Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về enzyme α-amylase. 1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme α-amylase [1, 2]. - Là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết α – 1,4 – glucoside một cách ngẫu nhiên ở vị trí bất kì nhưng chủ yếu tập trung giữa mạch amylose và amylopectin nên nó thuộc loại endo – enzyme. Các α-amylase được phân loại theo hoạt động và tính chất của chúng , α- amylase thủy phân tinh bột tạo thành sản phẩm là các dextrin phân tử nhỏ, maltose và glucose. Tuy nhiên, tùy nguồn gốc mà α-amylase từ các vi sinh vật có thể có sản phẩm thủy phân theo tỷ lệ các thành phần không giống nhau (Forgaty 1990) [1]. - Một số α-amylase tạo maltose: khi sử dụng α-amylase từ nấm mốc Asp.oryzae các sản phẩm chính của quá trình thủy phân thường là maltose và maltotriose ; α-amylase từ Streptomyces hygroscopicus là một endo – enzyme có thể thủy phân tinh bột tới 75 -85 % sản phẩm chứa maltose. Enzyme này còn có hoạt tính transglycosylase, maltotriose được chuyển thành maltotetraose sau đó thủy phân thành maltose mà không tạo ra glucose; α- amylase ngoại bào của chủng Thermonospora có khả năng thủy phân tinh bột cho sản phẩm chính là glucose và maltose (Forgaty 1990, Neidleman 1991) [2]. 1.1.2 Cấu tạo của α-amylase [1, 2, 3, 4] . Cấu tạo của α-amylase gồm ba tiểu đơn vị, A là tiểu đơn vị lõi được nối với tiểu đơn C có cấu trúc 8 đoạn β – sheet, tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β – sheet được lồng vào tiểu đơn vị A. Tiểu đơn vị B quyết định hoạt tính enzyme và liên kết enzyme – cơ chất. Nó cũng ảnh hưởng đến isoform và các tính chất đặc biệt của isoform này. Có một ion Ca 2+ nối giữa tiểu đơn vị A và B. Tuy nhiên, ở α-amylase của nấm mốc, liên kết này yếu và có thể bị hạn chế (Brzozowski 1997, 2000, Ferrari 1993, Marco 1996). Trang 1 Luận văn tốt nghiệp Tâm hoạt động: - Có chứa một số gốc acid amin đặc hiệu. Thông thường các nhóm đặc hiệu của nó là nhân imidazol và nhóm hydroxyl. - α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. - Protein của các α-amylase có tính chất của acid yếu và tính chất của globulin. - Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 – 5,7. Phân tử lượng của các α-amylase từ các nguồn khác nhau rất gần nhau (của nấm mốc 45000 – 50000, của malt 59000). Thành phần acid amin: - α-amylase từ các nguồn khác nhau có các thành phần acid amin khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, song chúng đều khá giàu tyrosin và tryptophan. - Các acid glutamic và aspartic chiếm gần ¼ tổng lượng acid amin cấu thành phân tử enzyme. - Trong α-amylase rất ít methinonine và chỉ có khoảng 7- 10 gốc cystenie trừ α- amylase của Bac.subtilis không có các liên kết sulfuahydryl và disulfuahydryl. - Trong thành phần acid amin của α-amylase của Asp.oryzae có chứa ít arginine và histidine nên cũng chứa ít nhóm amin và hàm lượng nito, do đó chúng mang tính acid hơn. Phần lớn α-amylase có phân tử lượng tương đối gần nhau (khoảng 40000 Da) song có những trường hợp như α-amylase của B.stearolthermophilus có phân tử lượng là 15600 Da (Campbell, Manning1964). Người ta nhận thấy rằng phân tử lượng của α- amylase giảm đi (chỉ còn khoảng 14000 đến 15000) còn hàm lượng Ca lại tăng theo nhiệt độ nuôi vi sinh. Không giống các α-amylase khác, α-amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol manose, 1 mol glucose, 2 mol hexoseamin trên 1 mol enzyme (Akabori và cộng sự, 1955). Vai trò của các polyose này vẫn chưa rõ, song người ta đã biết rằng nó không tham gia vào thành phần trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme. Calcium và vai trò của nó trong phân tử α-amylase [5]: Trang 2 Luận văn tốt nghiệp - α-amylase là một metalloenzyme (enzyme cơ kim). Các α-amylase đều chứa từ 1 – 30 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi phân tử enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme (Molodova, 1965). - Calcium còn bảo đảm độ bền của α-amylase đối với tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân hủy protein. - α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Đặc tính này có thể liên quan đến hàm lượng calcium trong phân tử của nó. - α-amylase của vi khuẩn ưa nhiệt có chứa calcium nhiều hơn của α-amylase từ nấm mốc nên nó bền nhiệt hơn. - Ion Ca 2+ làm ổn định α-amylase của malt, của vi sinh vật (trong đó có cả 3 loại α- amylase từ Asp.flavus, Asp.awamori, Asp.oryzae). α-amylase từ Asp.awamori và từ Asp.oryzae được ổn định bởi Al 3+ , ion sắt ức chế hoạt động của α-amylase từ Asp.awamori và từ Asp.oryzae. Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng ( Cu 2+ , Hg 2+ , Ag + …). Các kim loại như Li + , Na + , Mg 2+ , Cr 3+ , Mn 2+ , Zn 2+ , Co 2+ , Cd 2+ , Sn 2+ không ảnh hưởng mấy đến α-amylase. 1.1.3 Cơ chất của enzyme α-amylase [6, 7]. Cơ chất của quá trình thủy phân: gồm các polysaccharide chứa các liên kết α – 1,4- glucoside và chủ yếu là các glucan: tinh bột và glycogen (tinh bột động vật). 1.1.3.1 Tinh bột. - Tinh bột bao gồm hai cấu tử là amylose và amylopectin, các chất này khác hẳn nhau về tính chất lý học và hóa học. Amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin lại tạo màu tím đỏ. Chúng cũng khác nhau về tính hòa tan. Amylose dễ hòa tan trong nước Trang 3 Luận văn tốt nghiệp ấm và tạo dung dịch có độ nhớt không cao còn amylopectin chỉ tan trong nước nóng và tạo dung dịch có độ nhớt cao. Về phân tử lượng cũng có sự khác biệt rõ rệt. Amylose có phân tử lượng từ 3.10 5 – 10 6 , còn amylopectin có phân tử lượng từ 5.10 4 – 10 6 . Trong tinh bột tỷ lệ amylose và amylopectin thường là 1:4. - Về cấu tạo: hai thành phần trên đều có chứa các đơn vị cấu tạo là glucose. Trong amylose các gốc glucose được gắn với nhau nhờ liên kết α – 1,4 – glucoside tạo nên một chuỗi dài gồm 200 – 1000 gốc glucose. Phân tử amylose bao gồm một số chuỗi xếp song song nhau, trong đó các gốc glucose cuộn lại theo hình xoắn ốc. Mỗi chuỗi amylose có một đầu không khử và một đầu khử. - Trong phân tử amylopectin, các gốc glucose không những gắn với nhau nhờ liên kết α – 1,4 – glucoside mà còn nhờ liên kết α – 1,6 – glucoside. Vì thế mà nó có cấu trúc nhánh. Phân tử amylopectin chỉ có một đầu khử duy nhất. Người ta còn tìm thấy trong thành phần của phân tử amylopectin còn có một ít phospho. Phospho được gắn vào nguyên tử cacbon thứ sáu của gốc glucose. 1.1.3.2 Glycogen - Là polysaccharide dự trữ của cơ thể người và động vật. Vì vậy, người ta coi nó là polysaccharide đặc trưng của động vật hay “tinh bột động vật”. - Ngoài ra, người ta còn phát hiện nó ở các nguồn khác nhau như nấm mốc, nấm men và ở một vài loại hạt ngô. Glycogen có vai trò quan trọng trong chuyển hóa glucid ở cơ thể động vật và ở nấm men khi lên men rượu. Nó hòa tan được trong nước nóng. Khi tác dụng với iod sẽ cho màu đỏ tím hoặc màu đỏ nâu giống màu của amylopectin với iod. - Phân tử lượng của glycogen xê dịch trong một khoảng khá lớn và có thể đạt tới 4.10 6 tương ứng với số gốc glucose khoảng 24000. - Glycogen có cấu tạo gần giống với amylopectin của tinh bột nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn. Trong phân tử của glycogen cũng có liên kết α – 1,4 – glucoside và α – 1,6 – glucoside nhưng liên kết α – 1,6 – glucoside nhiều hơn ở amylopectin. Các đoạn mạch phía trong và ngoại vi của glycogen ngắn hơn của amylopectin. Chiều dài trung bình của các đoạn mạch nhánh chỉ có 12 – 14 gốc glucose. Trang 4 Luận văn tốt nghiệp 1.1.4 Cơ chế xúc tác [1, 2, 8]. Cơ chế phản ứng thủy phân tinh bột: - Không phụ thuộc nguồn gốc của chất xúc tác, mỗi khi mối liên kết α – 1,4 – glucoside bị phân cắt thì tại ngay điểm đó lập tức được liên kết với các nhóm ion của nước. - Khảo sát quá trình thủy phân tinh bột ở trong môi trường giàu nước bởi enzyme α- amylase , người ta thấy rằng, các chất xúc tác bẻ gẫy mối liên kết glucoside giữa cacbon số 1 (C 1 ) với nguyên tử oxy. Ở mạch amylose, khi mối liên kết α – 1,4 – glucoside bị phân cắt thì nhóm hydroxyl (OH - ) của nước sẽ liên kết với cacbon số 1 (C 1 ) của gốc glucoside bên trái, còn cation hidro (H + ) sẽ liên kết với O - ở nguyên tử C 4 ở gốc glucoside bên phải. Đối với mạch amylopectin, khi mối liên kết α – 1,6 – glucoside bị cắt đứt, thì nhóm OH - của nước sẽ liên kết với nguyên tử C 1 ở mạch chính, còn H + sẽ liên kết với O - ở nguyên tử C 6 ở mạch nhánh. - Một cách tổng quát, nếu tất cả các mối liên kết glucoside của tinh bột bị phân cắt (bao gồm n gốc) thì cần có (n – 1) phân tử nước để liên kết với chúng và sẽ tạo ra n phân tử đường glucose. Nhưng vì n là đại lượng lớn cho nên hiệu số n và (n-1) có thể xem là không đáng kể. Lúc đó phương trình thủy phân tinh bột có thể biểu diễn: ( C 6 H 10 N 5 ) n + n H 2 O  n C 6 H 12 O 6 - Nếu chỉ tính cho một gốc glucose thì có thể viết ngắn gọn: C 6 H 10 N 5 + H 2 O  C 6 H 12 O 6 162 18 180 Từ đây ta có thể rút ra kết luận: lượng glucose thu hồi theo lý thuyết từ phản ứng thủy phân hoàn toàn tinh bột bằng 111,11% lượng cơ chất tham gia ở đầu vào. - Trong thực tế, sản phẩm thủy phân của tinh bột thường tính theo lượng đường maltose, lúc đó sự cân bằng sản phẩm có thể tính theo phương trình: ( C 6 H 10 N 5 ) n + n/2 H 2 O  n/2 C 12 H 22 O 11 Trang 5 Luận văn tốt nghiệp n162 n/2. 18 n/2 . 342 - Một đặc điểm quan trọng của liên kết glucoside trong các polysaccharide là chỉ có các electron δ mà không có các electron π tham gia. Trong trường hợp như vậy, đóng vai trò phân cực là electron δ. Do hiệu ứng cảm ứng của nguyên tử oxy trung tâm còn gây ra một sự tập trung điện tích nào đó trên nguyên tử oxy, nên nó tích điện âm. - α-amylase từ các nguồn khác nhau có rất nhiều điểm giống nhau. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột chưa hồ hóa nhưng với tốc độ rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá tình nhiều giai đoạn [1,8]: - Ở giai đoạn đầu – giai đoạn dextrin hóa – chỉ một số liên kết trong phân tử có thể bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột bị giảm nhanh (cả amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). - Ở giai đoạn thứ hai – giai đoạn đường hóa- các dextrin phân tử thấp vừa mới tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose không tạo màu với iod. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. - Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 -7 gốc glucose ( 6 -7 gốc glucopyranose một). Sau đó các polyglucose này lại bị phân cắt tiếp tục nên các polyglucose này cứ ngắn dần lại và bị phân giải chậm đến maltotetraose, maltotriose và maltose. - Qua một thời gian dài dưới tác động của α-amylase, sản phẩm thủy phân của α- amylase chứa 13% glucose và 87% maltose. - Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng tương tự, nhưng vì α-amylase không phân cắt được liên kết α – 1,6 – glucoside ở chổ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng ngoài các đường nói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin thấp phân tử và isomaltose (8%). Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu tạo ra dextrin thấp phân tử không cho màu với iod và một ít maltose. Vì vậy, Trang 6 Luận văn tốt nghiệp người ta thường gọi nó là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Sơ đồ biểu diễn cho sự thủy phân này như sau: Tinh bột + Maltos e + Glucose Glycoge n nhiều ít Nhận định này đã tồn tại trong thời gian khá dài. Tuy nhiên, sau đó người ta tìm thấy rằng trong nấm mốc có α-amylase vừa biểu lộ hoạt tính dextrin hóa cao vừa tạo một lượng đường lớn glucose và maltose. Pakumuro và cộng sự cho rằng trong số các α-amylase của vi khuẩn có loại α- amylase dextrin hóa, có loại α-amylase đường hóa. Khi thủy phân tinh bột bằng α- amylase đường hóa thì có tới 60% (và hơn nữa) tinh bột bị phân giải, còn bằng α-amylase dextrin hóa thì mức độ depolymer hóa không vượt quá 30 – 40% (Robyt, Prench, 1977). So với α-amylase của nấm mốc, α-amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa vượt trội hơn là hoạt lực đường hóa. Theo số liệu của Lifsitx và Braznitsenco, khả năng dextrin hóa của chế phẩm enzyme từ asp.oryzae cao hơn khả năng đường hóa 1,75 lần, còn ở Bac.subtilis thì cao hơn 2 lần (2000). α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột không còn nguyên, còn α-amylase của vi khuẩn lại có khả năng phân hủy các hạt tinh bột chưa được hồ hóa lần hồ tinh bột (Brovaretx,Popadicts và đồng sự, 1967). Chế phẩm α-amylase của B.subtilis phân giải hạt tinh bột chưa được hồ hóa 2 -2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc ( Lixink, Popadicts, 2001). Ở các giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác dụng của α-amylase từ vi khuẩn. Dextrin do α-amylase của vi khuẩn tạo ra khi phân giải tinh bột có mạch dài hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc. Trang 7 + H 2 O  Luận văn tốt nghiệp α-amylase của vi khuẩn Bac.subtilis tác dụng lên amylose tạo ra các dextrin có mạch dài khoảng 6 – 8 gốc glucose ( G 6 , G 7 , G 8 ). Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ: G 6  G 1 + G 5 G 7  G 1 + G 6 Hay G 2 + G 5 G 8  G 2 + G 6 Hay G 3 + G 5 (Robyt, French) Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân amylose là glucose và maltose. Đối với α- amylase của vi khuẩn, tỷ lệ glucose : maltose thu được là 1 : 5; còn đối với α-amylase của nấm mốc tỷ lệ này là 1 : 3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1987). Fenikxova và Ermosina cho biết rằng các maltopentaose và maltohexaose thủy phân theo sơ đồ sau: G 5  G 1 + G 4 G 6  G 2 + G 4 Hay 2G 3 Hay G 5 + G 1 α-amylase của nấm mốc và vi khuẩn không tấn công liên kết α – 1,6 – glucoside của amylopectin nên khi thủy phân, nó sẽ tạo thành các dextrin giới hạn phân nhánh. Sản phẩm đầu tiên của sự phân giải amylopectin bởi α-amylase vi khuẩn là dextrin có 6 gốc glucose, còn sản phẩm cuối cùng là glucose, maltose và các maltodextrin (saccharide có phân nhánh) từ các maltodiose đến maltohexaose. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của α-amylase của nấm mốc chủ yếu là maltose, tiếp đến là maltotriose (Sproster, Uhlig, 1987). Nếu dùng nồng độ α-amylase vi sinh vật tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 -85% tinh bột thành đường lên men. Với α-amylase vi khuẩn, tinh bột bị thủy phân thành glucose và maltose đến 70 -75%. Còn với α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể đến 84 – 87%. Vận tốc thủy phân tinh bột bởi α-amylase vi khuẩn Bac.subtilis ở giai đoạn đầu cao hơn α-amylase Asp.oryzae tới 20% và giảm mạnh khi đạt được 30 – 32% sự thủy phân. Trang 8 Luận văn tốt nghiệp 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme α-amylase [1, 4, 8, 9]. Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH: - α-amylase từ nấm mốc có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5 – 4,8 ; pH tối thích của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,7 – 5,4) và của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 ( hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 – 7,0). - Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm α-amylase từ Asp.oryzae giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2 (2000). Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 – 7,0 (2001). - Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α-amylase của nấm mốc Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH 3,6 và nhiệt độ 0 0 C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 – 30 phút; α- amylase của vi khuẩn bị vô hoạt 50%; trong khi đó hoạt lực của α-amylase từ nấm mốc hầu như không giảm bao nhiêu (Fenikxcova, Ermoshina, 2005). - Trong dung dịch α-amylase của nấm mốc được bảo quản tốt ở pH 5,0 – 5,5; α- amylase dextrin hóa của nấm mốc đen có thể chịu được pH 2,5 – 2,8. Ở 0 0 C và ở pH 2,5 nó chỉ bị vô hoạt sau một giờ (Bernfeld, Okazaki, Kitahara, Kurushima, Ermoshina, 2005). - Ngoài α-amylase không bền acid ra, các loại nấm mốc Asp. Awamori, Asp. Butatea, Asp.usamii còn tạo ra tới 5 – 10% α-amylase bền acid. Trong khi đó nấm mốc Asp.niger 475 lại chỉ tạo ra các α-amylase bền acid. Nó không bị mất hoạt tính ở pH 2,5; nhiệt độ 30 0 C trong vòng 1 giờ. Bảng 1.1: Độ bền acid của α-amylase mốc đen [8]. Trang 9 Luận văn tốt nghiệp Chủng Hoạt độ dextrin hóa tổng số (đv/ml) Hoạt độ dextrin hóa bền acid (đv/ml) Hoạt độ dextrin hóa bền acid, % hoạt độ tổng số Asp.awamori 0,5 0,08 16 Asp.usamii 45 0,43 0,1 23 Asp.usamii 45 – 56 0,5 0,11 22 Asp.usamii 45 – 21 0,4 0,06 15 Asp.niger 475 0,35 0,34 97 - Ở pH < 4,0 α-amylase của vi khuẩn bị vô hoạt hoàn toàn (Virits, 1996). Theo Uhlig, α-amylase của nấm bền ở vùng pH 5,3 – 8,0 còn α-amylase của vi khuẩn bền ở khoảng pH 5,0 – 10,0 (2000). Nhiệt độ: - Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy với tác động của nhiệt, nhiệt độ tối thích của nó là 50 0 C, α-amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58 – 60 o C. Trong sản xuất rượu người ta thường đường hóa bằng canh trường nấm mốc ở 50 – 52 o C, và bằng malt ở 60 – 65 o C, α-amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả. Nhiệt độ tối thích của nó là 70 – 75 o C (Liphsis, Bragnitsenko, 1997), α- amylase của Bac.stearothermophilus… vẫn giữ được hoạt lực trong một thời gian dài ở 85 o C và cao hơn nữa (Manning Campbell, Karpukina, 2001). - α-amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 92 o C trong khi đó α-amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 70 o C (Kozmina, 2002). Trong dung dịch hồ tinh bột, α-amylase của vi khuẩn chỉ bắt đầu vô hoạt nhanh khi nhiệt độ cao hơn 77 0 C. Ở 70 0 C, α-amylase của nấm mốc đã bị mất 50% hoạt lực, còn α-amylase của malt hầu như chưa bị mất hoạt lực. Trang 10 [...]... ĐỊNH α- AMYLASE Phương pháp liên kết cộng hóa trị hay phương pháp hấp phụ Thể tích enzyme Thời gian cố định Vận tốc máy lắc Kích thước chitosan Nồng độ glutaradehyde CHỌN ĐIỀU KIỆN CỐ ĐỊNH α- AMYLASE TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CỐ ĐỊNH α- AMYLASE GHIÊN CỨU ENZYME CỐ ĐỊNH Hình 2.1:Sơ đồ nghiên cứu cố định enzyme α- amylase pH Ảnh hưởng của Ảnh hưởng của nhiệt độ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT α- AMYLASE CỐ pháp cố định enzyme. .. cơ chất [S] mà tại đó hoạt tính enzyme α- amylase là cao nhất 2.2.6.4 Khảo sát khả năng tái sử dụng enzyme α- amylase cố định Thí nghiệm khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme α- amylase cố định được tiến hành như sau: enzyme cố định được sử dụng lặp đi lặp lại 10 lần để thủy phân tính bột với thành phần không thay đổi như sau: - 25ml dung dịch tinh bột 1% 1g chế phẩm α- amylase cố định Nhiệt độ thủy... nhiệt độ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT α- AMYLASE CỐ pháp cố định enzyme α- amylase Tính chất động học 2.2.2 Phương ĐỊNH Hiệu quả tái sử dụng Chúng tôi sẽ tiến hành cố định enzyme α- amylase theo 2 phương pháp: - Cố định α- amylase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị - Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết giữa các enzyme 2.2.2.1 Cố định α- amylase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị - Hoạt hóa chitosan:... của α- amylase (đơn vị hoạt độ /mg protein trong chế phẩm tự do hay cố định) G: lượng đường khử tạo thành do phản ứng thủy phân (mg) m2: lượng protein α- amylase đã dùng để thủy phân (mg) Hoạt tính còn lại của chế phẩm enzyme cố định: Với: Urcđ là hoạt tính riêng của α- amylase cố định (đơn vị hoạt độ/mg protein αamylase cố định ) Urht là hoạt tính riêng của α- amylase tự do (đơn vị hoạt độ/mg chế phẩm αamylase)... chứa α- amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao, α- amylase được sử dụng trong phân tích cyclodextrin 1.2 Sơ lược về enzyme cố định 1.2.1 Giới thiệu 1.2.1.1 Định nghĩa [12] Enzyme cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa: - Nghĩa hẹp: enzyme không hòa tan là enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng với môi trường dung dịch phản ứng Pha enzyme. .. chất của enzyme α- amylase cố định 2.2.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme α- amylase Trang 32 Luận văn tốt nghiệp - pH có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme cố định Vì vậy, trong thí nghiệm này, mục đích chúng tôi là khảo sát ảnh hưởng của pH và tìm ra pH tối ưu cho hoạt động của enzyme cố định - Chúng tôi tiến hành thí nghiệm như sau: cố định các yếu tố như nồng độ enzyme cố... định các yếu tố như nồng độ enzyme, thời gian phản ứng….cho nhiệt độ dung dịch thay đổi từ 60 – 90oC và xác định hoạt tính của enzyme α- amylase cố định và tự do với mỗi nhiệt độ đó 2.2.6.3 Khảo sát tính chất động học của enzyme α- amylase cố định trên màng chitosan - Trong nghiên cứu này, chúng tối tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của enzyme α- amylase cố định Để khảo sát... kiềm hay phía acid so với pH tối ưu của enzyme không tan Trang 26 Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Enzyme α- amylase - Enzyme α- amylase của hãng Novo, dạng lỏng, là α – amylase bền nhiệt, được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis - α – amylase là một endo – amylase, có tác dụng thủy phân lien kết 1,4 - α – glucoside trong phân từ amylose và... các nhà nghiên cứu đã tìm hiểu và thấy rằng thành phần amylose , amylopectin và cấu trúc tinh bột cũng là những yếu tố ảnh hưởng khá mạnh đến tác dụng thủy phân của enzyme α- amylase Nguồn tinh bột khác nhau cùng ảnh hưởng đến quá trình thủy phân khác nhau 1.1.6 α- amylase từ vi khuẩn Bac.licheniformis [3, 10] - Bacillus được xem là giống vi sinh vật quan trọng nhất để sản xuất α- amylase trong công nghiệp... Thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc đảo và kích thước chitosan là những giá trị tối ưu của những thí nghiệm trước 2.2.4 Xác định hiệu xuất cố định enzyme α- amylase - Hiệu suất của quá trình cố định được tính theo công thức sau: Với: m: là hàm lượng protein enzyme có trong thể tích enzyme ban đầu (mg) m1: là hàm lượng protein enzyme không liên kết (mg) 2.2.5 Xác định hoạt tính riêng α- amylase . nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về enzyme α- amylase. 1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme α- amylase [1, 2]. - Là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết α – 1,4 – glucoside một cách ngẫu nhiên. tử α- amylase [5]: Trang 2 Luận văn tốt nghiệp - α- amylase là một metalloenzyme (enzyme cơ kim). Các α- amylase đều chứa từ 1 – 30 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi phân tử enzyme. của α- amylase, sản phẩm thủy phân của α- amylase chứa 13% glucose và 87% maltose. - Tác dụng của α- amylase lên amylopectin cũng tương tự, nhưng vì α- amylase không phân cắt được liên kết α – 1,6