Đang tải... (xem toàn văn)
MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trực khuẩn Bacillus là một trong những vi khuẩn có vai trò probiotic như các vi khuẩn lactic. Việc sử dụng các loài Bacillus trong chăn nuôi đã được tiến hành từ lâu và đã đem lại nhiều lợi ích cho người chăn nuôi do các loài Bacillus có khả năng sinh trưởng trong mọi điều kiện của môi trường nhờ hình thành bào tử. Chúng sản sinh nhiều loại enzyme khác nhau như protease, amylase. Đặc biệt chúng có khả năng sản sinh các hoạt chất kháng khuẩn với hoạt chất kháng khuẩn rộng. Hiện nay, các loài Bacillus được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học và là tác nhân nitrat hóa, có khả năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và chất thải khác nhờ khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu cơ như protease, amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh như Vibrio, Aeromonas...do chất lượng nước nuôi bị giảm. Chính vì vậy, các loài Bacillus là một trong những vi khuẩn không thể thiếu trong các chế phẩm sinh học để xử lý chất thải động vật. Để thu được những chủng giống vi khuẩn Bacillus có phẩm chất sinh học tốt đáp ứng yêu cầu của sản xuất các chế phẩm sinh học hay tạo ra các giống khởi động có chất lượng cao thì khân phân lập, chọn lọc đóng vai trò then chốt. Tuy nhiên, công việc chọn lọc này cũng rất tốn kém, đòi hỏi rất nhiều công sức và phụ thuộc rất nhiều vào công tác bảo quản giống sau phân lập. Các chủng giống được chọn lọc tự nhiên thường có sức sống tốt và có các đặc tính sinh học cao nhưng chúng rất dễ bị biến đổi đặc tính sinh học hoặc sinh những biến dị không mong muốn nếu khâu bảo quản và giữ giống không tốt. Hiện nay có rất nhiều các phương pháp bảo quản, giữ giống vi sinh vật hiệu quả như đông lạnh, đông khô…. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi phải có thiết bị, máy móc hiện đại mà nhiều phòng thí nghiệm trong nước chưa đáp ứng được. Vì vậy, các chủng giống sau phân lập chọn lọc vẫn được giữ giống với phương pháp truyền thống là cấy truyền trên thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém nhưng lại có một số nhược điểm như thời gian bảo quản ngắn, dễ bị biến đổi đặc tính sinh học của giống hoặc gây thoái hóa giống. Xuất phát từ thực tế trên, để đánh giá sự biến đổi các đặc điểm về hình thái cũng như đặc tính sinh học của một số chủng Bacillus sử dụng làm chế phẩm sinh học trong chăn nuôi trong quá trình giữ giống, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá sự biến đổi chất lượng giống của một số chủng Bacillus trong thời gian bảo quản ở nhiệt độ 4ºC”. 1.2. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Theo dõi các chủng Bacillus trong quá trình bảo quản, đánh giá sự biến đổi đặc tính sinh học của chúng trong các điều kiện và khoảng thời gian khác nhau, từ đó xác định điều kiện thích hợp để bảo quản vi khuẩn Bacillus. 1.2.2. Yêu cầu Trong quá trình theo dõi đánh giá, vi khuẩn phải đạt được các yêu cầu: Không có sự biến đổi về mặt hình thái. Không có sự biến đổi về đặc tính sinh hóa. Giữ được khả năng phân giải Protein. Giữ được khả năng phân giải tinh bột. Có khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.2. VI KHUẨN BACILLUS VÀ VAI TRÒ TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC 2.2.1. Đặc điểm sinh học Theo mô tả trong khóa phân loại Bergey (2008), vi khuẩn Bacillus (B.) thuộc lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae. Đặc điểm của chung của họ này là các vi khuẩn hình gậy, bắt màu Gram dương, sinh nội bào tử, phần lớn có khả năng di động nhờ các lông roi xung quanh thân. Họ Bacillaceae sinh nội bào tử được chia thành 2 chi: Chi sinh nội bào tử yếm khí là Clostridium Chi sinh nội bào tử hiếu khí là Bacillus Chi Bacillus gồm các trực khuẩn Gram dương, nhưng khi nuôi cấy lâu chúng có thể bắt màu Gram âm khi nhuộm. Các trực khuẩn Bacillus là loài sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, sinh nội bào tử. Chúng có ở mọi nơi trong tự nhiên. Phần lớn các loài Bacillus không gây bệnh nhưng một số loài là nguyên nhân gây bệnh ở người và động vật như Bacillus anthracis (gây bệnh than Anthrax) và B. cereus (gây ô nhiễm thực phẩm). Một số loài Bacillus: a. Bacillus subtilis: Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872, là một loài thuộc chi Bacillus, thuộc họ Bacillacaea. B. subtilis là trực khuẩn có kích thước 23 x 0,70,8 µm, đứng riêng rẽ, không tạo thành chuỗi; Bắt màu Gram dương, nhưng không đồng nhất; Có khả năng di động. Chúng sinh nội bào tử hình ovan, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm, có kích thước 1,51,8 x 0,60,9µm. Phần lớn bào tử được hình thành sau 48h nuôi cấy và không làm phình tế bào. Ở điều kiện 100oC, bào tử của B. subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. Trên môi trường thạch nghiêng, vi khuẩn mọc dày, khuẩn lạc khô đục mờ, rìa răng cưa hoặc lượn sóng. Mọc lan tràn, có màu trắng xám. Trên môi trường dịch thể: Môi trường trong, hình thành màng dày, dai, nhăn nheo, lượn sóng. B. subtilis có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein) để tạo thành vòng phân giải có đường kính lớn. Trong môi trường Litmus milk, chúng gây peptone hóa chậm và thường bị kiềm hóa Bacillus subtilis là loài tự dưỡng hiếu khí, một vài chủng sinh trưởng yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng từ 2840oC, tối đa là 50oC, một số chủng có thể sinh trưởng ở 55oC. Phân bố: trong đất, cỏ khô, các hợp chất hữu cơ bị phân hủy... B. subtilis được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại enzyme, ví dụ như amylase được sử dụng để rũ hồ hàng dệt, làm biến hình tinh bột trong sản xuất giấy. B. subtilis cũng sản xuất các protease bao gồm subtilisin được sử dụng chất tẩy rửa và công nghiệp thuộc da. Tuy nhiên, đáng chú ý là B. subtilis được sử dụng để sản xuất nhiều loại kháng sinh như difficidin, oxydifficidin, bacilli, bacillomyin B và Bacitracin. Các loại kháng sinh này được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng da do vi khuẩn và ngăn cản sự nhiễm trùng do đứt tay hoặc bị bỏng. B. subtilis cũng được bán như là một sản phẩm probiotic thương mại ở nhiều nước châu Âu từ nhiều năm trước mặc dù sự hiểu biết về cơ chế tác động của chúng còn rất hạn chế (Green D.H và cộng sự, 1999) như chế phẩm Enterogermina® được bán ở Italy vào những năm 1950 gồm 4 chủng B. clausii hoặc Bactisubtil® có chứa B. cereus (Huynh và cộng sự, 2005). b. Bacillus licheniformis Là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,60,8x1,53µm, đứng riêng rẽ, không tạo thành chuỗi, có khả năng di động, sinh nội bào tử 0,60,9x11,5µm, hình cầu hoặc hình trụ, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào, vách bào tử mỏng. Phần lớn bào tử xuất hiện sau 48 giờ nuôi cấy ở 37oC, không làm phình thân tế bào. Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành những khuẩn lạc có kích thước lớn, lan tràn, bề mặt khô hoặc nhăn nheo, rìa phát triển dạng lông nhỏ, màu trắng đục. Nuôi cấy trong môi trường dịch thể: môi trường trong, có xuất hiện màng dày, dai, nhăn nheo. Có khả năng phân giải tinh bột và phân giải protein có nguồn gốc là gelatin và casein. Chúng sinh trưởng tốt ở nồng độ muối từ 58%, bị ức chế ở nồng độ muối cao. Là trực khuẩn hiếu khí, một số chủng sống yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 3245oC, tối đa từ 5056oC. Một số chủng B. licheniformis có khả năng sản sinh hoạt chất kháng khuẩn là Bacitracin. Cũng giống như B. subtilis, B. licheniformis được nuôi cấy để thu enzyme alkaline proteases (làm sạch không khí, làm mềm lông trong công nghiệp da, bột giặt sinh học…), alphaamylases (biến tính tinh bột trong sản xuất giấy…); các hoạt chất kháng khuẩn như penicillinases, pentosanases, bacitracin, proticin, 5inosinic acid, inosine, citric acid, và Ltryptophan (Gherna et al., 1989). c. Bacillus megaterium Là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 1,21,5 x 24µm. Đứng riêng rẽ hoặc nối thành chuỗi ngắn. Có khả năng di động. Sinh bào tử hình elip nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào. Vách bào tử mỏng, phần lớn bào tử xuất hiện sau 48h nuôi cấy. Bào tử không làm phình tế bào. Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành khuẩn lạc lớn, dạng S, tròn trơn nhẵn bóng, bề mặt vồng lên, rìa gọn, không lan, dạng kem màu trắng ngà. Sinh trưởng trong môi trường dịch thể: môi trường đục, đồng nhất, có cặn, không xuất hiện
Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 LỜI CẢM ƠN Sau 4 năm học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, đặc biệt là sau khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân tôi còn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của nhà trường, các thầy giáo, cô giáo, gia đình và bạn bè. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Tuyết Lê đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực tập cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Dinh dưỡng- Thức ăn, Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã góp ý và chỉ bảo để tôi hoàn thành khóa luận. Để hoàn thành khóa luận này, tôi còn nhận được rất nhiều sự động viên, khích lệ của những người thân trong gia đình và bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn những tình cảm cao quý đó. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 08 năm 2013 Sinh viên Đàm Thị Hoa Khoa CN & NTTS 1 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết Tắt Tiếng Việt VK Vi khuẩn B Bacillus ĐK Đường kính MT Môi trường TB Tế bào LB Luria-Broth ml Mililit mm Milimet H Giờ Cs Cộng sự ºC Độ Celcius VSV Vi sinh vật TĐC Trao đổi chất Khoa CN & NTTS 2 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trực khuẩn Bacillus là một trong những vi khuẩn có vai trò probiotic như các vi khuẩn lactic. Việc sử dụng các loài Bacillus trong chăn nuôi đã được tiến hành từ lâu và đã đem lại nhiều lợi ích cho người chăn nuôi do các loài Bacillus có khả năng sinh trưởng trong mọi điều kiện của môi trường nhờ hình thành bào tử. Chúng sản sinh nhiều loại enzyme khác nhau như protease, amylase. Đặc biệt chúng có khả năng sản sinh các hoạt chất kháng khuẩn với hoạt chất kháng khuẩn rộng. Hiện nay, các loài Bacillus được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học và là tác nhân nitrat hóa, có khả năng phân hủy hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn thừa và chất thải khác nhờ khả năng tổng hợp enzyme phân hủy hữu cơ như protease, amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh như Vibrio, Aeromonas do chất lượng nước nuôi bị giảm. Chính vì vậy, các loài Bacillus là một trong những vi khuẩn không thể thiếu trong các chế phẩm sinh học để xử lý chất thải động vật. Để thu được những chủng giống vi khuẩn Bacillus có phẩm chất sinh học tốt đáp ứng yêu cầu của sản xuất các chế phẩm sinh học hay tạo ra các giống khởi động có chất lượng cao thì khân phân lập, chọn lọc đóng vai trò then chốt. Tuy nhiên, công việc chọn lọc này cũng rất tốn kém, đòi hỏi rất nhiều công sức và phụ thuộc rất nhiều vào công tác bảo quản giống sau phân lập. Các chủng giống được chọn lọc tự nhiên thường có sức sống tốt và có các đặc tính sinh học cao nhưng chúng rất dễ bị biến đổi đặc tính sinh học hoặc sinh những biến dị không mong muốn nếu khâu bảo quản và giữ giống không tốt. Hiện nay có rất nhiều các phương pháp bảo quản, giữ giống vi sinh vật hiệu quả như đông lạnh, đông khô…. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi Khoa CN & NTTS 3 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 phải có thiết bị, máy móc hiện đại mà nhiều phòng thí nghiệm trong nước chưa đáp ứng được. Vì vậy, các chủng giống sau phân lập chọn lọc vẫn được giữ giống với phương pháp truyền thống là cấy truyền trên thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 o C. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém nhưng lại có một số nhược điểm như thời gian bảo quản ngắn, dễ bị biến đổi đặc tính sinh học của giống hoặc gây thoái hóa giống. Xuất phát từ thực tế trên, để đánh giá sự biến đổi các đặc điểm về hình thái cũng như đặc tính sinh học của một số chủng Bacillus sử dụng làm chế phẩm sinh học trong chăn nuôi trong quá trình giữ giống, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá sự biến đổi chất lượng giống của một số chủng Bacillus trong thời gian bảo quản ở nhiệt độ 4ºC”. 1.2. MỤC ĐÍCH YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Theo dõi các chủng Bacillus trong quá trình bảo quản, đánh giá sự biến đổi đặc tính sinh học của chúng trong các điều kiện và khoảng thời gian khác nhau, từ đó xác định điều kiện thích hợp để bảo quản vi khuẩn Bacillus. 1.2.2. Yêu cầu Trong quá trình theo dõi đánh giá, vi khuẩn phải đạt được các yêu cầu: - Không có sự biến đổi về mặt hình thái. - Không có sự biến đổi về đặc tính sinh hóa. - Giữ được khả năng phân giải Protein. - Giữ được khả năng phân giải tinh bột. - Có khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Khoa CN & NTTS 4 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.2. VI KHUẨN BACILLUS VÀ VAI TRÒ TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC 2.2.1. Đặc điểm sinh học Theo mô tả trong khóa phân loại Bergey (2008), vi khuẩn Bacillus (B.) thuộc lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae. Đặc điểm của chung của họ này là các vi khuẩn hình gậy, bắt màu Gram dương, sinh nội bào tử, phần lớn có khả năng di động nhờ các lông roi xung quanh thân. Họ Bacillaceae sinh nội bào tử được chia thành 2 chi: - Chi sinh nội bào tử yếm khí là Clostridium - Chi sinh nội bào tử hiếu khí là Bacillus Chi Bacillus gồm các trực khuẩn Gram dương, nhưng khi nuôi cấy lâu chúng có thể bắt màu Gram âm khi nhuộm. Các trực khuẩn Bacillus là loài sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, sinh nội bào tử. Chúng có ở mọi nơi trong tự nhiên. Phần lớn các loài Bacillus không gây bệnh nhưng một số loài là nguyên nhân gây bệnh ở người và động vật như Bacillus anthracis (gây bệnh than Anthrax) và B. cereus (gây ô nhiễm thực phẩm). Một số loài Bacillus: a. Bacillus subtilis: Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872, là một loài thuộc chi Bacillus, thuộc họ Bacillacaea. B. subtilis là trực khuẩn có kích thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, đứng riêng rẽ, không tạo thành chuỗi; Bắt màu Gram dương, nhưng không đồng nhất; Có khả năng di động. Chúng sinh nội bào tử hình ovan, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm, có kích thước 1,5- 1,8 x 0,6-0,9µm. Phần lớn bào tử được hình thành sau 48h nuôi cấy và không làm phình tế bào. Ở điều kiện 100 o C, bào tử của B. subtilis chịu được 180 Khoa CN & NTTS 5 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. Trên môi trường thạch nghiêng, vi khuẩn mọc dày, khuẩn lạc khô đục mờ, rìa răng cưa hoặc lượn sóng. Mọc lan tràn, có màu trắng xám. Trên môi trường dịch thể: Môi trường trong, hình thành màng dày, dai, nhăn nheo, lượn sóng. B. subtilis có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein) để tạo thành vòng phân giải có đường kính lớn. Trong môi trường Litmus milk, chúng gây peptone hóa chậm và thường bị kiềm hóa Bacillus subtilis là loài tự dưỡng hiếu khí, một vài chủng sinh trưởng yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng từ 28-40 o C, tối đa là 50 o C, một số chủng có thể sinh trưởng ở 55 o C. Phân bố: trong đất, cỏ khô, các hợp chất hữu cơ bị phân hủy B. subtilis được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại enzyme, ví dụ như amylase được sử dụng để rũ hồ hàng dệt, làm biến hình tinh bột trong sản xuất giấy. B. subtilis cũng sản xuất các protease bao gồm subtilisin được sử dụng chất tẩy rửa và công nghiệp thuộc da. Tuy nhiên, đáng chú ý là B. subtilis được sử dụng để sản xuất nhiều loại kháng sinh như difficidin, oxydifficidin, bacilli, bacillomyin B và Bacitracin. Các loại kháng sinh này được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng da do vi khuẩn và ngăn cản sự nhiễm trùng do đứt tay hoặc bị bỏng. B. subtilis cũng được bán như là một sản phẩm probiotic thương mại ở nhiều nước châu Âu từ nhiều năm trước mặc dù sự hiểu biết về cơ chế tác động của chúng còn rất hạn chế (Green D.H và cộng sự, 1999) như chế phẩm Enterogermina ® được bán ở Italy vào những năm 1950 gồm 4 chủng B. clausii hoặc Bactisubtil ® có chứa B. cereus (Huynh và cộng sự, 2005). b. Bacillus licheniformis Là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,6-0,8x1,5-3µm, đứng riêng rẽ, không tạo thành chuỗi, có khả năng di động, sinh nội bào tử 0,6-0,9x1- Khoa CN & NTTS 6 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 1,5µm, hình cầu hoặc hình trụ, nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào, vách bào tử mỏng. Phần lớn bào tử xuất hiện sau 48 giờ nuôi cấy ở 37 o C, không làm phình thân tế bào. Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành những khuẩn lạc có kích thước lớn, lan tràn, bề mặt khô hoặc nhăn nheo, rìa phát triển dạng lông nhỏ, màu trắng đục. Nuôi cấy trong môi trường dịch thể: môi trường trong, có xuất hiện màng dày, dai, nhăn nheo. Có khả năng phân giải tinh bột và phân giải protein có nguồn gốc là gelatin và casein. Chúng sinh trưởng tốt ở nồng độ muối từ 5-8%, bị ức chế ở nồng độ muối cao. Là trực khuẩn hiếu khí, một số chủng sống yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 32-45 o C, tối đa từ 50-56 o C. Một số chủng B. licheniformis có khả năng sản sinh hoạt chất kháng khuẩn là Bacitracin. Cũng giống như B. subtilis, B. licheniformis được nuôi cấy để thu enzyme alkaline proteases (làm sạch không khí, làm mềm lông trong công nghiệp da, bột giặt sinh học…), alpha-amylases (biến tính tinh bột trong sản xuất giấy…); các hoạt chất kháng khuẩn như penicillinases, pentosanases, bacitracin, proticin, 5'-inosinic acid, inosine, citric acid, và L-tryptophan (Gherna et al., 1989). c. Bacillus megaterium Là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 1,2-1,5 x 2-4µm. Đứng riêng rẽ hoặc nối thành chuỗi ngắn. Có khả năng di động. Sinh bào tử hình elip nằm ở trung tâm hoặc lệch tâm tế bào. Vách bào tử mỏng, phần lớn bào tử xuất hiện sau 48h nuôi cấy. Bào tử không làm phình tế bào. Nuôi cấy trên môi trường thạch, hình thành khuẩn lạc lớn, dạng S, tròn trơn nhẵn bóng, bề mặt vồng lên, rìa gọn, không lan, dạng kem màu trắng ngà. Sinh trưởng trong môi trường dịch thể: môi trường đục, đồng nhất, có cặn, không xuất hiện màng trên bề mặt. Khoa CN & NTTS 7 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 B. megaterium được coi là trực khuẩn không có hại. Có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein). Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 28- 35 o C, tối đa từ 40-45 o C. B. megaterium được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất enzyme amidase, sử dụng cho sản xuất kháng sinh penicillin. d. Bacillus polymyxa Trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước 0,6-1 x 2-7µm, không tạo thành chuỗi. Có khả năng di động. Sinh bào tử hình elip, nằm ở trung tâm hoặc ở một đầu. Nuôi cấy trên môi trường thạch sinh khuẩn lạc nhỏ, mỏng, trong lan tràn, rìa phân thùy hoặc có dạng lông. Bề mặt thô nhám, màu trắng. Ở môi dịch thể, môi trường đục đồng nhất hoặc có cặn lơ lửng. Cặn keo dính, đôi khi trên bề mặt có màng. B. polymyxa không sinh trưởng ở môi trường có 5% NaCl. Chúng có khả năng phân giải tinh bột và protein (casein và gelatin), đường kính vòng phân giải rộng. Trong môi trường Litmus milk, gây đông vón sữa và có sinh khí. Các chủng B. polymyxa có thể sống hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện. Điều kiện nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 28-35 o C, tối đa là 40 o C, không sinh trưởng ở nhiệt độ 45 o C. Một số chủng B. polymyxa có khả năng sản sinh các hoạt chất kháng khuẩn là polymyxin. e. Bacillus cereus Là trực khuẩn hình gậy, hai đầu vuông, đứng thành chuỗi từ ngắn đến dài, xếp lộn xộn không theo một trật tự nào. Trực khuẩn bắt màu Gram dương, có khả năng di động và hình thành bào tử. Bào tử hình elip, nằm ở tâm hoặc lệch tâm tế bào, kích thước 1-1,5µm. Phần lớn các chủng hình thành bào tử sau 18-24h nuôi cấy, không làm phình thân tế bào. Nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, hình thành khuẩn lạc lớn, khô, bề mặt phẳng, rìa không đều, có xu hướng lan ra ngoài. Màu trắng ngà. Trong môi trường dịch thể, làm đục môi trường, đục nhiều, đồng nhất cặn mềm dễ tan, có hoặc không hình thành màng trên bề mặt. B. cereus có khả năng phân giải tinh bột và protein (gelatin và casein), sống hiếu khí, một số chủng là Khoa CN & NTTS 8 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 30 o C, đối đa từ 37-48 o C. Chúng phân bố nhiều trong đất, bụi, trong thực vật, sữa…, có khả năng gây bệnh ngộ độc thực phẩm cho người và động vật do ăn phải thực phẩm nhiễm B. cereus. f. Bacillus thuringiensis B. thuringiensis là trực khuẩn Gram dương, phân bố ở trong đất. Về mặt hình thái, tương tự như B. cereus. Trong quá trình hình thành bào tử B. thuringiensis hình thành các tinh thể protein có khả năng kháng côn trùng là δ-endotoxins (hay cry protein) được mã hóa bởi gen cry . Trong phần lớn các chủng B. thuringiensis các gen cry nằm trong plasmid. Vì vậy, bào tử và các tinh thể protein kháng côn trùng của B. thuringiensis đã được sử dụng như là một loại thuốc trừ sâu sinh học từ những năm 1920. Ngày nay chúng có tên thương mại là Dipel và Thuricide. Bacillus thuringiensis serovar israelensis, là một chủng được sử dụng rộng rãi để kiểm soát ấu trùng muỗi (lavicide). Tuy nhiên các chủng B. thuringiensis cũng sản sinh độc tố đường ruột enterotoxins, . 2.1.2. Vai trò của trực khuẩn bacillus trong sản xuất chế phẩm probiotics 2.1.2.1. Khái niệm về Probiotic Mặc dù khái niệm Probiotic đã được biết đến vào những năm đầu thế kỷ 20 tuy nhiên định nghĩa về probiotic vẫn chưa được đưa ra cho đến thập niên 60. Năm 1965, Lilly và Stillwel cho rằng, probiotic là “những chất do vi sinh vật tiết ra có khả năng kích thích sự tăng trưởng của những vi sinh vật khác” và hiểu rằng probiotic là một khái niệm đối lập với kháng sinh. Parker (1974) lại có quan điểm hoàn toàn khác về probiotic “đó là những vi sinh vật và các hoạt chất của chúng có vai trò cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột”. Fuller (1989) cũng theo quan điểm này, đưa ra định nghĩa về probiotic “là thức ăn bổ sung gồm các vi sinh vật sống có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng sinh thái đường ruột”. Havennar và Huis in’t Veld (1992) đã mở rộng định nghĩa về probiotic: “Là một vi sinh vật đơn lẻ hay hỗn hợp các Khoa CN & NTTS 9 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 vi sinh vật sống khi sử dụng cho người và động vật mang lại những ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện hệ sinh vật đường ruột. Trong năm 1996, Schaafsma quan niệm probiotic là “những vi sinh vật sống, khi tồn tại trong đường ruột với một số lượng nhất định sẽ mang lại những ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe vượt trội hơn so với các chất dinh dưỡng cơ bản vốn có”. Đứng trên quan điểm về miễn dịch và dinh dưỡng, Naidu và cộng sự (1999) cho rằng probiotic là “một dạng thức ăn bổ sung vi sinh vật mang lại những ảnh hưởng có lợi cho các hoạt động sinh lý của vật chủ do tăng cường hệ miễn dịch đường ruột cũng như cải thiện sự cân bằng về dinh dưỡng và cân bằng vi sinh vật trong đường ruột”. Theo Laurent Verschuere và cộng sự (2000) "Probiotics là sinh vật sống có ảnh hưởng tốt cho vật chủ nhờ vào sự biến đổi hệ sinh vật gắn với vật chủ hay xung quanh vật chủ, từ đó cải thiện khả năng sử dụng thức ăn, nâng cao khả năng chống bệnh của vật chủ, và cải thiện môi trường xung quanh". Tuy nhiên, đến năm 2001, FAO/WHO đã đưa ra một định nghĩa phù hợp nhất về probiotic như sau “probiotics là những vi sinh vật sống khi được đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ mang lại các lợi ích về sức khỏe cho vật chủ”. Định nghĩa này được đưa ra dựa trên những quan điểm sau: - Probiotics phải là những vi sinh vật sống. - Probiotics phải cung cấp các lợi ích về mặt sinh lý cho vật chủ, các lợi ích này phải được xác định qua thực nghiệm được tiến hành trên các vật chủ được lựa chọn - Probiotics không cần phải giới hạn về cách sử dụng (qua đường ăn hoặc uống) Ngày nay, các probiotics thường có những đặc điểm sau: - Là vi sinh vật sống - Tác động trực tiếp có lợi cho hệ tiêu hóa của người và động vật - Đề kháng lại với các yếu tố chế biến thức ăn. Khoa CN & NTTS 10 Trường đại học NN Hà Nội [...]... đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 Đột biến kiểu gen có thể làm thay đổi nhiều tính trạng của vsv, nhưng thường thấy là: - Thể đột biến bền vững với kháng sinh: gặp ở vk gây bệnh - Thể đột biến sinh hóa: sự đột biến của một số gen kiểm soát sự hình thành và hoạt động của một số enzyme chuyển hóa làm thay đổi nhu cầu về dinh dưỡng, kiểu lên men… - Thể đột biến hình thái: sự đột... TB chủng BS Các chủng Bacillus Bp, Bs nuôi cấy trên MT LB dịch thể Các chủng Bacillus Bc, Bm nuôi cấy trên MT LB dịch thể Hình 4.1 Đặc điểm hình thái và đặc tính nuôi cấy của một số chủng Bacillus trong thời gian bảo quản giữ giống Khoa CN & NTTS 32 Trường đại học NN Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đàm Thị Hoa-CNTYA K54 4.2 ĐÁNH GIÁ SỰ BIẾN ĐỔI CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS TRONG THỜI GIAN. .. vi sinh vật trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản - Một vòng que cấy chủng vi sinh vật bảo quản được đưa vào môi trường bằng thao tác vô trùng và giữ ở nhiệt độ thích hợp trong 72 giờ Phải kiểm tra sự phát triển của chủng bảo quản - Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC Thông thường, theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi 2 – 6... sau 90 ngày bảo quản Nếu thời gian bảo quản kéo dài hơn và cấy truyền nhiều đời hơn thì hoạt tính của enzyme amylase sẽ có khả năng mất đi hoàn toàn Vòng phân giải tinh bột của chủng Bs Phân giải tinh bột âm tính của chủng Bc sau 90 ngày bảo quản sau 90 ngày bảo quản Hình 4.3: Khả năng phân giải tinh bột của một số chủng Bacillus 4.2.3 Khả năng sinh trưởng ở các mức nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ nuôi cấy... khi quan sát tế bào học Trong tự nhiên, dù giữ trong điều kiện nào, tất cả các gen đều có đột biến, được gọi là đột biến tự nhiên hay ngẫu nhiên (spontanous mutation) Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít Các gen khác nhau của cùng một loài có thể có tần số đột biến khác nhau, nhưng tần số đột biến tự nhiên của mỗi gen là một số ổn định Ngoài thiên nhiên, hiện tượng đột biến của vi sinh vật xảy... lọc với mục đích sử dụng làm giống khới động sẽ được nuôi cấy trên môi trường thạch LB ở 37oC/2448h để giữ giống Kiểm tra tạp nhiễm giống trước khí bảo quản trong giống trong tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4oC Giống được cấy truyền 1 tháng một lần sang môi trường LB mới Trong quá trình bảo quản, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về hình thái, đặc tính sinh học của giống tại các thời điểm 0, 30, 60, 90 ngày... lạc của tất cả các chủng Bacillus đều không có sự biến đổi so với ban đầu trước khi bảo quản ở tất cả các thời điểm đánh giá Phần lớn khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus đều là khuẩn lạc dạng R (xù xì, khô nhám), chỉ có chủng Bm dạng S (tròn, trơn nhẵn bóng, rìa gọn, bề mặt vồng) Tương tự, kích thước khuẩn lạc của các chủng cũng không có sai khác so với thời điểm ban đầu trước khi bảo quản giữ giống Trong. .. Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu Đây là phương pháp nhanh và thuận lợi khi phải bảo quản số lượng mẫu lớn Thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 10 – 20 năm 2.3.4 Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh... sản, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội - Thời gian : từ tháng 01đến tháng 07 năm 2013 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1 Đánh giá sự biến đổi về mặt hình thái của vi khuẩn Bacillus trong thời gian giữ giống: - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc - Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn 3.2.2 Đánh giá sự biến đổi về đặc tính sinh học của các chủng Bacillus - Đánh giá khả năng phân giải Protein - Đánh giá khả năng phân... nhưng không phải đột biến nào cũng biểu hiện ra tính trạng bên ngoài Nếu đột biến có tính trội thì tính trạng đột biến sẽ thể hiện ngay, nhưng nếu gen đột biến có tính lặn thì tính trạng đột biến không thể hiện ra ngay mà nằm trong trạng thái lặn khá lâu Trong phòng thí nghiệm chỉ có một số ít chủng đột biến có thể quan sát được vì chỉ theo dõi được một số ít tính trạng như tốc độ sinh trưởng, hình thái . khích lệ của những người thân trong gia đình và bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn những tình cảm cao quý đó. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 08 năm 2013 Sinh viên Đàm Thị Hoa Khoa. đáp ứng yêu cầu của sản xuất các chế phẩm sinh học hay tạo ra các giống khởi động có chất lượng cao thì khân phân lập, chọn lọc đóng vai trò then chốt. Tuy nhiên, công việc chọn lọc này cũng. lập. Các chủng giống được chọn lọc tự nhiên thường có sức sống tốt và có các đặc tính sinh học cao nhưng chúng rất dễ bị biến đổi đặc tính sinh học hoặc sinh những biến dị không mong muốn nếu