Lời Cảm Ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Dược đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường. Đặc biệt, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô Đào Thị Cẩm Minh đã tận tình chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong Phòng Kiểm Nghiệm Thực Phẩm,Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, khích lệ giúp tôi vượt qua khó khăn trong thời gian tôi thực hiện đề tài. TT Huế, tháng 4 năm 2014 Trần Thị Nhật Linh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và do tôi thực hiện, không trùng lặp với bất kỳ luận văn nào trước đây. Người cam đoan Trần Thị Nhật Linh MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ BẠCH PHỤC LINH 2 1.2. VÀI NÉT VỀ POLYSACHARIDE DẠNG β –GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH 4 1.3. CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHIDE 5 1.4. VÀI NÉT VỀ QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 5 1.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 7 Chương 2 10 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 11 2.3. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 15 2.4. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 15 2.5. CÁC THUẬT TOÁN THỐNG KÊ 16 2.6. XỬ LÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16 Chương III 17 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1. KIỂM TRA THEO TIÊU CHUẨN DĐVN IV 18 3.2. KIỂM TRA HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE DẠNG β –GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH 20 Chương 4 29 BÀN LUẬN 29 4.1. VỀ VIỆC THIẾT KẾ MẪU 29 4.2. VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 4.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG β-GLUCAN 31 4.4. VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 Chương 5 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 42 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Bảng 2x2 các tần số quan sát O 17 Bảng 3.1. Bảng so sánh kết quả hai đợt thu mẫu 19 Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ glucose 22 Bảng 3.3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp 24 Bảng 3.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp 25 Bảng 3.5. Kết quả định lượng β-glucan trong các mẫu Bạch phục linh phân phối tại Thành Phố Huế 26 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của β - glucan 4 Hình 2.1. Dược liệu Bạch phục linh 10 Hình 2.2. Hình ảnh soi bột Bạch phục linh dưới kính hiển vi 12 Hình 2.3. Máy UV-VIS (Jasco V-630) 16 Hình 2.4. Máy quay li tâm (EBA 21) 16 Hình 3.1. Hình ảnh soi bột mẫu số 20 18 Hình 3.2. Các phản ứng định tính của mẫu 13 19 Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch D-glucose chuẩn-pp phenol sulfuric 22 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml). 22 Hình 3.5. Phổ đồ UV mẫu trắng 23 Hình 3.6. Phổ đồ UV mẫu dịch chiết Bạch phục linh không tạo màu 23 Hình 3.7. Phổ đồ UV của dung dịch D-glucose chuẩn có tạo màu 23 Hình 3.8. Phổ đồ UV của mẫu dịch chiết Bạch phục linh có tạo màu 23 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml). 24 Hình 4.1. Hình ảnh soi bột mẫu 6 34 Hình 4.2. Các dạng sơ chế Bạch phục linh 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nền Y học cổ truyền của Việt Nam có một lịch sử phát triển lâu dài và phong phú. Từ xưa, ông cha ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý giá của đất nước để phòng bệnh và chữa bệnh. Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, từ những kinh nghiệm do nhu cầu thực tiễn, số lượng dược liệu có nguồn gốc từ thực vật và động vật được đưa vào làm thuốc ngày càng gia tăng. Trong đó, Bạch phục linh là một trong những dược liệu phổ biến, được sử dụng trong y học từ lâu. Theo các tài liệu cổ và kinh nghiệm dân gian, Bạch phục linh có tác dụng lợi thủy, thẩm thấp, bổ tỳ, định tâm, chữa tiểu tiện khó khăn, thủy thũng, trướng mán, tiết tả…[4]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của của các hoạt chất trong dược liệu này cho thấy rằng Bạch phục linh có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, kháng viêm, kháng khối u.[21], [13], [15] Tuy nhiên, trên thị trường dược liệu này có nguy cơ không đảm bảo chất lượng do giả mạo bằng các hóa chất, chế phẩm thay thế. Theo kết quả kiểm tra của Bộ Y tế vào năm 2012, Bạch phục linh trên thị trường được làm giả khá nhiều, chủ yếu bằng calci carbonat [5], [2]. Thêm vào đó, việc kiểm tra ở các cơ sở khám chữa bệnh chỉ được thực hiện bằng cảm quan nên hiệu quả điều trị của dược liệu không được đảm bảo [1]. Nhằm giúp các nhân viên y tế, các nhà quản lý ngành y tế thành phố Huế có thêm thông tin về chất lượng thuốc đông y trên địa bàn chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Kiểm tra chất lượng Bạch phục linh phân phối tại thành phố Huế” với mục tiêu : • Kiểm tra chất lượng của Bạch phục linh theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV. • Xây dựng quy trình định lượng polysaccharides dạng β-glucan trong Bạch phục linh. 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BẠCH PHỤC LINH 1.1.1. Vài nét về Bạch phục linh: Bạch linh tên gọi khác là Phục linh, là thể quả nấm đã phơi hay sấy khô của nấm Phục linh - Poria cocos (Schw.) Wolf, họ Nấm lỗ (Polyporaceae), mọc ký sinh trên rễ một số loài Thông. • Phục linh bì: Là lớp ngoài Phục linh tách ra, lớn, nhỏ, không đồng nhất. Mặt ngoài từ nâu đến nâu đen, mặt trong màu trắng hoặc nâu nhạt. Chất tương đối xốp, hơi có tính đàn hồi. • Phục linh khối: sau khi tách lớp ngoài, phần còn lại được thái, cắt thành phiến hay miếng, lớn nhỏ không đồng nhất, màu trắng, hồng nhạt hoặc nâu nhạt. • Xích phục linh: Là lớp thứ hai sau lớp ngoài, hơi hồng hoặc nâu nhạt. • Phục thần: Là phần nấm Phục linh ôm đoạn rễ thông bên trong. • Bạch phục linh là phần bên trong màu trắng của thể nấm. Nấm phục linh là loại nấm được trồng ở Trung Quốc và đã được sử dụng trong y học trong khoảng 2000 năm [6]. Phục linh cũng như Bạch phục linh không những được sử dụng trong các bài thuốc đông y sử dụng trên lâm sàng mà còn được sử dụng để nghiên cứu bào chế các sản phẩm thuốc chiết xuất từ dược liệu. Nhiều nhà y học trên thế giới đã bắt tay vào nghiên cứu thành phần hoạt tính, tác dụng dược lí và hiệu quả trị liệu của Bạch phục linh. - Thành phần hoá học: [6]Gồm 3 loại + Các acid có thành phần triterpen : Acid pachimic, acid tumolosic, acid eburicoic, acid pinicolic, acid 3β hydroxylanosta-7,9 , 24 trien, 21-oic 3 + Các polysaccharide dạng β-glucan và heteropolysaccharides, trong đó polysaccharide dạng β-glucan chiếm trên 90%. + Ngoài ra còn có egosterol, histidin, cholin và rất ít men proteaza. - Tác dụng dược lý: + Theo các tài liệu cổ và kinh nghiệm nhân dân Bạch phục linh có tác dụng lợi thủy, thẩm thấp, bổ tỳ, định tâm, dùng chữa tiểu tiện khó khăn, thủy thủng, tiết tả, phục thần định tâm, an thần chữa mất ngủ.[6] + Một số nghiên cứu gần đây trên thê giới cho thấy Bạch phục linh chứa các hoạt chất có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, kháng viêm, kháng khối u.[14], [17], [23] Với những tác dụng trên, Bạch phục linh trở thành một một vị thuốc được sử dụng phổ biến trong nhiều bài thuốc và có nhiều khả năng ứng dụng trong điều trị các bệnh khó chữa. Nhưng trong tình hình hiện nay dược liệu này đang ngày càng bị làm giả một cách tinh vi bằng một số chất như các loại tinh bột, calci carbonat… làm cho công tác điều trị bệnh trở nên khó khăn, thiếu hiệu quả. 1.1.2. Chất lượng bạch phục linh trên thị trường Bạch phục linh là dược liệu nhập hoàn toàn từ Trung Quốc. Vì vậy, đây là dược liệu khó kiểm soát chất lượng. Trước đây loại dược liệu này thường bị làm giả bằng bột sắn, gạo,…[5] nên muốn kiểm tra chất lượng chỉ cần cho vào nước dược liệu sẽ bị nở ra. Nhưng theo một cuộc khảo sát chất lượng dược liệu của một số tỉnh thành của Vụ Dược Liệu vào năm 2012 cho thấy dược liệu Bạch phục linh được làm giả chủ yếu bằng calci carbonat [2], người ta trộn một ít bột vụn dược liệu Bạch phục linh với calci carbonat rồi đem dập thành các viên dạng hình khối vuông dẹt (Bạch phục linh thường được sơ chế thành dạng này), rất khó nhận biết bằng mắt thường, dược liệu này có thể có các phản ứng đặc 4 trưng của Bạch phục linh (được quy định trong Dược Điển Việt Nam IV) vì có một lượng nhỏ dược liệu nhưng chắc chắn chất lượng không đám bảo cho hiệu quả trị bệnh. 1.2. VÀI NÉT VỀ POLYSACHARIDE DẠNG β –GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH 1.2.1. Đặc điểm Polysaccharide trong Bạch phuc linh chủ yếu là dạng β –glucan – là hợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử D-glucose gắn với nhau qua liên kết β –glycoside ở vị trí 1,3 và 1,6. + Công thức phân tử: (C 6 H 10 O 5 ) n , n = 4,1x10 4 → 5x10 6 [18] + Độ hòa tan: không tan trong nước, tan trong dung dịch kiềm, Cadoxen, dung dịch ethylendiamin bão hòa trong cadmium oxyd.[18] + Cấu trúc phân tử :[23] Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của β - glucan 1.2.2. Tác dụng sinh học Vì polysaccharide có dạng β (1,3/1,6) –glucan cùng với độ dài mạch đặc trưng nên đây là hoạt chất có tác dụng sinh học cao[23], một số nghiên cứu trên invitro và trên động vật cho thấy chất này: + Có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch do khả năng kích thích tạo ra các tác nhân miễn dịch trong cơ thể .[23],[15] + Tác dụng kháng viêm: do khả năng ảnh hưởng lên sự có mặt của phospholipase (chất gây viêm) .[15] 5 + Tác dụng kháng khối u : gián tiếp tham gia vào quá trình tiêu diệt tế bào ung thư bằng cách kích hoạt hệ thống miễn dịch làm việc có hiệu suất và hiệu quả cao để tiêu diệt các tế bào ung thư mà không gây hại cho các tế bào lành khác.[17] 1.3. CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHIDE Phương pháp chiết xuất: Trong chiết xuất polysaccharide từ dược liệu, người ta thường sử dụng phương pháp chiết nóng với các dung môi thích hợp: + Phương pháp chiết nóng: chiết dược liệu trong dung môi thích hợp ở nhiệt độ 80-100 o C trong thời gian quy định, thu được dịch chiết, loại tạp. [8] Ngoài ra, để tăng cường hiệu suất chiết dược liệu, nhiều nhà nghiên cứu đã áp dụng sóng siêu âm trong chiết xuất.[22] Cơ chế tác động của sóng siêu âm trong ly trích: sử dụng sóng âm thanh có tần số và cường độ cao để truyền qua chất lỏng, giúp tăng cường sự xâm nhập của dung môi và nhiệt vào tế bào nguyên liệu do đó cải thiện tốt khả năng truyền khối. + Dung môi chiết xuất: thường sử dụng dung môi là nước dành cho các polysacchride tan, sử dụng dung dịch NaOH ở các nồng độ khác nhau (tùy vào độ dài mạch và độ phân cực) cho các polysaccharide không tan trong nước, ngoài ra còn sử dụng acid acetic, phenol [12],[22] Phương pháp định lượng: Thường sử dụng phương pháp đo quang UV-Vis với thuốc thử phenol- sulfuric, chất chuẩn là các đường đơn.[16],[7],[8] 1.4. VÀI NÉT VỀ QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến là phương pháp dựa trên khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ đi vào dung dịch của chất nghiên cứu trong [...]... lượng các hoạt chất chiếm tỷ lệ và hoạt tính sinh học cao trong Bạch phục linh để làm cơ sở cho các hoạt động kiểm tra chất lượng Bạch phục linh được tốt hơn.Vì vậy chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng hàm lượng polysaccharde dạng β-glucan trong Bạch phục linh Từ đó áp dụng định lượng cho các mẫu Bạch phục linh phân phối tại thành phố Huế 4.3.1 Mẫu đinh lượng: - Vì Bạch phục. .. 3.2 KIỂM TRA HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE DẠNG β – GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH 3.2.1 Xây dựng phương pháp: 3.2.1.1 Xử lý mẫu, chiết xuất dược liệu: - Sau khi thu mẫu, mẫu được kiểm tra chất lượng bằng các tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV, nếu kết quả kiểm tra mẫu là đạt mới tiến hành bước định lượng Vậy tiến hành định lượng trên 56 mẫu dược liệu Bạch phục linh - Dược liệu Bạch phục linh được xay nhỏ thành. .. NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm lấy mẫu - Dược liệu Bạch phục linh được bán tại các nhà thuốc Bắc trên địa bàn thành phố Huế - Dược liệu Bạch phục linh được cấp phát tại các cơ sở khám chữa bệnh y học cổ truyền tại thành phố Huế Hình 2.1 Dược liệu Bạch phục linh 2.1.2 Số lượng mẫu nghiên cứu [9] Cỡ mẫu được tính dựa vào sự khác biệt giữa số đo của mẫu và tham số... nhận thấy rằng Bạch phục linh thường được làm giả tinh vi bằng cách trộn một ít bột vụn của Bạch phục linh 31 với các chất giả mạo rồi đem dập thành phiến hình khối vuông dẹt (cách sơ chế thông thường của nấm Bạch linh) Vì vậy việc định tính hay soi bột khó có thể xác định chính xác chất lượng thực sự của Bạch phục linh Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành xây dựng quy trình định lượng hoạt chất chính... tiêu chuẩn của kiểm tra chất lượng dược liệu Bạch phục linh bao gồm soi bột, định tính, xác định độ ẩm, tỷ lệ vụn nát , tỷ lệ tạp chất. [3] + Vì các tạp chất để làm giả Bạch phục linh thường không thể phát hiện bằng mắt thường nên chúng tôi tiến hành các bước định tính tạp chất theo các chuyên luận riêng trong Dược Điển Việt Nam IV, một số các tạp chất thông thường dùng làm giả Bạch phục linh như các... cho việc so sánh sự ảnh hưởng của điều kiện thời tiết (nhiệt độ, độ ẩm) tại hai thời điểm thu mẫu đối với chất lượng Bạch phục linh 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1 Kiểm tra chất lượng Bạch phục linh theo các tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam IV [2] Soi bột Màu trắng tro, có những khối sợi nấm dạng hạt không đều và những khối phân nhánh, không màu, nhỏ dung dịch cloral hydrat, sẽ tan dần Soi kính... UV mẫu dịch chiết Bạch phục linh không tạo màu Mẫu 3 Mẫu 4 Hình 3.7 Phổ đồ UV của dung Hình 3.8 Phổ đồ UV của mẫu dịch chiết Bạch phục linh có tạo màu dịch D-glucose chuẩn có tạo màu Nhận xét: mẫu trắng và mẫu dịch chiết Bạch phục linh chưa tạo màu không có cực đại hấp thụ tại 490 nm, trong khi đó mẫu dung dịch chuẩn và mẫu dịch chiết Bạch phục linh đã tạo màu đều có cực đại hấp thụ tại 490 nm chứng... pháp, chúng tôi áp dụng định lượng hoạt chất β-glucan trong các mẫu dược liệu Bạch phục linh , kết quả được trình bày trong bảng : Bảng 3.5 Kết quả định lượng β-glucan trong các mẫu Bạch phục linh phân phối tại Thành Phố Huế STT của mẫu Lượng Lượng cao Hàm lượng β- (phụ lục) dược liệu polysaccharide (%) glucan (%) (so với 2 3 4 5 9 11 13 14 15 17 18 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 34 (g) 5 5 5 5 5 5... tôi đã tiến hành xây dựng quy trình định lượng hoạt chất chính là polysacchride dạng β-glucan trong Bạch phục linh 4.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG β-GLUCAN - Hiện nay trên thị trường Việt Nam Bạch phục linh hầu hết vẫn được nhập từ Trung Quốc nên chất lượng khó đảm bảo, thực tế đã cho thấy Bạch phục linh được làm giả mạo rất tinh vi nên việc sử dụng các bước định tính thông thường trong Dược Điển... tạp chất Rây qua rây 3,150mm Cân toàn bộ dược liệu lọt qua rây Xác định tỷ lệ vụn nát (x%) của dược liệu theo công thức: x% = a/p.100 14 Trong đó: a là khối lượng dược liệu cân ban đầu p là khối lượng dược liệu lọt qua rây 2.2.2 Định lượng polysacchride dạng β-glucan trong Bạch phục linh: 2.2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng β-glucan trong Bạch phục linh . thành phố Huế có thêm thông tin về chất lượng thuốc đông y trên địa bàn chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Kiểm tra chất lượng Bạch phục linh phân phối tại thành phố Huế với mục tiêu : • Kiểm. quả định lượng β-glucan trong các mẫu Bạch phục linh phân phối tại Thành Phố Huế 26 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của β - glucan 4 Hình 2.1. Dược liệu Bạch phục linh 10 Hình. Dược liệu Bạch phục linh được bán tại các nhà thuốc Bắc trên địa bàn thành phố Huế. - Dược liệu Bạch phục linh được cấp phát tại các cơ sở khám chữa bệnh y học cổ truyền tại thành phố Huế. Hình