùng lô giống gốc ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 44 4.4: Kết quả kiểm tra an toàn lô giống gốc ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 46 4.5: Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch của lô giống gốc ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 47 4.6: Kết quả xác ñịnh liều gây nhiễm thích hợp của virus ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 50 4.7: Kết quả xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể thu hoạch huyễn dịch virus 53 4.8: Kết quả thí nghiệm về tỷ lệ chất bổ trợ trong vacxin ñậu gà tế bào ñông khô 55 4.9: Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và chân không của vacxin ñông khô 57 4.10. Kết quả kiểm tra vô trùng các lô vacxin ñậu gà trên môi trường nuôi cấy tế bào 59 4.11: Kết quả kiểm tra an toàn vacxin ñậu gà nhược ñộc chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào. 60 4.12: Kết quả kiểm tra tính sinh miễn dịch các lô vacxin ñậu gà C trên môi trường nuôi cấy tế bào. 62 4.14: Kết quả ñánh giá ñộ dài miễn dịch ñậu gà sau khi tiêm vacxin bằng phương pháp công cường ñộc 66 4.15: Kết quả nghiên cứu thời gian bảo quản vacxin ñậu gà 68 chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 68 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1: Bệnh tích tế bào do virus ñậu gà nhược ñộc chủng C gây ra 40 4.2: Tế bào xơ phôi gà một lớp không gây nhiễm virus 40 4.3: Hiệu giá virus ñậu gà sau các lần cấy chuyển 43 4.4: Sơ ñồ quy trình sản xuất vacxin nhược ñông khô ðậu gà bằng công nghệ nuôi cấy tế bào 48 4.5: Hiệu giá virus ñậu gà của các liều gây nhiễm 52 4.6: Hiệu giá virus tại các thời ñiểm sau khi gây nhiễm virus ñậu gà chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 53 4.7: Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và ñộ chân không của vacxin ñậu gà tế bào nhược ñộc ñông khô 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðẶT VẤN ðỀ ðậu gà là một bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh với các biểu hiện ñặc trưng là hình thành và xuất hiện các nốt ñậu ở mào, tích, mép mỏ, mí mắt, da chân và màng giả ở niêm mạc vòm họng, hầu của gà. Bệnh ñậu gà là bệnh virus chung của gia cầm (gà, gà tây) và các loài chim (cả chim nuôi và chim hoang dã). Theo các tác giả Bolte, A. L. J. Meurer, E. F. và Kaleta [17] thì có khoảng 9.000 loài chim ñã bị nhiễm bệnh tự nhiên với virus ðậu. Bệnh gây ra bởi virus ADN thuộc nhóm Avipoxvirus, họ Poxviridae. Bệnh phân bố rộng khắp trên toàn thế giới. Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng ñến kinh tế ñối với các ñàn gia cầm vì nó gây giảm sản lượng trứng ñối với các ñàn gà ñẻ, gây giảm sự tăng trưởng ñối với các ñàn gia cầm non và gây tỷ lệ chết ñáng kể ñối với tổng ñàn. Bệnh ñậu gà là một bệnh lây lan với những ñặc trưng của bệnh là hình thành những nốt ñậu hoặc vẩy ở những vùng da không có lông (gọi là thể ngoài da) hoặc hoại tử fibrin và các bệnh tích tăng sinh ở lớp màng nhầy của ñường hô hấp trên, miệng, thực quản (gọi là thể thực quản). Gia cầm bị bệnh ñậu có thể bị ở thể ngoài da hoặc thể bạch hầu hoặc có thể bị cả hai thể cùng lúc. ðối với thể ngoài da, tỷ lệ chết trong tổng ñàn thường thấp. Tuy nhiên, nó lại là nguyên nhân gây ra thể bạch hầu và kế phát các bệnh truyền nhiễm khác và gây ra tỷ lệ chết cao trong tổng ñàn. Gà con 1- 3 tuần tuổi rất mẫn cảm với bệnh. Ở gà bệnh, virus ñậu có trong nốt ñậu, màng giả trong niêm mạc, virus còn có ở trong máu khi gà ñang có bệnh hoặc khi ñã khỏi bệnh. Virus ñậu tồn tại lâu trong các vẩy ñậu, trong môi trường và là nguyên nhân gây bệnh cho những ñàn gà mẫn cảm khác. Tỷ lệ bệnh tăng lên ở những nơi có nhiều ñàn gà nhốt gần nhau hoặc ở những [...]... ch ng N u vacxin ñư c tiêm ch ng ñúng c ch cho c c gà m n c m thì ph n l n gà s ti p nh n vacxin nh ng ñàn gà l n ít nh t 10% s gà ph i ñư c ki m tra ñ ti p nh n vacxin cho 1 gà ñã c mi n d ch, vi c s d ng vacxin kém hi u l c ho c tiêm ch ng không ñúng c ch C th phân bi t ñ c tính gây b nh và tính sinh mi n d ch : - Virus ñ u gà : gây b nh cho gà và gà sao, gây b nh nh cho gà tây, c n v i b c u ch... S N XU T VACXIN ð U GÀ Vacxin ñ u gà t bào ñư c s n xu t ñ u ph i áp d ng ñ y ñ c c tiêu chu n chung áp d ng cho c c lo i vacxin, ñ ng th i c ng ph i c nh ng yêu c u riêng áp d ng cho vacxin như c ñ c ð i v i vi c s n xu t vacxin nói chung và vacxin ñ u gà t bào nói riêng, vi c x c ñ nh ch ng c ng ñ c ñ ki m tra hi u l c là r t quan tr ng Ch ng c ng ñ c ph i ñư c thi t l p t nh ng virus c tính tương... u gà và ch ng virus ñ u b c u dùng ñ ch vacxin phòng b nh ñ u cho gia c m Nh ng vacxin này ñư c s n xu t b ng c ch gây nhi m virus ñ u gà ho c virus ñ u b c u vào màng CAM c a phôi gà 9 – 11 ngày tu i ho c gây nhi m vào môi trư ng nuôi c y t bào xơ phôi gà Nh ng khu v c có tình hình d ch t ph c t p và ñã c thông báo b b nh ñ u ñư c khuy n c o s d ng vacxin như c ñ c ð u gà t ch ng virus ñ u gà ho c. .. th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 15 hi n, trư ng h p nh s o c th không nhìn rõ C c virus vacxin như c ñ c t o ra c c b nh tích c c b , c c b nh tích này nh hơn so v i c c b nh tích do c c ch ng ñ c l c gây nên th b ch h u s hình thành c c n t ñ c ho c c c ñ m vàng trên niêm m c mi ng, th c qu n, lư i và khí qu n C c n t nhanh chóng to lên và thư ng h p l i tr thành c c màng màu vàng, ho i t b ch... s n xu t vacxin b ng phương pháp nuôi c y trên màng CAM Hi n t i, c c vacxin phòng b nh ñ u gà Vi t nam ch y u ñư c s n xu t t tr ng gà c phôi như vacxin ð u gà ch ng C c a Xí nghi p thu c thú y Trung Ương, vacxin ð u gà ch ng Woybridge c a C ng ty Navetco ho c vacxin ñ u gà ch t ch ng C Trư ng ð i h c nông nghi p I Hà N i (Nguy n Như Thanh)[13] Xu t phát t nh ng lu n c v khoa h c trên, chúng tôi... t ti n hành nghiên c u ñ tài: Nghiên c u ch t o th nghi m vacxin ñ u gà như c ñ c ñông khô ch ng C trên môi trư ng t bào xơ phôi gà m t l p” 1.2 M C TIÊU C A ð TÀI - Nuôi c y thích nghi virus ñ u gà ch ng C trên môi trư ng nuôi c y t bào xơ phôi gà m t l p - Xây d ng quy trình s n xu t vacxin ð u gà b ng c ng ngh nuôi c y t bào Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi... c c c tri u ch ng lâm sàng gi ng nhau và ñ u gây b nh tích khí qu n Dùng c c ño n m i ñ c hi u virus c th phát hi n ñư c c c b nh này G m dùng PCR c n ñư c dùng ñ phân bi t c c ch ng virus ñ u gà vacxin và virus ñ u t nhiên vì virus t nhiên c ch a ti n virus nguyên v n c n c c ch ng vacxin ch ch a c c trình t LTR (Long Terminal Repeat) 2.2 MI N D CH H C C A B NH ð U GÀ 2.2.1 C c lo i mi n d ch ch... gà v i c c kích thư c kh c nhau c th ñư c khuy ch ñ i b ng ph n ng PCR c dòng m i ñ c hi u Ph n ng này r t c ng d ng khi ch c 1 lư ng virus c c nh hi n di n trong m u Trong trư ng h p c nhi u b nh h n h p, c c ño n v i kích thư c kh c nhau c th ñư c khuy ch ñ i trong ph n ng PCR ñơn c s d ng c c ño n m i ñ c hi u Thí d th b ch h u c a b nh ñ u gà và b nh viêm thanh qu n truy n nhi m c ng c c c. .. c u gây nhi m trên màng CAM c a phôi gà Nh ng vacxin này c ch a t i thi u 105EID50/ ml ñư c x c ñ nh là t o mi n d ch t t cho ñàn gà Tuy nhiên, nh ng vacxin s ng ñư c s n xu t trên phôi s gây nh ng ph n ng nghiêm tr ng n u s d ng không ñúng c ch Vacxin ð u gà ñư c s n xu t trên màng CAM ñư c s d ng theo phương pháp ch ng c nh cho gà 4 tu n tu i và gà mái 1 – 2 tháng tu i trư c khi b t ñ u ñ Tái ch... nhưng nó không ph i là thu c tr b nh và c ng không th thay th cho vi c chăm s c ñúng ñ n thư ng ngày C s c a s tiêm phòng b ng vacxin là ph i nh n th c ñư c vacxin không lo i tr m i ñe do nào c a t t c c c b nh truy n nhi m do virus, vi khu n gây ra, vacxin ch c ích trong vi c giúp con v t tránh s t n c ng t c a nh ng d ch b nh nghiêm tr ng Phòng b nh b ng vacxin c t c d ng duy Trư ng ð i h c Nông . hành nghiên c u ñề tài: Nghiên c u chế tạo thử nghiệm vacxin ñậu gà như c ñ c ñông khô chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp . 1.2. M C TIÊU C A ðỀ TÀI - Nuôi c y thích nghi. hủy tế bào c a virus giống ñậu gà như c ñ c chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 38 4.1.2. Kết quả x c ñịnh hiệu giá virus giống trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp qua c c. GIÁO D C VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI H C NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN TRẦN ðẶNG DŨNG NGHIÊN C U CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN ðẬU GÀ NHƯ C ð C ðÔNG KHÔ CHỦNG C TRÊN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP