ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  . LÊ HỒNG PHÚ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYM PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN Chuyên ngành: Hóa Sinh Mã số chuyên ngành: 1.05.10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2012 Cơng trình hồn thành tại: Bộ mơn Sinh Hóa, Khoa Sinh học ĐH KHTN, 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, TP.HCM Bộ môn CNSH, Đại học Bách Khoa Tp.HCM 268 Lý Thường Kiệt, Q.10, P.5, TP HCM PTN CNSH 701, 702 & 502 Khoa CNSH, Đại học Quốc Tế - ĐHQG TP.HCM, Khu phố 6, P.Linh Trung, Thủ Đức, TP.HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Phản biện 1: PGS TSKH Ngô Kế Sương Phản biện 2: PGS.TS Quyền Đình Thi Phản biện 3: TS Nguyễn Hữu Phúc Phản biện độc lập 1: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng Phản biện độc lập 2: TS Võ Thị Hạnh Phản biện độc lập 3: TS Nguyễn Thị Thanh Kiều Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp ………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………… Vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự nhiên MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài: Tại Việt Nam, cà phê có mặt gần 150 năm, từ đến nay, sản lượng cà phê tăng gấp 100 lần, đứng thứ hai số nước sản xuất cà phê, đứng đầu sản xuất cà phê vối Coffea robusta Xuất cà phê năm mang lại cho đất nước ta hàng trăm triệu la, chí tỉ la Mỹ (1,47 tỉ USD năm 2010) Chúng ta chế biến cà phê chủ yếu theo phương pháp truyền thống cho chất lượng cà phê trung bình Trong vài năm gần đây, có số cơng ty mạnh dạn ứng dụng phương pháp quy mơ cịn nhỏ chế phẩm ứng dụng chưa nhiều Một thực tế nhiều nước (Indonesia, Đài Loan,…) xuất loại cà phê đặc biệt, cà phê “chồn” Loại cà phê có chất lượng cao phù hợp với người tiêu dùng Indonesia Việt Nam Hằng năm, người ta sản xuất loại cà phê chồn khơng nhiều phụ thuộc chủ yếu tham gia chủ yếu lồi chồn hương có nơng trường cà phê Lồi chồn hương ăn trái cà phê chín qua hệ tiêu hóa chúng, cà phê nhân trải qua giai đoạn lên men Như chất cà phê chồn cà phê nhân lên men nên chất lượng cao Tương tự Đài Loan người ta cho khỉ ăn trái cà phê cà phê nhân sau qua hệ tiêu hóa khỉ có chất lượng tương đương cà phê chồn Như chất sinh học q trình chuyển hóa tác động enzym có hệ thống tiêu hóa động vật Chính đề tài đặt theo hướng nghiên cứu dạng “phỏng sinh học” nhằm tìm chất sinh hóa từ xây dựng nên kỹ thuật nâng cao chất lượng cà phê Đề tài xác định là: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase, cellulase ứng dụng sản xuất cà phê theo phương pháp lên men” Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có khả sinh tổng hợp pectinase cellulase, tìm quy trình kỹ thuật lên men để nâng cao khả tách vỏ, trích ly chất hòa tan từ cà phê cải thiện tốt hương vị nhằm nâng cao chất lượng cà phê Những nội dung nghiên cứu đề tài: Phân lập hóa chủng nấm sợi, nấm men vi khuẩn tự nhiên từ vỏ cà phê Khảo sát sơ khả sinh tổng hợp enzym pectinase cellulase chủng hóa từ sưu tập có sẵn PTN định danh vi sinh vật có hoạt tính enzym cao Kiểm tra sơ sinh tổng hợp độc tố chủng vi sinh vật (nếu có, chủng vi sinh vật bị loại bỏ khơng thể sử dụng chế biến thực phẩm) Nghiên cứu điều kiện phù hợp để tạo chế phẩm VSV bao gồm thành phần hóa học mơi trường, độ ẩm, thời gian, pH ban đầu, nhiệt độ, … Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nhằm tăng khả tách vỏ cà phê tươi Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men nhằm tăng khả trích ly chất hòa tan độ ẩm cà phê nhân, tỉ lệ chế phẩm đưa vào lên men, thời gian lên men thông qua số oBrix sản phẩm sau lên men (thành phần chất hòa tan) Xây dựng quy trình cơng nghệ lên men cà phê Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án Những đóng góp luận án: - Định danh hóa hệ vi sinh vật có khả sinh tổng hợp pectinase cellulase từ đối tượng cà phê Việt Nam: chủng phân lập Aspergillus carbonarius, Aspergillus japonicus, Aspergillus flavus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus tubingiensis chủng nấm sợi PTN gồm Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Trichoderma longgibran, Trichoderma fluferum, Trichoderma reesei Ngồi cịn thu chủng nấm men chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp pectinase, cellulase khơng sinh độc tố, có tên Candida tropicalis, Issatchenkia orientalis, Pichia guilliermonii, Bacillus megaterium QM B1551, Bacillus subtilis HNL01, Bacillus subtilis CICC10162, Bacillus subtilis NIOB 088, Bacillus subtilis B215 Việc phân lập vi sinh vật có khả sinh tổng hợp pectinase cellulase từ đối tượng cà phê Việt Nam chưa có nghiên cứu ngồi nước đề cập đến -Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện tạo chế phẩm vi sinh vật: Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu để sản xuất 18 chế phẩm thành phần hóa học môi trường, độ ẩm, thời gian để sinh tổng hợp pectinase, cellulase chủng nấm sợi, thành phần môi trường, độ ẩm, thời gian, độ Brix, pH ban đầu (NH 4)2SO4 để sinh tổng hợp pectinase, cellulase chủng nấm men vi khuẩn Những chủng nấm sợi Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei hay chủng vi khuẩn Bacillus megaterium, Bacillus subtilis có nhiều nghiên cứu thực để sinh tổng hợp nhiều loại enzym ứng dụng rộng rãi lĩnh vực lên men, kháng bệnh cân sinh học nông nghiệp lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Tuy vậy, việc nghiên cứu chủng vi sinh vật nêu thích nghi đối tượng cà phê chưa nhiều kết đề tài góp phần thêm vào hiểu biết chung, cụ thể điều kiện tối ưu sinh tổng hợp enzym Ở nước ngoài, nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase chủng VSV Aspergillus phoenicis, Trichoderma longgibran , Aspergillus flavus có số cơng trình Việt Nam cịn hạn chế Đặc biệt, việc nghiên cứu sinh tổng hợp pectinase chủng chưa công bố trước nước nước Đây nội dung có tính mẻ đề tài Ngồi ra, tính đặc biệt thể khảo sát tối ưu trình sinh tổng hợp pectinase cellulase chủng Trichoderma fluferum, Aspergillus carbonarius, Aspergillus japonicus, Aspergillus tubingiensis, Candida tropicalis, Pichia guilliermonii, Issatchenkia orientalis Những chủng nấm sợi nấm men vừa nêu chủ yếu nghiên cứu khả sinh tổng hợp loại enzym phân giải liên kết α-glucosidic Những nghiên cứu tìm tối ưu để sinh tổng hợp enzym thủy phân β-glucosidic pectinase, cellulase chưa thực luận án - Đã tạo chế phẩm ứng dụng quy mơ cơng nghiệp việc tách vỏ cà phê: Đã thử nghiệm thấy có chế phẩm ứng dụng cho tách vỏ cà phê tươi cụ thể chế phẩm tạo từ chủng nấm sợi sau: Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Aspergillus phoenicis, Trichoderma reesei, Aspergillus tubingiensis Lượng chế phẩm sử dụng từ đến 6% thời gian lên men tách vỏ - 10 tùy loại chế phẩm -Đã tạo chế phẩm ứng dụng quy mơ cơng nghiệp việc làm tăng chất trích hịa tan cảm quan tốt hương vị: Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men loại cà phê: độ ẩm cà phê nhân, tỉ lệ chế phẩm đưa vào lên men, thời gian lên men thông qua số độ Brix sản phẩm sau lên men (thành phần chất hòa tan) Cà phê lên men phải ngâm nước 1,5 để đạt độ ẩm 53-60%W, để nước tiến hành lên men với chế phẩm Các chế phẩm biocoffee-1, biocoffee-2, biocoffee-3, biocoffee-8, biocoffee-10 lên men cà phê môi trường rắn ẩm Còn chế phẩm lại Biocoffee-12, Biocoffee-14 biocoffee-15 tiến hành lên men môi trường lỏng Cà phê lên men tiến hành đánh giá cảm quan kết cho thấy loại cà phê lên men đạt điểm cao (tốt xuất sắc) so với cà phê khơng lên men (trung bình trung bình) Cà phê lên men có hương vị đậm đà, hậu vị tốt Trích ly nồng độ chất hòa tan tăng đến 53% so với mẫu đối chứng sử dụng chế phẩm đơn, đặc biệt nồng độ chất trích hịa tan tăng đến 67% sử dụng phối hợp chế phẩm Khảo sát hàm lượng caffeine hạt cà phê sau lên men chế phẩm đơn phối hợp chế phẩm thu kết ấn tượng, tăng 38% chế phẩm đơn đặc biệt tăng 46 % phối hợp chế phẩm Ngoài ra, cà phê lên men điều kiện thu chất hòa tan, caffeine cao hương vị, tiêu cảm quan hình thái màu sắc cà phê đạt, chí chất lượng cảm quan cải thiện rõ rệt -Ý nghĩa thực tiễn luận án Đề tài thành công góp phần làm sáng tỏ quy trình sản xuất chế phẩm VSV mang hoạt tính pectinase cellulase ứng dụng chúng việc tách vỏ lên men cà phê nhằm tăng hiệu suất trích ly chất hòa tan cải thiện hương vị cà phê điều kiện Việt Nam Kết ứng dụng công ty sản xuất cà phê nhân, đặc biệt ứng dụng cơng ty sản xuất cà phê hòa tan Bố cục luận án: gồm 163 trang Ngoài phần mở đầu, mục lục phụ lục, nội dung nghiên cứu gồm chương Chương 1: Tổng quan cà phê, chất pectin, cellulose enzym pectinase & cellulase, sở khoa học việc tách vỏ lên men cà phê nước gồm 36 trang Chương có 39 trang: Vật liệu, phương pháp nghiên cứu Chương có 78 trang, trình bày kết xác định thành phần hóa học chủ yếu có lớp nhớt cà phê nhân, phân lập định danh chủng vi sinh vật, nghiên cứu điều kiện kỹ thuật tạo chế phẩm, nghiên cứu trình tách vỏ cà phê, trình lên men Chương 4: Phần kết luận kiến nghị gồm trang Danh mục cơng trình trang có 167 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh CHƯƠNG - TỔNG QUAN Trong phần tổng quan giới thiệu cà phê bao gồm lịch sử, giá trị kinh tế, tình hình sản xuất cà phê, tầm quan trọng chế biến cà phê vấn đề kỹ thuật cần nghiên cứu chế biến cà phê Giới thiệu thành phần hóa học trái cà phê cà phê nhân Giới thiệu hai thành phần chủ yếu lớp vỏ nhớt cà phê nhân; pectin, cellulose giới thiệu enzym pectinase, cellulase Giới thiệu vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzym Giới thiệu rõ sở khoa học việc tách vỏ lên men cà phê, đồng thời nêu rõ ứng dụng vấn đề tách vỏ cà phê lên men cà phê giới nước Tổng quan cho thấy cà phê nông sản có giá trị nước giới quan tâm Việt Nam năm xuất tỷ đô la Mỹ (USD), đặc biệt năm 2010 Việt Nam xuất 1,47 tỉ USD Tuy nhiên, Việt Nam chủ yếu xuất cà phê thô, giá thành thấp Cà phê chế biến theo phương pháp truyền thống có chất lượng trung bình lệ thuộc lớn vào nhiệt độ ánh sáng tự nhiên Thế giới nghiên cứu chế biến cà phê công nghệ lên men sau thu hoạch nhằm loại bỏ hoàn toàn vỏ lớp nhớt pectin Điều làm thay đổi cảm quan chất lượng cà phê Tại Việt Nam, có khoảng 20 công ty ứng dụng công nghệ lên men ướt nhằm tách vỏ lớp nhớt cà phê để thu cà phê đạt tiêu chuẩn xuất Tuy nhiên, chế phẩm sử dụng enzym nhập đắt tiền từ nước Trong xu hội nhập đòi hỏi cao chất lượng, ngành chế biến cần có nhiều nghiên cứu để sản xuất cà phê đạt chất lượng giới, đòi hỏi nguồn enzym thay rẻ sản xuất Việt Nam Việt Nam nơi giàu nguồn vi sinh vật, công nghệ tế bào cơng nghệ enzym sản xuất chế phẩm vi sinh vật hay chế phẩm enzym để thay nguồn ngoại nhập đắt tiền CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu: - Cà phê nhân: loại cà phê đưa vào nghiên cứu với tên gọi cà phê chè (Coffea arabica), vối (Coffea robusta), mít (Coffea chari) có nguồn gốc từ Đắc Lắc - Nguồn vi sinh vật nghiên cứu: Nấm sợi, nấm men vi khuẩn từ nguồn phân lập từ vỏ, cà phê nhân, ngồi cịn có chủng nấm sợi từ PTN - Mơi trường sử dụng: Mơi trường Malt có bổ sung dùng nuôi cấy, nấm sợi, nấm men vi khuẩn, mơi trường cám, trấu, cà rốt có bổ sung (NH 4)2SO4 môi trường nhân giống môi trường PGA làm mơi trường giữ giống - Hóa chất: (NH4)2SO4, glucose, agar, nước cất, thuốc thử DNS (axit 3,5 dinitrosalicylic) C7H4N2O7, NaOH, dung dịch CMC 1%, dung dịch CH3COOH 1M, dung dịch pectin 1%,… - Thiết bị - dụng cụ: Máy đo quang phổ UV-Vis Spectro 2000RS (LaboMed, Inc.), máy đo pH, máy ly tâm, máy nghiền, dụng cụ đo nồng độ chất tan (Brix Hand-held Refractometer ATAGO), nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, cân phân tích điện tử Nhiệt kế, ống nghiệm, đĩa petri, erlen 250 ml, 500 ml, becher 100 ml, 500 ml, 1000 ml, bình định mức loại, ống đong loại, pipette loại, phễu lọc, giấy lọc, đèn cồn, que cấy, đũa thủy tinh, bếp điện, chảo rang, khay tre, vải mùng 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phân lập, cấy chuyền làm giống vi sinh vật từ vỏ cà phê, cà phê nhân - Phương pháp cấy truyền giữ giống - Phương pháp định danh vi sinh vật (PP kỹ thuật sinh học phân tử) - Phương pháp xác định độ ẩm - Phương pháp trích chất hòa tan - Phương pháp nghiền, ray, ngâm - Xác định hoạt tính cellulase (PP so màu với thuốc thử Antron) - Xác định hoạt tính pectinase (PP so màu với thuốc thử DNS) - Xác định hàm lượng cellulose (Dựa vào tính chất bền vững cellulose trước tác dụng axit mạnh, kiềm mạnh, không bị thủy phân tác dụng axit yếu) - Xác định hàm lượng pectin (PP Canxi pectat) - Xác định hàm lượng đường tổng số hòa tan (dựa phản ứng màu đặc trưng cho đường nhiều chất hữu với diện axit sulfuric (H2SO4)) - Xác định hàm lượng đường khử (PP phản ứng màu với thuốc thử axit 3,5 dinitrosalicylic (DNS)) - Xác định hàm lượng tro tổng hữu (PP tro hóa xác định tổng lượng tro) - Xác định hàm lượng tinh bột (PP thủy phân axit) - Định lượng nitơ tổng protein thô (PP Kjeldahl) - Phương pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp hai loại enzym cellulase pectinase nấm sợi - Phương pháp xử lý tách vỏ phương pháp lên men cà phê PP lên men rắn chế phẩm nguồn gốc nấm sợi, PP lên men lỏng chế phẩm nguồn gốc nấm men vi khuẩn - Phương pháp đánh giá cảm quan (TCVN 3215-79) - Phương pháp xử lý số liệu (ANOVA với chuẩn LSD, Duncan Turkey) CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU CÓ TRONG CÀ PHÊ 3.1.1 Thành phần pectin cellulose có lớp nhớt cà phê Theo tài liệu cho thấy pectin có khả hút nước cao tạo dịch keo nhớt Ngồi lớp nhớt cịn có cellulose Đây lớp khó bị phân giải hồn tồn, lớp dễ hóa nâu hay bị nhiễm vi sinh vật Chất lượng cà phê nhân phụ thuộc nhiều vào lớp nhớt Xu hướng chế biến phá bỏ hoàn toàn lớp nhớt để kéo dài thời gian bảo quản hạt đồng thời nâng cao chất lượng cà phê Bảng 3.1: Thành phần hóa học chủ yếu lớp nhớt cà phê Stt Cà phê chè Cà phê vối Cà phê mít hóa học Thành phần (Arabica)(%) (Robusta) (Chari) (%) 36,5 ± 1,2 17,0 ± 0,4 (%) 39,7 ± 1,4 16,5 ± 0,3 37,2 ± 1,1 17,6 ± 0,3 Pectin Cellulose Kết khảo sát cho thấy lớp nhớt, tổng hai thành phần pectin cellulose chiếm 1/2 thành phần hóa học lớp nhớt 3.1.2 Thành phần hóa học chủ yếu có cà phê nhân Cà phê nhân khảo sát thành phần hóa học có độ ẩm từ 11,26 - 12,02%, kết thành phần hóa học trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2: Các thành phần hóa học chủ yếu có cà phê nhân Stt Thành phần Cà phê chè Cà phê vối Cà phê mít Tro Cellulose Pectin Lipit Protein Đường khử Tinh bột Thành phần khác Arabica (%) 3,5 ± 0,1 4,4 ± 0,2 19,2 ± 0,7 11,6 ± 0,3 17,5 ± 0,6 6,8 ± 0,2 20,3 ± 0,9 16,7 ± 0,5 Robusta (%) 3,3 ± 0,1 3,6 ± 0,1 28,8 ± 0,9 11,4 ± 0,2 16,6 ± 0,5 5,6 ± 0,1 22,5 ± 0,8 8,1 ± 0,5 Chari (%) 3,4 ± 0,1 3,9 ± 0,1 19,1 ± 0,6 11,1 ± 0,2 15,4 ± 0,5 7,5 ± 0,2 18,5 ± 0,9 20,9 ± 0,5 Kết thu từ bảng 3.2 cho thấy pectin chiếm tỉ lệ lớn cà phê nhân thành phần cứng, bền khó phân giải Từ nhiều tài liệu cho thấy, pectin chiếm chủ yếu thành tế bào cà phê nhân, hạt già cấu trúc bền chặt vững, khó phân hủy Tuy nhiên pectin kết hợp với cellulose tạo phức phức tạp bền vững Chính hai thành phần khó phân giải làm hạn chế khả trích ly chất hịa tan cà phê Vì việc sử dụng enzym hướng tích cực enzym chất xúc tác hữu có chất protein, tác động lên liên kết đặc trưng gần gũi với tự nhiên nên không sinh độc tố không mong muốn (những tác nhân gây ung bướu ung thư quan ngại quy trình sản xuất cũ dùng nhiều axit bazơ mạnh) Enzym giúp phân giải hoàn toàn pectin cellulose lẫn sâu bên cà phê nhân Cả ba loại cà phê cho thấy chất dinh dưỡng protein, lipit đường thông thường, loại poly saccharide có chức bảo vệ tế bào cellulose pectin chiếm tỷ lệ đáng kể vỏ, lớp nhớt cà phê nhân chín Việc hiểu biết cấu trúc chúng cần quan tâm có ý nghĩa chuyển hóa sinh hóa q trình lên men để thu chất hịa tan cao, đặc biệt chất hòa tan nằm sâu tế bào cà phê nhân 3.2 Định danh hóa hệ vi sinh vật có khả sinh tổng hợp pectinase cellulase từ đối tượng cà phê Việt Nam: Kết thu có 12 chủng nấm sợi có khuẩn lạc rời có hình dạng đặc trưng Kết thu chủng sinh tổng hợp hai enzym Kết định danh cho thấy chủng thuộc giống Rhizopus chủng thuộc giống Aspergillus Tuy nhiên; kết lại cho thấy có hai chủng dương tính có sản sinh độc tố aflatoxin, ochratoxin Rhizopus oryzae Aspergillus fumigatus Năm chủng cịn lại khơng sinh độc tố Aspergillus carbonarius, Aspergillus japonicus, Aspergillus flavus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus tubingiensis Ngoài chủng nấm sợi phân lập, đề tài xác định có chủng nấm sợi PTN có khả sinh tổng hợp pectinase cellulase cao ứng dụng xử lý cà phê Các chủng nấm sợi bao gồm Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Trichoderma longgibran, Trichoderma pluferum, Trichoderma reesei Phân lập nấm men vi khuẩn từ vỏ hạt cà phê, kết thu 18 chủng Bước đầu khảo sát sơ khả sinh hoạt tính pectinase cellulase cho thấy có chủng có khả Trong có chủng nấm men chủng vi khuẩn Định danh chủng nấm men kỹ thuật giải trình tự gen 28S RNA xác định BLAST NCBI vi khuẩn kỹ thuật giải trình tự gen 16S RNA xác định BLAST NCBI Kiểm tra khả sinh độc tố chủng phương pháp AOAC 999.07 – 2000 Kết thu chủng nấm men chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp pectinase, cellulase không sinh độc tố, có tên Candida tropicalis, Issatchenkia orientalis, Pichia guilliermonii, Bacillus megaterium QM B1551, Bacillus subtilis HNL01, Bacillus subtilis CICC10162, Bacillus subtilis NIOB 088, Bacillus subtilis B215 Việc phân lập toàn hệ vi sinh vật đối tượng vỏ, hạt cà phê Việt Nam, đặc biệt tổng hệ vi sinh vật có khả sinh tổng hợp pectinase cellulase từ đối tượng cà phê chưa có nghiên cứu nước đề cập đến 3.3 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện tạo chế phẩm vi sinh vật: Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu để sản xuất 18 chế phẩm thành phần chất cảm ứng môi trường, độ ẩm, thời gian để sinh tổng hợp pectinase, cellulase chủng nấm sợi, thành phần môi trường, độ ẩm, thời gian, độ Brix, pH ban đầu (NH4)2SO4 để sinh tổng hợp pectinase, cellulase chủng nấm men vi khuẩn Những chủng vi sinh vật Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei hay chủng vi khuẩn Bacillus megaterium, Bacillus subtilis có nhiều nghiên cứu thực để sinh tổng hợp nhiều loại enzym ứng dụng rộng rãi lĩnh vực lên men, kháng bệnh cân sinh học nông nghiệp lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Tuy vậy, việc nghiên cứu chủng vi sinh vật nêu thích nghi đối tượng cà phê chưa nhiều kết đề tài góp phần thêm vào hiểu biết chung, cụ thể điều kiện tối ưu sinh tổng hợp enzym Ở nước ngoài, số chủng VSV Aspergillus phoenicis, Trichoderma longgibran, Aspergillus flavus có số cơng trình nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase Việt Nam tìm thấy Đặc biệt, việc nghiên cứu sinh tổng hợp pectinase chủng chưa cơng bố nước nước ngồi Đây nội dung có tính mẻ đề tài Ngồi ra, tính đặc biệt thể khảo sát tối ưu trình sinh tổng hợp pectinase cellulase chủng Trichoderma fluferum, Aspergillus carbonarius, Aspergillus japonicus, Aspergillus tubingiensis, Candida tropicalis, Pichia guilliermonii, Issatchenkia orientalis Những chủng nấm sợi nấm men vừa nêu chủ yếu nghiên cứu khả sinh tổng hợp loại enzym đường phân nhiều hệ amylase nghiên cứu tối ưu sinh tổng hợp pectinase, cellulase chưa thực 10 Quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao Tất 18 loại chế phẩm nghiên cứu sản xuất có quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao tổng hợp trình bày bảng 3.9: Bảng 3.9: Cơng nghệ tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao Stt Tên chế phẩm Môi Độ ẩm Thời Nồng pH (NH4)2SO4 Nhiệt trường gian độ ban Độ (cà rốt (%W) (giờ) Đường đầu (%) (oC) %) (brix) Biocoffee-1 15 64 42 22-30 Biocoffee-2 15 60 42 22-30 Biocoffee-3 15 56 46 22-30 Biocoffee-4 09 60 38 22-30 Biocoffee-5 12 60 42 22-30 Biocoffee-6 12 64 46 22-30 Biocoffee-7 06 56 42 22-30 Biocoffee-8 12 64 42 22-30 Biocoffee-9 12 56 38 22-30 10 Biocoffee-10 12 56 38 22-30 11 Biocoffee-11 0,7 36 6,5 0,09 31 12 Biocoffee-12 0,7 36 6,5 0,07 33 13 Biocoffee-13 0,7 36 5,0 0,05 33 14 Biocoffee-14 0,7 36 6,5 0,07 31 15 Biocoffee-15 0,7 36 5,5 0,09 31 16 Biocoffee-16 0,6 48 6,5 0,09 31 17 Biocoffee-17 0,7 36 7,0 0,09 33 18 Biocoffee-18 0,6 36 6,5 0,07 31 Tất 18 loại chế phẩm nghiên cứu sản xuất có quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao tổng hợp trình bày bảng 3.10: 11 Stt 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Bảng 3.10: Quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao Tên chế Mơi Độ ẩm Thời Nồng độ pH (NH4)2SO4 phẩm trường gian Đường ban (trấu (%W) (brix) đầu (%) %) (giờ) Biocoffee-1 09 56 38 Biocoffee-2 09 60 38 Biocoffee-3 56 38 Biocoffee-4 12 60 36 Biocoffee-5 15 60 36 Biocoffee-6 12 60 38 Biocoffee-7 15 56 38 Biocoffee-8 15 60 38 Biocoffee-9 15 56 36 Biocoffee-10 15 64 36 Biocoffee-11 0,7 36 6,5 0,09 Biocoffee-12 0,7 36 6,5 0,07 Biocoffee-13 0,6 48 5,0 0,05 Biocoffee-14 0,7 36 6,5 0,07 Biocoffee-15 0,7 36 5,5 0,09 Biocoffee-16 0,7 36 6,5 0,09 Biocoffee-17 0,6 36 7,0 0,09 Biocoffee-18 0,7 36 6,5 0,07 Nhiệt Độ (oC) 22-30 22-30 22-30 22-30 22-30 22-30 22-30 22-30 22-30 22-30 31 33 33 31 31 31 33 31 3.4 KHẢO SÁT CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN Với kết đạt từ nội dung nghiên cứu 3.1, 3.2 3.3 chúng tơi có quy trình sản xuất chế phẩm Tuy nhiên, vấn đề chế phẩm sử dụng lâu dài hay không chất lượng chế phẩm nào, nội dung quan trọng Chúng tập trung chế phẩm dạng rắn từ nấm sợi, riêng chế phẩm vi sinh vật dạng lỏng phải sử dụng Khảo sát với mốc 1, 30, 60 90, kết trình bày bảng 3.12: 12 Bảng 3.12: Khảo sát chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản Số lượng tế bào VSV (a.108tb/g a.108tb/ml) Hoạt độ pectinase (UI/g UI/ml) Hoạt độ cellulase (UI/g UI/ml) Ngày 30 60 90 30 60 90 Bio-1 22,14 ±0,58 20,02 ±0,26 19,00 ±0,26 17,28 ±0,29 644,25±7,45 629,98±8,23 619,46±12,89 605,50±9,14 30 60 90 39,63 ±0,20 37,46 ±0,26 35,58 ±0,12 33,15 ±0,29 Bio-2 3,01 ±0,35 2,59 ±0,30 2,30 ±0,40 2,20 ±0,15 460,59±8,30 445,38±4,34 428,71±6,20 418,60±10,3 29,61 ±0,35 28,38 ±0,30 27,42 ±0,09 26,68 ±0,15 Bio-3 17,55 ±0,21 16,08 ±0,35 15,24 ±0,28 13,86 ±0,66 568,83±13,56 543,68±6,89 528,01±11,79 500,57±9,68 Bio-8 13,67 ±0,32 12,26 ±0,24 11,60 ±0,61 10,5 ±0,36 1027,57±18,35 998,78 ±15,79 948,23 ±10,57 924,30 ±14,98 Bio-10 10,28 ±0,32 9,45 ±0,39 8,23 ±0,61 7,50 ±0,30 657,45 ±8,97 623,04 ±4,23 586,29 ±7,93 565,51 ±10,38 Bio-12 7,50 ±0,12 224,59±3,54 - Bio-14 8,16±0,22 226,21±5,78 - Bio-15 6,34 ±0,09 163,62±6,87 - 28,85 ±0,21 28,15 ±0,35 27,56 ±0,28 27,12 ±0,25 34,41 ±0,32 31,78 ±0,34 29,28 ±0,29 27,53 ±0,36 34,41 ±0,32 32,60 ±0,10 31,35 ±0,23 30,28 ±0,34 13,40 ±0,14 - 16,56 ±0,23 - 16,20 ±0,31 - 13 Tổng kết khảo sát chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản cho thấy chất lượng chế phẩm có thay đổi theo chiều hướng giảm phạm vi chấp nhận Từ kết 3.4.1, 3.4.2 3.4.3 cho thấy số lượng tế bào VSV giảm 21-27%, pectinase giảm hoạt tính 6-14% cellulase 5-19% sau 90 ngày bảo quản Tuy nhiên sử dụng phải tăng lượng chế phẩm để bù vào khoảng thay đổi giảm để thu kết lên men số lượng tế bào hoạt tính enzym pectinase cellulase 3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH VỎ CÀ PHÊ 3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chế phẩm đến khả tách vỏ cà phê tươi Quá trình tách vỏ tăng dần theo tỷ lệ tăng dần chế phẩm Các chế phẩm có tác động tốt đến q trình tách vỏ, nhận thấy tỷ lệ từ - 6% tỷ lệ tốt để tách hầu hết lớp nhớt vỏ 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến khả tách vỏ cà phê tươi Kết thấy có khác biệt đáng kể mẫu có bổ sung mẫu khơng có bổ sung chế phẩm Mẫu đối chứng cho thấy tách hoàn toàn vỏ cà phê Kết cho thấy vỏ cà phê bị tác động mạnh mẽ thời gian xử lý 10 3.5.3 Tổng kết nghiên cứu trình tách vỏ cà phê quy trình tách vỏ cà phê Bảng 3.13: Tỷ lệ tách vỏ cà phê Stt Tên chế Tỷ lệ chế Thời gian phẩm phẩm (giờ) (%) Biocoffee-1 5,0 10 Biocoffee-2 5,5 10 Biocoffee-3 6,0 10 Biocoffee-8 5,0 10 Biocoffee-10 5,5 14 Tỷ lệ tách vỏ (%) 99,88 99,81 99,98 100 100 3.6 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men loại cà phê: độ ẩm hạt cà phê, tỉ lệ chế phẩm đưa vào lên men, thời gian lên men thông qua số độ Brix sản phẩm sau lên men (thành phần chất hòa tan) Cà phê lên men phải ngâm nước 1,5 để đạt độ ẩm 53-60%W, để nước tiến hành lên men với chế phẩm Các chế phẩm biocoffee-1, biocoffee-2, biocoffee-3, biocoffee-8, biocoffee-10 lên men cà phê môi trường rắn ẩm Cà phê lên men tiến hành đánh giá cảm quan kết cho thấy loại cà phê lên men đạt điểm cao (tốt xuất sắc) so với cà phê khơng lên men (trung bình trung bình) Cà phê lên men có hương vị đậm đà, hậu vị tốt Ngồi trích ly chất hịa tan cao, cà phê lên men có nhiều ưu điểm hương vị Cải thiện nâng cao tiêu cảm quan (hình thái, hương vị) cà phê điểm đáng quan tâm Đây chuyển hóa sở cho nâng cao chất lượng cà phê lên men Phát đóng góp tốt mà đề tài mang lại 3.6.5 Tổng kết nghiên cứu lên men cà phê nhân quy trình lên men Tóm lại qua khảo sát cho thấy CPVSV có tác dụng mạnh mẽ rõ rệt lên cà phê nhân làm tăng khả trích chất hịa tan cà phê nhân so với mẫu đối chứng Thời gian tối ưu để lên men cho tất loại cà phê bổ sung chế phẩm 14 - 18 trung bình 16 Các chế phẩm có tác động khác loại cà phê khác Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men độ ẩm hạt cà phê, tỉ lệ chế phẩm đưa vào lên men, thời gian lên men thông qua số độ Brix sản phẩm sau lên men (thành phần chất hòa tan) Cà phê đưa vào lên men phải ngâm nước 1,5 để đạt độ ẩm 53-60%W, sau để nước tiến hành lên men với chế phẩm Các chế phẩm biocoffee-1, biocoffee-2, biocoffee-3, biocoffee-8, biocoffee-10 lên men cà phê mơi trường rắn ẩm Cịn chế phẩm cịn lại Biocoffee-12, Biocoffee-14 biocoffee-15 tiến hành lên men mơi trường lỏng Kết thu quy trình lên men loại cà phê phổ biến Việt Nam bảng 3.14 bên dưới: 15 Bảng 3.14: Công nghệ lên men cho loại cà phê phổ biến Việt Nam Stt Tên chế phẩm Thời gian ngâm cà phê (giờ) Lượng CPVSV (%) Ara Rob Thời gian lên men (giờ) Ch a 18 16 16 14 16 15 20 10 Ara Rob Cha Biocoffee-1 1,5 12 12 16 16 16 Biocoffee-2 1,5 16 16 16 16 16 Biocoffee-3 1,5 16 16 16 16 18 Biocoffee-8 1,5 12 12 16 16 16 10 Biocoffee-10 1,5 12 12 14 14 14 12 Biocoffee-12 10 15 14 14 14 14 Biocoffee-14 15 15 14 14 14 15 Biocoffee-15 10 10 14 14 14 3.6.7 Lên men cà phê nhân kết hợp chế phẩm Từ kết nghiên cứu nhận thấy có chế phẩm có tác động tốt lên cà phê cho kết cao yếu tố khảo sát nồng độ chất hòa tan điểm cảm quan cao Ngoài ra, cà phê Robusta loại cà phê chiếm 95 % sản lượng cà phê Việt Nam, loại cà phê xuất giới quan tâm Chúng chọn chế phẩm Biocoffee-10, Biocoffee-12, Biocoffee-14 để tiến hành lên men phối hợp theo điều kiện tối ưu tỷ lệ chế phẩm, thời gian độ ẩm Mục đích khảo sát nhằm có kết luận lên men kết hợp thay đổi nồng độ chất hịa tan trích ly hàm lượng caffeine thay đổi theo trình Trong khảo sát chúng tơi thực cà phê Robusta, ĐC: Mẫu đối chứng, B-10-R: Mẫu lên men với Biocoffee-10 đối tượng cà phê Robusta, tương tự Biocoffee-12, Biocoffee-14, Biocoffee-10 & Biocoffee-12, Biocoffee-10 & Biocoffee-14, Biocoffee-12 & Biocoffee-14 đối tượng cà phê Robusta Kết trình bày sau: 3.6.7.1 Khảo sát nồng độ chất tan lên men kết hợp Kết nồng độ chất hòa tan cà phê sau lên men trình bày biểu đồ 3.3: 16 Biểu đồ 3.3: Khảo sát nồng độ chất tan chế phẩm đơn chế phẩm kết hợp Kết từ biểu đồ 3.3 cho thấy khác biệt có ý nghĩa nồng độ chất hịa tan sử dụng chế phẩm đơn chế phẩm kết hợp Tuy nhiên, lên men chế phẩm kết hợp cho kết tốt nhiều thu nhiều chất trích Tỉ lệ chất trích hịa tan tăng so với mẫu đối chứng trình bày biểu đồ 3.4: Biểu đồ 3.4: Nồng độ chất tan tăng so với mẫu đối chứng chế phẩm đơn chế phẩm kết hợp Kết từ biểu đồ 3.4 cho thấy nồng độ chất tan tăng từ 14 đến 53% lên men chế phẩm đơn chủng Đặc biệt, nồng độ chất tan tăng ấn tượng lên men kết hợp tăng đến 68% so với mẫu đối chứng 3.6.7.2 Khảo sát hàm lượng caffeine giải phóng lên men kết hợp Kết khảo sát hàm lượng caffeine giải phóng lên men kết hợp trình bày biểu đồ 3.5: 17 Biểu đồ 3.5: Hàm lượng caffein lên men chế phẩm đơn chế phẩm kết hợp Từ biểu đồ 3.5 cho thấy hàm lượng caffeine thu từ mẫu cà phê khác có ý nghĩa thống kê Nhìn chung mẫu cà phê có sử dụng chế phẩm chất hịa tan tăng cao đáng kể Đặc biệt mẫu cà phê lên men kết hợp cho kết khả quan Mẫu đối chứng caffeine đạt 1,51%, mẫu từ lên men đơn chủng hàm lượng caffeine giao động khoảng 1,7%, đặc biệt lên men kết hợp có mẫu đạt đến 2,12 Tỉ lệ hàm lượng caffeine tăng so với mẫu đối chứng trình bày biểu đồ 3.6: Biểu đồ 3.6: Hàm lượng caffein tăng so với mẫu đối chứng chế phẩm đơn chế phẩm kết hợp Từ kết biểu đồ 3.6 cho thấy mẫu lên men đơn chủng tăng từ 13-19%, cá mẫu lên men kết hợp cao nằm khoảng 26-46% Caffeine thành phần quan trọng cà phê, định đến chất lượng cuối hương vị kích thích hệ thần kinh gây hưng phấn sảng khối Việc tác 18 động có hiệu chế phẩm đến việc trích ly chất hịa tan giúp đơn vị chế biến trích ly hiệu CHƯƠNG - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã hóa định danh vi sinh vật có khả sinh tổng hợp pectinase cellulase, hoạt hóa kiểm tra khả sinh tổng hợp pectinase cellulase chủng vi sinh vật kiểm tra nguy sinh độc tố để loại trừ không ứng dụng chế biến thực phẩm cụ thể chế biến cà phê chủng nấm sợi từ vỏ, cà phê nhân bao gồm Aspergillus carbonarius, Aspergillus japonicus, Aspergillus flavus, Aspergillus phoenicis, Aspergillus tubingiensis, chủng nấm sợi từ PTN bao gồm Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Trichoderma longgibran, Trichoderma fluferum, Trichoderma reesei, chủng nấm men bao gồm Candida tropicalis, Pichia guilliermonii, Issatchenkia orientalis, chủng vi khuẩn tự nhiên bao gồm Bacillus subtilis CICC10162, Bacillus subtilis HNL01, Bacillus subtilis NIOB 088, B megaterium QM B1551 Bacillus subtilis Đã nghiên cứu khảo sát điều kiện tạo chế phẩm vi sinh vật thành phần môi trường, độ ẩm, thời gian chủng nấm sợi, thành phần môi trường, độ ẩm, thời gian, độ Brix, pH ban đầu lượng (NH 4)2SO4 chủng nấm men vi khuẩn Tất 18 chế phẩm VSV tạo đặt tên biocoffee đánh số từ đến 18 Tất 18 loại chế phẩm VSV nghiên cứu sản xuất có quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính pectinase có hoạt tính cellulase Có chủng nấm sợi, chủng nấm men chủng vi khuẩn có hoạt tính pectinase cellulase cao chọn để nghiên cứu khả tách vỏ lên men cà phê Cụ thể chế phẩm từ nấm sợi bao gồm: biocoffee-1, biocoffee-2, biocoffee-3, biocoffee-8 biocoffee-10, từ nấm men: biocoffee-12, từ vi khuẩn: biocoffee-14 biocoffee-15 Đã khảo sát cho thấy có chế phẩm biocoffee-1, biocoffee-2, biocoffee-3, biocoffee-8 biocoffee-10, ứng dụng cho tách vỏ cà phê tươi Lượng chế phẩm sử dụng từ đến 6%, thời gian lên men - 10 tỉ lệ tách vỏ cà phê tươi 100% Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men cà phê độ ẩm cà phê nhân, tỉ lệ chế phẩm đưa vào lên men, thời gian lên men thơng qua số nồng độ chất hịa tan (Brix) sản phẩm sau lên men Cà phê đưa vào lên men phải ngâm nước 1,5 để đạt độ ẩm 56-60%W, sau để nước tiến hành lên men với chế phẩm Các chế phẩm biocoffee-1, biocoffee-2, biocoffee-3, biocoffee-8, biocoffee-10 lên men cà phê mơi trường rắn ẩm Cịn chế phẩm cịn lại Biocoffee-12, Biocoffee-14 biocoffee-15 tiến hành lên men môi trường lỏng Lên men cà phê phối hợp sử dụng chế phẩm thu kết tốt việc tăng cường trích ly chất hịa tan Cà phê sau lên men có nồng độ chất hòa tan tăng đến 53% so với mẫu đối chứng sử dụng chế phẩm đơn, đặc biệt nồng độ chất trích hịa tan tăng đến 68% sử dụng phối hợp chế phẩm Khảo sát hàm 19 lượng caffeine hạt cà phê sau lên men chế phẩm đơn phối hợp chế phẩm thu kết ấn tượng, tăng 38% chế phẩm đơn đặc biệt tăng 46% chế phẩm phối hợp Cà phê lên men tiến hành đánh giá cảm quan kết cho thấy loại cà phê lên men đạt điểm cao (tốt xuất sắc) so với cà phê không lên men (trung bình trung bình) Cà phê lên men có hương vị đậm đà, hậu vị tốt Ngồi việc trích ly chất hịa tan cao, cà phê lên men có nhiều ưu điểm trạng thái, màu sắc, hương vị KIẾN NGHỊ Đề tài hoàn thành khối lượng lớn cơng việc, song cịn nhiều vấn đề cần nghiên cứu thêm Tác giả đề nghị có thể, nghiên cứu thêm lên men phối hợp với nghiệm thức kết hợp khác lên men chế phẩm có nguồn gốc nấm sợi, nấm men vi khuẩn để tăng cường q trình trích ly chất hịa tan caffeine Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym thô tinh ứng dụng vào trình tách vỏ lên men cà phê Ngoài ra, để ứng dụng thực tế điều kiện Việt Nam, lên men cà phê với qui mơ pilot hàng nghìn cần thiết phải khảo sát thêm điều kiện sục khí đảo trộn, nhiệt độ khối ủ thiết bị lên men 20 DANH MỤC CƠNG TRÌNH Lê Hồng Phú, Nguyễn Đức Lượng (2004), Synthezing pectinase & cellulase enzymes from Aspergillus niger and ultilized this bio product to treat coffee pulp to create organic fertilizer, The 2004 International Symposium on Advanced Science and Engineering, University of Technology HCMC Lê Hồng Phú, Nguyễn Đức Lượng, Đỗ Đại Nghĩa (2008), Nghiên cứu chế tạo chế phẩm Biocoffee-1 từ Aspergillus niger ứng dụng lên men loại cà phê, Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng Nghệ, Tập 11, Số 12; ĐHQG TP.HCM Lê Hồng Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vân (2010), Fermention of three kinds of coffee commonly used coffee in Vietnam by Aspergillus phoenicis, Tạp chí Hóa học Tập 48, số 4A-2010, trang 582-587, Hội Nghị Hóa Học Tồn Quốc lần V- 2010, Hà Nội Lê Hồng Phú, Bùi Thanh Hòa (2010), Research and application of bioproducts synthesized from genus of Aspergillus for white peppercorn production, Tạp chí Hóa học Tập 48, số 4A-2010, trang 76-581, Hội Nghị Hóa Học Tồn Quốc lần V- 2010, Hội Nghị Hóa Học Tồn Quốc lần V - 2010, Hà Nội Lê Hồng Phú, Bùi Thanh Hòa(2010), Increasing piperine extraction and husk removal from black peppercorn by using products, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Tập 8, số đặc biệt 3B-2010, trang 1537-1541, Hội nghị Khoa học công Nghệ Sinh Học Miền Trung Tây Nguyên lần thứ 2, Thành phố Huế Lê Hồng Phú, Phạm Thị Mỹ Vẹn (2010), Identification of microorganims producing cellulase and pectinase activities from pepper plant, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Tập 8, số đặc biệt 3A-2010, trang 937-943, Hà Nội Lê Hồng Phú, Võ Ngọc Thanh (2010), White pepper production by bioproducts originated from fungi (Biopep-2, Biopep-4, Biopep-6, and Biopep-8), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Tập 8, số đặc biệt 3A-2010, trang 819-826, Hà Nội Lê Hồng Phú, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Văn Hoàng (2011), White peper production by bioproducts originated from Aspergillus niger and Aspergillus oryzae, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 49, số đặc biệt N.1A, trang 286-293 Lê Hồng Phú, Bùi Thanh Hòa, Phạm Văn Hùng (2011), Isolation and identification of microorganisms from peper plant for the high cellulase and pectinase activity production, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 49, số đặc biệt N.1A, trang 177-184 10.Lê Hồng Phú, Trương Thị Quỳnh Trâm (2011) Isolation and identification of microorganisms from weasel coffee, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (accepted) 11.Lê Hồng Phú, Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Trường – ĐHQG TP.HCM (2007), Nghiên cứu tạo chế phẩm Bio-coffee có hoạt tính pectinase cellulase cao, ứng dụng tăng chất hòa tan sản xuất cà phê nhân lên men, nghiệm thu ngày 30/5/2007, đánh giá tốt 12.Lê Hồng Phú, Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Trường - ĐHQG TP.HCM (2008), Nghiên cứu sản xuất phân hữu từ nguồn phế thải vỏ cà phê Aspergillus niger, nghiệm thu ngày 23/04/2008, đánh giá tốt 13.Lê Hồng Phú, Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ (2009-2010), Nghiên cứu quần thể vi sinh vật cà phê nhân có khả sản xuất enzym pectinase cellulase nhằm mục tiêu xử lý cà phê nhân quy trình chế biến ướt, Mã số đề tài: B2008-28-02, nghiệm thu ngày 06/10/2010 Điểm 57/60, đánh giá tốt 14.Lê Hồng Phú, Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ (2011-2013), Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật sản xuất tiêu sọ, Mã số đề tài B2011-28-05 Số hợp đồng: 3211/HĐ-ĐHQT-QHQT&QLKH triển khai, tiến độ đánh giá tốt 21 ... pectinase, cellulase ứng dụng sản xuất cà phê theo phương pháp lên men? ?? Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có khả sinh tổng hợp pectinase cellulase, tìm quy trình kỹ thu? ??t lên men. .. nguồn vi sinh vật, công nghệ tế bào cơng nghệ enzym sản xuất chế phẩm vi sinh vật hay chế phẩm enzym để thay nguồn ngoại nhập đắt tiền CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu: - Cà. .. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phân lập, cấy chuyền làm giống vi sinh vật từ vỏ cà phê, cà phê nhân - Phương pháp cấy truyền giữ giống - Phương pháp định danh vi sinh vật (PP kỹ thu? ??t sinh