1 VIN KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM VIN SINH THI V TI NGUYấN SINH VT NGUYN VN BC Nghiên cứu Phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza v xenlulaza gặp trong môi trờng đất khu vực vờn bách thảo - H Nội LUN VN THC S SINH HC Chuyờn ngnh: Vi sinh vt hc Mó s: 60 42 40 Ngi hng dn : TS. Li Vn Hũa H Ni - 2012 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Lại Văn Hòa. Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực có nguồn gốc rõ ràng. Tác giả luận văn Nguyễn Văn Bắc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 MụC LụC ặt vấn đề 1 Chơng 1: Tổng quan tài liệu 3 1.1. Vị trí của nấm trong sinh giới 3 1.2. Tính đa dạng của vi nấm 4 1.3. Vi nấm trong đất 5 1.4. Vai trò của vi nấm trong công nghiệp 7 1.5. Đặc tính đặc trng của vi nấm 8 1.6. Hệ thống phân loại vi nấm 9 1.6.1. Hệ thống phân loại của Robert Shaffer (1969) 9 1.6.2. Hệ thống của Ainsworth & Bisby (1995) 10 1.7. Những vấn đề chung về cơ chế sinh hoá và sự phá huỷ sinh học do vi nấm gây nên 12 1.7.1. Đặc điểm phá huỷ sinh học do vi nấm 12 1.7.2. Các chất trao đổi chuyển hoá xâm thực của sợi nấm - các loại enzym và các axít hữu cơ 13 1.8. Các phơng pháp bảo quản vi nấm 16 1.8.1. Nhóm phơng pháp tiếp tục duy trì sự phát triển 19 1.8.2. Nhóm phơng pháp làm khô 20 1.8.3. Nhóm phơng pháp làm đình chỉ trao đổi chất 22 1.9. Lựa chọn các phơng pháp bảo quản 25 1.10. Những nghiên cứu về phân loại và bảo quản vi nấm ở Việt Nam 26 Chơng 2: Đối tợng, vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 28 2.1. Đối tợng nghiên cứu 28 2.2. Vật liệu nghiên cứu 28 2.2.1. Dụng cụ, thit b 28 2.2.2. Môi trờng nuôi cấy 29 2.2.3. Hoá chất và các cơ chất sinh học 29 2.3. Phơng pháp và kỹ thuật nghiên cứu 30 2.3.1. Phơng pháp lấy mẫu 30 2.3.2. Phơng pháp phân lập 30 2.3.3. Phơng pháp phân loại vi nấm 30 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 2.3.4. Phơng pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi nấm 33 2.3.5. Phơng pháp bảo quản các chủng nấm sợi 34 2.3.6. Phơng pháp phục hồi 35 Chơng 3: Kết quả nghiên cứu 36 3.1. Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo 36 3.1.1. Thnh phn chng loi vi nấm trong đất vờn Bách Thảo 36 3.1.2. Đặc điểm phân loại hình thái của các chi vi nấm phân lập đợc 40 3.2. Lựa chọn các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân hủy cơ chất gelatin và xenluloza phân lập từ môi trờng khu vực vờn Bách Thảo đa vào bảo quản 57 3.3. Kết quả phục hồi của các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phân lập từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo Hà Nội sau khi bảo quản trong glyxerin 10%, -200C và trên silicagel 59 3.4. Khả sinh enzym phân huỷ cơ chất sinh học của các chủng nấm sợi phân lập đợc từ môi trờng đất vờn Bách Thảo sau bảo quản 18 tháng 66 Chơng 4: Bàn Luận 73 4.1. Phân lập, phân loại các chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo 73 4.2. Lựa chọn các chủng vi nấm có hoạt tính enzym phân huỷ 2 cơ chất sinh học (xenluloza, gelatin) để đa vào bảo quản 75 4.3. Bảo quản các chủng vi nấm có hoạt tính enzym đã đợc chọn bằng hai phơng pháp: lạnh sâu (glyxerin 10% ở -200C) và trên silicagel. 76 4.4. Khả năng sinh enzym phân huỷ các cơ chắt sinh học của các chủng nấm sợi phục hồi sau bảo quản 77 Chơng 5: Kết luận và kiến nghị 79 TàI LIệU THAM KHảO 81 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 C¸c ch÷ viÕt t¾t ATCC American Type Culture Colletion CCRC Culture Collection Research Center IMI International Mycological Institute LS Lạnh sâu SLC Silicagel TBQ Trước bảo quản SBQG Sau bảo quản glyxerin SBQS Sau bảo quản Silicagel DMSO Dimethyl sulfoxide Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 Đặt vấn đề Nm (Fungi) là mt gii sinh vt ph bin trong t nhiờn. Chúng có thể sinh trởng và phát triển ở khắp mọi nơi, trên mọi loại cơ chất với tốc độ phát triển nhanh, mạnh. Đa phn cỏc nm u khụng th nhỡn thy c bng mt thng, chỳng sng phn ln trong t, cht mựn, xỏc sinh vt cht, cng sinh hoc kớ sinh trờn c th ng thc vt v nm khỏc. Mt s loi nm cú th nhn thy c khi dng th qu, nh nm ln v nm mc. Ngi ta c tớnh gii nm cú khong 1,5 triu loi, khong 70.000 loi nm ó c cỏc nh phõn loi hc phỏt hin v miờu t, tuy nhiờn tớnh a dng ca gii Nm vn cũn l iu bớ n [29]. Cỏc loi nm hoi sinh úng vai trũ quan trng trong chu trỡnh tun hon vt cht v nng lng trong t nhiờn. Nm cú th phõn gii cỏc cht hu c phc tp thnh cỏc cht n gin, c bit l cỏc cht khú phõn gii nh xenluloza, ligin thnh cht vụ c. Do ú, nú l yu t quan trng lm tng phỡ nhiờu ca t. Nm cú ý ngha rt quan trng trong i sng ca con ngi, chỳng cú vai trũ thc tin trong kinh t, khoa hc v cỏc chu trỡnh vt cht, n ng lng trong t nhiờn [30]. Nhiu loi nm c s dng trong cụng ngh thc phm, s dng lm thc n hoc cỏc sn phm ca quỏ trỡnh lờn men Tuy nhiờn, bờn cnh nhng li ớch to ln ú, nhiu loi nm li gõy bnh cho ngi, ng thc vt [32]. ó cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v khu h vi nm trong mụi trng khụng khớ t nhiờn, trờn cỏc sn phm cụng-nụng nghip khỏc nhau, trong dc phm, trong t, nhng vi s lng cha nhiu. nc ta, khớ hu nhit i m rt thớch hp cho s phỏt trin ca nhiu loi vi nm, chỳng phong phỳ c v s lng v thnh phn chng loi. gúp phn kho sỏt s a dng v thnh phn chng loi, c tớnh sinh hc v tỡm kim cỏc chng vi nm mi cha c phỏt hin Vit Nam núi chung v mụi trng t núi riờng, trong lun vn ny chúng tôi tin hnh Nghiên cứu phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và xenlulaza gặp trong môi trờng đất khu vực Vờn Bỏch tho-H Ni. S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 Mc tiờu ca chỳng tụi a ra l: 1. Phõn lp, phõn loi mt s chng nm si cú hot tớnh gelainaza v xenlulaza gp trong mụi trng t khu vc Vn Bỏch tho-H Ni 2. Bảo quản các chủng vi nấm đã phân lập đợc bằng một số phơng pháp bảo quản hiện nay 3. Góp phần xây dựng bộ su tập các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ cho các nghiên cứu và vào bộ su tập giống của Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các chủng nấm sợi từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo 2. Phân loại xác định đến chi, loài các chủng nấm sợi đã phân lập đợc. 3. Xác định hoạt tính enzym phân huỷ một số cơ chất sinh học nh gelatin, xenluloza của các chủng nấm sợi đã phân lập và phân loại. 4. Bảo quản các loài nấm sợi có hoạt tính enzym cao bằng phơng pháp silicagel và bảo quản trong glyxerin 10% ở nhiệt độ -20 0 C. 5. Phục hồi các chủng vi nấm đã bảo quản sau 18 tháng, kiểm tra độ thuần khiết, độ sống sót, độ ổn định về hình thái và khả năng sinh enzym phân huỷ cơ chất sinh học của chúng. 6. Xây dựng bộ su tập các chủng nấm sợi có hoạt tính enzym phục vụ cho các nghiên cứu và góp phần vào bộ su tập giống của Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam. S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chơng 1 Tổng quan ti liệu 1.1. Vị trí của nấm trong sinh giới Trớc đây, nấm đợc xếp vào một ngành (Mycota) của dới giới thực vật bậc thấp. Hiện nay nấm không còn đợc xem là một ngành của dới giới thực vật bậc thấp, mà nấm là một giới riêng biệt trong thế giới sinh vật. Theo Takhtajan (1973): Không có cơ sở nào đáng kể để xếp nấm vào thực vật. Vi nấm có hàng loạt các đặc điểm riêng biệt sau õy: - Dinh dỡng: Nấm không dinh dỡng theo kiểu quang hợp nh thực vật hoặc bằng kiểu nuốt thức ăn nh động vật. Nấm dị dỡng bằng cách hấp thụ hay thẩm thấu. Nấm hấp phụ các chất dinh dỡng bằng cách tiết ra ngoài môi trờng cỏc enzym để phân giải các chất có cấu trúc phức tạp thành nhng chất có cấu trúc đơn giản sau đó hấp phụ qua màng. - Cấu trúc tế bào: Các nấm thật (Eumycota) có thành phần hoá học của vách tế bào là kitin (thực vật có vách tế bào là xenluloza). - Sinh hoá: Chất dự trữ của nấm là glycogen giống nh ở động vật cũn thực vật có chất dự trữ là tinh bột. Ngoài ra, nấm còn hình thành các sản phẩm giống với động vật nh các axớt amin. - Phơng thức sống: Nấm dị dỡng bằng cách hấp thụ, động vật dị dỡng bằng cách nuốt thức ăn, thực vật dị dỡng bằng cách quang hợp. - Cá thể phát sinh: Trong quá trình phát triển cá thể các nấm tiến hoá cao thì có giai đoạn song hạch ( nm tỳi và nm m), giai đoạn song hạch không có ở các sinh vật khác. - Cơ thể dinh dỡng: Sợi phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm, nhng thực vật có cơ thể dinh d ỡng dạng cây có rễ, thân, lá. - Sinh sản: Nấm sinh sản và phát tán bằng bào tử. S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Nhờ những thành tựu nghiên cứu v cấu trúc nhân, màng tế bào, ty thể, cấu trúc phân tử ARN riboxom; thành phần sinh hoá; phơng thức dinh dỡng thì gianh giới giữa động vật và thực vật bị mờ đi, mà rõ nét là gianh giới giữa sinh vật không nhân và sinh vật có nhân. Hiện nay, có nhiều quan điểm khác nhau về việc xếp các ngành nấm vào các giới sinh vật. Theo hệ thống 5 giới của Whittaker (1978) thì các ngành nấm đợc xếp vào 2 giới khác nhau: Các ngành nấm nhầy tế bào (Acrasiomycota), nấm nhầy thật (Myxomycota), nấm trứng (Oomycota) và nấm cổ (Chytridiomycota) đợc xếp vào giới Protoctista; các ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota), nấm túi (Ascomycota), nấm đảm (Basidiomycota), nấm bất toàn (Deuteromycota) và địa y (Lichenomycota) đợc xếp vào giới nấm. Theo Whittaker giới nấm chỉ gồm 2 ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota) và ngành nấm thật (Eumycota), trong dó ngành nấm thật bao gồm 4 phân ngành: nấm túi (Ascomycotina), nấm đảm (Basidiomycotina), nấm bất toàn (Deuteromycotina) và địa y ( Lichenes). Ngoài ra còn có một số hệ thống khác nh hệ thống 6 giới của Lucile Mc Cook (năm 2004), hệ thống 7 giới của Bryce Kendrick (2001). 1.2. Tính đa dạng của vi nấm Vi nấm có khả năng phát triển ở hầu hết các dạng sinh thái, có thể sử dụng hầu hết các sản phẩm tự nhiên và các sản phẩm do con ngời làm ra. Chúng là sinh vật đầu tiên và lý tởng sinh trởng ở vùng hoang dã, vì chúng có khả năng thay đổi để thích nghi với điều kiện sống. Ví dụ, các loài của chi Aureobasidium có thể sinh trởng ở nơi nhiệt độ thấp (vùng Antarctica) trên các hòn đá ở nhiệt độ từ -10 0 đến -20 0 , có thể chống chịu ở nhiệt độ thấp từ - 70 0 C đến -80 0 C. Nhng chi này cũng có những loài có thể sinh trởng ở vùng nhiệt đới. Phần lớn các vi nấm là hiếu khí và sinh trởng ở mụi trng cú hoạt độ nớc cao. Nhng ngời ta đã phát hiện đợc vi nấm kỵ khí ở dạ cỏ của cừu (Yarlett và CS, 1986) và cũng đã phát hiện đợc nhiều loài sinh trởng đợc ở S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 các cơ chất có hoạt độ nớc thấp (aw <1). Mt nhúm loi nm mc c trng, ỏng chỳ ý l nhúm loi nm mc a khụ, gm cỏc loi cú kh nng tng trng trờn sn phm cú hot nc thp, chỳng phỏt trin c trong cỏc iu kin mụi trng khụ lnh, trờn cỏc sn phm sy khụ, cụ c hoc p mui, p ng. Nhúm loi nm mc c trng ny gm mt s loi thuc cỏc chi Nm b t ton ( Deuteromycotina, Fungi imperfecti) nh Aspergillus, Chrysosporium, Cladosporium, v Nm tỳi nh Eurotium, Eremascus, Cỏc loi A. Restrictus, E. Rubrum, E. Amstelodami, Wallemia sebi, gp c cỏc phũng bo qun cú nhit 16 1 0 C v m tng i ca khụng khớ 70 2% [1]. Năm 1991, Viện nấm quốc tế (IMI) đã đa ra danh sách các vật chủ và cơ chất có thể phân lập nấm. Chúng ta có thể phân lập nấm sống ký sinh, cộng sinh hoặc gây bệnh cho tảo, rêu, thực vật và các loài nấm khác (bao gồm cả địa y), động vật chân đốt, các động vật không xơng sống và có xơng sống. Không khí, đất, nớc, phân, thức ăn, các sản phẩm thực vật, dầu khí và mt s dợc phẩm cũng là nguồn phân lập c vi nấm. 1.3. Vi nấm trong đất Vi nấm là thành phần nhiều nhất trong sinh khối của hệ vi sinh vật trong đất, mặc dù số lợng của chúng trong các đĩa môi trờng pha loãng khi phân lập thấp hơn vi khuẩn. Nm cú ý ngha rt quan trng trong i sng ca con ngi, chỳng cú vai trũ thc tin trong nn kinh t, khoa hc v cỏc chu trỡnh vt cht, nng lng trong t nhiờn. Vi nấm là vi sinh vật gây mục nát chính trong đất, đặc biệt là đất rừng, chỳng phõn gii cỏc cht hu c, cỏc cnh lỏ khụ ca thc vt thnh cht mựn, cht khoỏng. Nó tham gia phân huỷ xenluloza, kitin và licnin trong lớp đất bề mặt, do ú l yu t quan trng lm tng phỡ nhiờu ca t. Nấm đất bao gồm các loài thuộc lớp: Zygomycetes, Ascomycetes, Deutermycetes, Basidiomycetes và một vài loài thuộc họ Pythiaceae của lớp Oomycetes. Hầu hết chúng sống hoại sinh, một số sống ký S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... dạng sợi sống ở trong đất rất khó phân lập bằng các kỹ thuật cơ bản Chúng sống cộng sinh đặc hiệu với cây rừng (nấm rễ - ectomycorrhizal), hoặc sống hoại sinh phân huỷ gỗ, rác Một số vi nấm có bào tử động thờng sống trong nớc có thể có mặt trong đất, chúng đợc nghiên cứu bằng các kỹ thuật đặc biệt Nấm tồn tại trong đất ở dạng sợi, bào tử (vô tính hoặc hữu tính) , bào tử áo hoặc các thể hạch nấm Chỉ có. .. phơng pháp bảo quản vi nấm Nghiên cứu vi nấm là bao gồm cả quá trình nghiên cứu và sử dụng những chủng vi nấm ú Chúng cần đợc giữ tồn tại ít nhất là trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu hay làm thực nghiệm và nếu chúng chứng minh đợc sự quan trọng của mình, chúng có thể đợc bảo quản để thực hiện các công việc khác trong tơng lai và đợc đa vào trong một bảo tàng nguồn vi sinh vật để đảm bảo sự ổn... hạch nấm và các giai đoạn nghỉ ngơi khác kể cả những hệ sợi nấm bất thụ cũng tồn tại đợc bằng phơng pháp bảo quản đông khô Những nghiên cứu tại IMI cho thấy đối với một số vi sinh vật, thời gian sống đợc trong bảo quản là rất ngắn Việc sử dụng các phơng pháp tốt nhất để có thể bảo quản và duy trì ổn định gen của những chủng rất khó phân lập là rất cần thiết Nhiều bộ su tập vi nấm khác cũng đợc bảo quản. .. http://www.lrc-tnu.edu.vn 25 1978) đã đợc bảo quản thành công bằng kỹ thuật bảo quản lạnh trong nitơ lỏng 9 chủng của loài Sclerospora và một chủng của Bremia lactucae đợc bảo quản tại IMI là các loài gây bệnh trên mô vật chủ và vẫn giữ đợc khả năng gây bệnh sau 1 năm bảo quản Các nấm gây bệnh trên thực vật sống sót và vẫn giữ đợc khả năng gây nhiễm của chúng Bảo quản trong ống đông lạnh trong từng ngăn một cho phép dễ dàng... nhắc về giá thành, độ sống sót và ổn định về di truyền của các chủng Mỗi một chủng nên bảo quản tối thiểu bằng 2 phơng pháp - Làm đông lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng là kỹ thuật tốt nhất đối với bảo quản nấm sợi Các kỹ thuật làm bằng tay, quy trình đông lạnh, các chất bảo quản, tốc độ tan băng đối với từng loài nấm riêng biệt là khác nhau, phải chọn để thu đợc độ sống sót cao nhất trong bảo quản Khi... có giai đoạn sợi mới có các hoạt động trao đổi chất đáng kể, các giai đoạn sau là giai đoạn ngủ phục hồi cấu trúc, khi ú hoạt động trao đổi chất ít và có tầm quan trọng hạn chế trong việc chuyển hoá đất Nấm sống trong đất hầu hết ở trạng thái ngủ Để phân tích nấm đất cần có các hiểu biết về sinh thái học để phân biệt giữa dạng sợi và trạng thái nghỉ của chúng Kỹ thuật phân lập nm trong đất bao gồm:... đợc phân loại và có tên trong danh mục của hệ thống phân loại Chúng ta cần phân loại chính xác một chủng khi s dng chủng loài đó để nghiên cứu hoặc sản xuất vì nếu phân loại sai có thể dẫn tới những kết luận sai trong nghiên cứu và có thể bỏ phí những nguồn giống có giá trị [27] 1.7 Những vấn đề chung về cơ chế sinh hoá và sự phá huỷ sinh học do vi nấm gây nên 1.7.1 Đặc điểm phá huỷ sinh học do vi nấm. .. (Booth, 1971) Mặc dù vậy, đối với Fusarium và các loài nấm khác hay bị biến đổi trong môi trờng dầu thì nên bảo quản trong đất hơn là bảo quản trong dầu 1.8.2.3 Đông khô Kỹ thuật này là một phơng pháp đã đợc sử dụng để bảo quản các vật liệu sinh học và có thể gìn giữ đợc hình dạng, cấu trúc và hoạt tính của chúng Có 2 kỹ thuật đông khô, kỹ thuật đông khô ly tâm và kỹ thuật giá đông khô (đông khô trên... (Smith và Onion, 1983) Từ năm 1945, Raper và Alexander đã đa ra phơng pháp đông khô (Freeze drying) để bảo quản các loài Penicillium Buell & Weston (1947) đã bảo quản vi nấm trong dầu khoáng Castellani (1939, 1967) đã bảo quản vi nấm trong nớc Gordon (1952) Both (1953) đã bảo quản vi nấm trong đất Perkin (1962) đa ra phơng pháp bảo quản trên silicagel Năm 1971, 1977, Onions đã đa ra phơng pháp bảo quản. .. kiện môi trờng Trên cựng một cơ chất nhng ở các nhiệt độ khác nhau hoặc độ ẩm môi trờng cao hoặc thp hơn, thì một số loài vi nấm sẽ bị chết, còn một số loài khác thì sẽ phát triển tốt hơn Vi nấm là một nhóm vi sinh vật rất hay biến dị và không ổn định Một trong những cơ chế của tính biến dị ở vi nấm là tính dị nhân Tuỳ theo điều kiện môi trờng, số nhân của loài này hay loài khác có thể thay đổi trong sợi . NGUYN VN BC Nghiên cứu Phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza v xenlulaza gặp trong môi trờng đất khu vực vờn bách thảo - H Nội LUN VN. trng t núi riờng, trong lun vn ny chúng tôi tin hnh Nghiên cứu phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nấm sợi có hoạt tính gelatinaza và xenlulaza gặp trong môi trờng đất khu vực Vờn Bỏch tho-H. của các chủng nấm sợi phân lập đợc từ môi trờng đất vờn Bách Thảo sau bảo quản 18 tháng 66 Chơng 4: Bàn Luận 73 4.1. Phân lập, phân loại các chủng vi nấm từ môi trờng đất khu vực vờn Bách Thảo