TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD : PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh SV thực hiện : Nhóm 7 Chủ đề: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 1. Nguyễn Thị Duyên 570960 2. Nguyễn Thị Anh Đào 560785 3. Phạm Thị Huệ 560808 4. Lê Ngọc Mai 560827 5. Phùng Tiến Quang 560853 6. Phạm Thị Thảo 560866 7. Đào Trần Trung 550413 8. An Thị Yến 560895 A.ĐẶT VẤN ĐỀ . 1 2 3 4 5 6 Giới thiệu chung Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào ƯD của NC huyền phù TB trong nhân giống vô tính ƯD của NC huyền phù TB trong sản suất sinh khối tế bào và các hợp chất có giá trị cao Nuôi cấy Nhân sâm Panaxginseng bằng Bioreacter KẾT LUẬN Khái niệm, Đặc trưng Khái niệm, Đặc trưng  Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng  Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng Sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết tập. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào I. GIỚI THIỆU CHUNG • Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn. • Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi thành phần môi trường. • Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn • Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn. • Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi thành phần môi trường. • Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn . MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY tb huyền phù có bản chất là tb callus mt nuôi cấy calus có thể sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào cải tiến hàm lượng và tỉ lệ auxin/cytokinin cho phù hợp để có được các tế bào phân tán tốt trong môi trường lỏng lắc. Các chỉ tiêu sinh trưởng Các chỉ tiêu sinh trưởng • Số lượng tế bào: Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút. Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy. • Thể tích tế bào: Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Thu tế bào và đem xác định thể tích. Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy. • Khối lượng tươi: Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định. Rửa bằng nước cất vô trùng Làm khô trong chân không. Cân để xác định khối lượng. • Khối lượng khô: Lấy một thể tích mẫu xác định. Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman. Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi. • Xác định chỉ số nguyên phân (chỉ số phân bào): Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kính. Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 5 phút. Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100. Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế bào. Tổng số tế bào phân bào x 100 Chỉ số phân bào(%) = Tổng số tế bào kiểm tra [...]... trưởng của tế bào của tế bào 2 Sau 1-2 tuần trong bình nuôi 2 Sau 1-2 tuần trong bình nuôi cấy sẽ tạo huyền phù tế bào : : cấy sẽ tạo huyền phù tế bào •• Tế bào có khả năng sinh Tế bào có khả năng sinh phôi phôi •• Tế bào không có khả năng Tế bào không có khả năng sinh phôi sinh phôi Sau 8 ngày: Thu được sinh khối, chuyển toàn bộ sinh khối này sang quá trình nuôi kế tiếp, dung tích mỗi lần nuôi sau nhiều... của tế bào: nhuộm bằng flurescein diacetate (0,01%) và quan sát màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet) II Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy dịch thể động Nuôi cấy chìm liên tục Nuôi cấy chìm tuần hoàn Nuôi cấy bằng Bioreactor Bioreacter không có cánh khuấy Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS) NUÔI CẤY DỊCH THỂ ĐỘNG Nuôi cấy chìm liên tục • Ngâm hẳn tế bào. .. đảm bảo cho quá trình tự dưỡng của tế bào xảy ra KẾT LUẬN  Nuôi cấy huyền phù tế bào đang mở ra nhiều định hướng phát triển cho tương lai  Trong những năm gần đây, Việt Nam đã thành công trong các quy trình áp dụng các phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất ra các chế phẩm sinh học, y học  cơ sở vật chất cơ bản cho một phòng thí nghiệm nuôi cấy huyền phù tb rất đắt nên việc áp dụng trong... và không gian nuôi cấy, giảm chi phí sản suất Giảm hoạt tính của các chất độc Nhược điểm Chưa khảo sát được mật độ nuôi cấy rất đắt, chưa được tự chế tạo trong nước Các thông số kĩ thuật cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây III Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào trong nhân giống vô tính Các bước cơ bản  Nuôi cấy callus: tiến hành cấy chuyển nhiều... callus: tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi trường thạch mềm  Nuôi cấy dịch huyền phù: • Callus được cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động • Các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết Sự phát sinh soma  sử dụng môi trường kích thích có chứa... nuôi cấy I.Mẫu nuôi cấy: có thể lấy phần ngọn, lá,…mẫu dùng để nuôi cấy phải có những tính chất sau: •Mẫu tế bào phải được lấy từ cây biết chắc chắn có khả năng sinh tổng hợp chất cần thiết và có khả năng được tổng hợp hay chuyển hoá cao nhất •Mẫu phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn phát triển mạnh nhất •Khi mẫu cấy tạo thành mô sẹo, cấy mô sẹo này vào trong môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tế bào. .. dung tích mỗi lần nuôi sau nhiều hơn lần nuôi trước khoảng 10-15 lần, cứ như vậy nhân giống cho đến khi đủ lượng giống cho sản xuất lớn, tỷ lệ giống trong sản xuất lớn khoảng 1-5% Hiện nay đã thiết kế những thiết bị nuôi cấy tế bào đơn với dung tích hàng chục m3 thiết bị lên men ở đây tương tự như trong công nghệ vi sinh vật Đối với các thiết bị nuôi cấy tế bào đơn không có hệ thống cung cấp oxygen... THỂ ĐỘNG Nuôi cấy chìm liên tục • Ngâm hẳn tế bào vào dd môi Nuôi cấy chìm tuần hoàn • Nhúng chìm vào môi trường trường dịch thể, xen kẽ với những • Khí đưa vào vô trùng khoảng thời gian được đưa ra • 250 vòng/phút ngoài môi trường • 10 – 15 ngày • Khối tế bào ở đầu này được đưa vào môi trường Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc với không khí Nuôi cấy bằng Bioreactor  Bioreacter không có cánh khuấy: thiết... phát triển tương đối đồng đều  phù hợp cho những quá trình nhân sinh khối tế bào và rễ do khả năng chịu được sự ngập chìm trong môi trường Nhược điểm  Hiện tượng thủy tinh thể do ngập chìm hoàn toàn và liên tục  Khó áp dụng một cách đồng loạt cho nhiều giống khác nhau  Nuôi cấy trong môi trường lỏng dễ bị nhiễm vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, côn trùng  Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS)... thành mô sẹo, cấy mô sẹo này vào trong môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tế bào đơn, môi trường nuôi cấy ở đây là: •Khoáng MS (Murashige-Skoog) •Ngoài ra còn bổ sung thêm: nước dừa; 2,4-D hoặc các loại auxin khác; bột chiết nấm men, bổ sung saccharose,… 1 Đầu tiên mô sẹo được nuôi cấy 1 Đầu tiên mô sẹo được nuôi cấy trong các bình tam giác thể tích trong các bình tam giác thể tích 200ml có chứa 20ml môi . Nhóm 7 Chủ đề: NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO 1. Nguyễn Thị Duyên 570 960 2. Nguyễn Thị Anh Đào 56 078 5 3. Phạm Thị Huệ 560808 4. Lê Ngọc Mai 5608 27 5. Phùng Tiến Quang 560853 6. Phạm Thị Thảo 560866 7. . bào ƯD của NC huyền phù TB trong nhân giống vô tính ƯD của NC huyền phù TB trong sản suất sinh khối tế bào và các hợp chất có giá trị cao Nuôi cấy Nhân sâm Panaxginseng bằng Bioreacter KẾT LUẬN Khái. niệm, Đặc trưng  Nuôi cấy huyền phu tế bào (cell suspension cultures) là phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong